基因工程知識點超全

1、基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的額，因此又叫做DNA重組技術(shù)?；蚬こ痰膭e名基因拼接技術(shù)或 DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切t拼接t導(dǎo)入t表達實質(zhì)（原理）基因重組結(jié)果改造的方向克服遠緣雜交不親和的障礙，疋向改造生物的遺傳特性二、基因工程的基本工具1、限制性核酸切酶-“分子手術(shù)刀”2、DNA連接酶-“分子縫合針”3、基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”1 “

2、分子手術(shù)刀”一一限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）1 ）存在：主要存在于原核生物中。word專業(yè)資料（2 ）特性：特異性，一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在(5) 識別序列的特點:呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是奇數(shù)個械基還是儉數(shù)個鹹基. 都可以找到一條中心軸線曲圖沖軸線兩側(cè)的雙鏈DNAcc匕的破基是反向?qū)ΨQ藪排列的。如CGCCCG以中心線為軸倆fi!懂基互補對執(zhí)CCAGG A以為縱兩億戚基互補GGTCC T對稱Q(6 )切割后末端的種類:DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式 一- 在它識別序列的 條鏈分別切開時,黏性末端和平末端 。當(dāng)限制酶中軸線兩側(cè)將 DNA 的兩產(chǎn)生的是

3、黏性末端，而當(dāng)限制酶在它識別序列的中軸線處切開時，產(chǎn)生的則是平末端。1 OA A t TTC：<a! AA<i之fUl切害UtocrrrA aAAriTr<:S m a1(在 龍間切制CCLC : oooIcoo i uccI中軸空CCCGGGOGGWC平木駒切割 nz挖分子日寸產(chǎn)斗片阿科不司 木軸 (飾力衣示禪旳切制侍檸2 .“分子縫合針” 一一 DNA連接酶(1 )作用：將限制酶切割下來的 DNA片段拼接成DNA分子。(2)類型種類Ecoli DNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T 4噬菌體功能特性只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來縫合兩種末端

4、，但 連接平末端之間的 效率較低相同點：都連接磷酸二酯鍵G' A A T T CI I I I I3 “分子運輸車”一一載體(1) 載體具備的條件： 能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。 具有一個至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。 具有標(biāo)記基因，供重組 DNA的鑒定和選擇。(2) 最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌擬核之外，并具有自我復(fù)制 能力的雙鏈環(huán)狀 DNA分子。(3) 其他載體:入噬菌體的衍生物、動植物病毒。載體的作用： 作為運載工具，將目的基因送入受體細胞。 在受體細胞對目的基因進行大量復(fù)制?！窘忸}技巧】(1) 限制酶是一類酶，而不是一種酶。(2) 限制

5、酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強酸或強堿均易使之變性 失活。在切割目的基因和載體時要求用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。(4) 獲取一個目的基因需限制酶剪切兩次，共產(chǎn)生 4個黏性末端或平末端。不同DNA 分子用同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。(6) 限制酶切割位點應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便于進行檢測。(7) 基因工程中的載體與細胞膜上物質(zhì)運輸?shù)妮d體不同。基因工程中的載體是DNA 分子，能將目的基因?qū)胧荏w細胞；膜載體是蛋白質(zhì)，與細胞膜的通透性有關(guān)。(8) 基因工程中有3種工具，

6、但工具酶只有 2種。例1 .限制酶Mun I和限制酶EcoR I的識別序列及切割位點分別是一C 3ATTG 和一G JAATTC 。如圖表示四種質(zhì)粒和目的基因，其中，箭頭所指部位為限制酶的識別位點，質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是()目的基因CTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCA禽i的叢岡的DNAJJ段MuniBCD*EcoR限制酶的應(yīng)用特點（1）在獲取目的基因和切割載體時通常用同種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但是如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。（2） 為了防止載體或目的基因的黏性末端

7、自己連接，可用不同的限制酶分別處理目的基因和載體, 使目的基因兩側(cè)及載體上具有兩個不同的黏性末端五種酶的比較作用底物作用部位形成產(chǎn)物限制性切酶DNA分子磷酸二酯鍵黏性末端或平末端DNA連接酶DNA片段磷酸二酯鍵重組DNA分子DNA聚合酶脫氧核苷酸磷酸二酯鍵子代DNADNA解旋酶DNA分子堿基對間的氫鍵脫氧核苷酸單鏈RNA聚合酶核糖核苷酸磷酸二酯鍵核糖核苷酸單鏈三、基因工程的操作步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定1、目的基因的獲取獲取目的基因的方法：（1 ）直接分離法從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA短片段，導(dǎo)入

8、受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。包括基因組文庫和cDNA文庫。直接從基因組中獲取目的基因最常用的方法是：“鳥槍法”。（2）人工合成法化學(xué)合成法：片段較小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成儀用化學(xué)方法合成，不需要模板。反轉(zhuǎn)錄法：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成目的基因DNA （ cDNA ）。（4）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR技術(shù)：是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。 由于PCR過程在高溫下進行,因此需要使用熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶。目的：通過指數(shù)式擴增獲取大量的目的基因前提：要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成

9、引物。2 基因表達載體的構(gòu)建一一基因工程的核心目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。芮芋3 RNA聚合酚識別和結(jié)合部付予基因表達J 載體組成驅(qū)動轉(zhuǎn)錄mRNA終止子：使轉(zhuǎn)錄終止的特殊結(jié)構(gòu)的DNA 片段標(biāo)記基因：為鑒定受體細胞是否含有目的ffll-10美園表達裁怵棋式圖DNA連接酹、載體（質(zhì)?！?DN A分子， 一種限制性核酸內(nèi)切酶*A一個切口兩個切口，兩個黏性末端獲取目的基腳V重組DNA分子（審組質(zhì)粒）3 將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因進入受體細胞， 并且在受體細胞維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵是目的基因整合到受體細胞染色體基因

10、組中。生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細胞法受體細胞體細胞受精卵原核細胞金榜 P1854 目的基因的檢測與鑒定轉(zhuǎn)將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T 將含有目的基因的表達載體Ca2 +處理細胞t感受態(tài)細化DNA上t農(nóng)桿菌t導(dǎo)入植物細胞提純T取卵（受精卵）T顯微胞t重組表達載體與感受態(tài)過宀整合到受體細胞的染色體DNA注射T受精卵發(fā)育T獲得具細胞混合T感受態(tài)細胞吸收程上t表達有新性狀的動物DNA分子誤區(qū)警示標(biāo)記基因的作用一一篩選、檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞，常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因（表達產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì)）等。受體細胞常用植物受精卵或體細胞（經(jīng)組織培養(yǎng)）、

11、動物受精卵（一般不用體細胞）、微生物（大腸桿菌、酵母菌）等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物酵母菌（需質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌）；一般不用支原體，原因是它營寄生生活；一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞， 原因是它無細胞核，不能合成蛋白質(zhì)。（3）基因表達載體中，啟動子 （DNA 片段）工起始密碼子（RNA）;終止子（DNA 片段）工終止密碼子 （RNA）。基因表達載體的構(gòu)建是最核心、最關(guān)鍵的一步，在體外進行。目的基因與載體的連接方式有多種，如目的基因目的基因、目的基因載體、載體載體等。例3.下列有關(guān)基因工程操作的敘述中，正確的是（）AA 用同種限制酶切割載體與目的基因可獲得相同的黏

12、性末端B 以蛋白質(zhì)的氨基酸序列為依據(jù)合成的目的基因與原基因的堿基序列相同C.檢測到受體細胞含有目的基因就標(biāo)志著基因工程操作的成功D 用含抗生素抗性基因的質(zhì)粒作為載體是因為其抗性基因便于與外源基因連接例4 金榜P187 T2四、基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程1 乳腺生物反應(yīng)器與工程菌生產(chǎn)藥物的比較（1）含義： 乳腺生物反應(yīng)器是指將外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白。 工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系。兩者區(qū)別：比較項目乳腺生物反應(yīng)器工程菌動物基因的結(jié)構(gòu)與人類基細菌或酵母菌等生物基因的結(jié)構(gòu)與人基因結(jié)構(gòu)因的結(jié)構(gòu)基本相同類基因的結(jié)構(gòu)有較大差異

13、基因表達合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同細菌細胞沒有質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器，產(chǎn)生的藥物蛋白可能沒有活性受體細胞動物的受精卵微生物細胞導(dǎo)入目的基因的方式顯微注射法.感受態(tài)細胞法生產(chǎn)條件不需嚴格滅菌，溫度等外界條件對其影響不大需嚴格火菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH 、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等外界條件藥物提取從動物乳汁中提取從微生物細胞中提取2 .蛋白質(zhì)工程與基因工程的比較（金榜P189 ）區(qū)別與聯(lián)系蛋白質(zhì)工程基因工程預(yù)期蛋白質(zhì)功能一設(shè)獲取目的基因f構(gòu)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建基因表達載體f過程推測應(yīng)有的氨基酸將目的基因?qū)胧苄蛄姓业较鄬?yīng)的體細胞f目的基因word專業(yè)資:脫氧核苷酸序列料的檢測與鑒定實質(zhì)定向改造

14、或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì)定向改造生物的遺傳特 性，以獲得人類所需的 生物類型或生物產(chǎn)品結(jié)果可生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質(zhì)只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上延伸出來聯(lián)系的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質(zhì)工程進行修飾、改造蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。3、 基因工程的應(yīng)用：金榜P1894、基因治療：（1 ）概念：指利用正?；蛑脫Q或彌補缺陷基因的治療方法。（2 ）方法：基因置換、基因修復(fù)、基因增補、基因失活等。如：腺苷酸脫氨酶（ADA

15、 ）基因缺陷癥的基因治療。（3 ）基因治療的途徑體外基因治療：先從病人的體獲得某種細胞進行培養(yǎng)，然后在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細胞擴增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體。如腺苷酸脫氨酶基因的轉(zhuǎn)移。體基因治療：用基因工程的方法，直接向人體組織細胞中轉(zhuǎn)移基因的治病方法。5、基因診斷(1 )概念：又稱 DNA診斷，是采用基因檢測的方法來判斷患者是否出現(xiàn)了基因異?；驍y帶病原 體。(2) 方法：DNA分子雜交技術(shù)。它的基因原理是： 互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠雜交，這種結(jié)合是特異的，即嚴格按照堿基互補配對的原則進行。當(dāng)用一段已知基因的單鏈作探針(常用同位素、熒光分子等進行標(biāo)記)，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的堿基完成配對，互補地結(jié)合成雙鏈，表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。誤區(qū)警示(1) 基因治療后，缺陷基因沒有改變?；蛑委熓前颜；?qū)胧荏w細胞中，以表達正常產(chǎn)物從而治療疾病，對原來細胞中存在缺陷的基因沒有清除或改變。(2) 對蛋白質(zhì)分子進行改造，其本質(zhì)是改變其基因組成。如果對蛋白質(zhì)直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳。(3) DNA分子作探針進行檢測時應(yīng)檢測單鏈，即將待測雙鏈DNA分子