林蛙抗菌肽基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)條件的優(yōu)化

1、項(xiàng)目編號：KFJJ-大學(xué)生開放性實(shí)驗(yàn)基金項(xiàng)目申 請 書項(xiàng)目名稱：林蛙抗菌肽基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)條件的優(yōu)化申 請 人：汪 林所在院系：生命科學(xué)學(xué)院指導(dǎo)教師：李 治聯(lián)系電話：88038248申報時間：2008年6月填 表 須 知 一、陜西師范大學(xué)大學(xué)生開放性實(shí)驗(yàn)基金項(xiàng)目申請表要按順序逐項(xiàng)填寫，內(nèi)容要實(shí)事求是，表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)?？杖表?xiàng)要填“無”。要求一律用A4紙打印，于左側(cè)裝訂成冊。 二、申請參加陜西師范大學(xué)大學(xué)生開放性實(shí)驗(yàn)基金項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)人數(shù)不得超過5人（1人為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，項(xiàng)目參與者1-4人）。三、陜西師范大學(xué)大學(xué)生開放性實(shí)驗(yàn)基金項(xiàng)目申請表由申報學(xué)生所在學(xué)院初審，簽署意見后，一式三份（均為原件

2、），報送實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與管理處。四、如填表有不明事宜，請與實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與管理處聯(lián)系和咨詢。（聯(lián)系電話：85310378）一、基本情況項(xiàng)目名稱林蛙抗菌肽基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)條件的優(yōu)化項(xiàng)目來源自擬課題 綜合設(shè)計(jì) 科學(xué)研究 計(jì)算機(jī)應(yīng)用 人文素質(zhì)起止時間2008年6月至2009年6月申請人姓名學(xué)院、專業(yè)、年級學(xué)號項(xiàng)目中的分工聯(lián)系電話簽 名負(fù)責(zé)人汪林生科院05級生物基地班40508047參與所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)目參加人岑文生科院06級生物技術(shù)班40608217參與所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)川生科院06級生物技術(shù)班40608216參與所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)小玉生科

3、院06級生物基地班40608180參與所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)導(dǎo)教師姓名學(xué)院職稱研究方向聯(lián)系電話簽 名李治生科院副教授抗菌肽功能及應(yīng)用88038248項(xiàng)目所依托的實(shí)驗(yàn)室分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室摘要（不超過300字）：抗菌肽具有廣譜抗菌、抗病毒、抗癌能力，是理想的抗生素替代品。蛙類的皮膚分泌液含有大量的抗菌肽類物質(zhì)，目前已經(jīng)分離的蛙類抗菌肽超過數(shù)百種。然而直接從蛙類提取純化抗菌肽存在多方面問題。如，從蛙類皮膚分類純化抗菌肽工藝繁瑣費(fèi)時、產(chǎn)量??；從蛙類皮膚提取抗菌肽必然需要處死蛙，這樣對物種保護(hù)、環(huán)境保護(hù)等也會造成不好的影響。因此，本項(xiàng)目擬在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以基因工程技術(shù)構(gòu)建含有林蛙抗菌肽基

4、因的原核表達(dá)載體，于體外表達(dá)抗菌肽；并優(yōu)化原核系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽的條件，期望可以通過體外表達(dá)的方式大量合成抗菌肽，為后期抗菌肽的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。二、申請書正文1、立項(xiàng)依據(jù)（研究項(xiàng)目的意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、和發(fā)展動態(tài)）研究意義：抗菌肽是由10-50個氨基酸殘基組成，常帶正電荷。其分子量小，理化性質(zhì)穩(wěn)定、水溶性好、熱穩(wěn)定性好，同時具有廣譜抗菌、抗病毒、抗癌能力，并具有活性濃度低、無致畸變作用、無蓄積毒性、不易引起病原產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，而且作為生物體的天然綠色產(chǎn)物，是理想的抗生素替代品。兩棲類動物皮膚長期裸露，在自然選擇的過程中，為抵御有害環(huán)境因子侵襲逐漸形成了一系列保護(hù)機(jī)制，即它們的皮膚分泌液含

5、有大量的殺菌和防御天敵的抗菌肽類物質(zhì)；目前已經(jīng)分離的兩棲類抗菌肽超過數(shù)百種。然而，直接以蛙類作為提取純化抗菌肽的來源，存在多方面問題。如，從蛙類皮膚分類純化抗菌肽存在工藝繁瑣費(fèi)時、產(chǎn)量小的問題；從蛙類皮膚提取抗菌肽必然需要處死蛙，這樣對物種保護(hù)、環(huán)境保護(hù)等也會造成不好的影響。因此，本項(xiàng)目擬在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以基因工程技術(shù)構(gòu)建含有林蛙抗菌肽基因的原核表達(dá)載體，于體外表達(dá)抗菌肽；并優(yōu)化原核系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽的條件，期望可以通過體外表達(dá)的方式大量合成抗菌肽，為后期抗菌肽的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)：1970年，Csordas等在研究歐洲鈴蟾皮膚分泌物中的向性細(xì)胞性物質(zhì)時發(fā)現(xiàn)了第一個具有溶血

6、作用的蛙皮抗菌肽Bombinin；1987年，Zasloff從非洲爪蟾的皮膚分泌物中提取得到magainin蛙皮抗菌肽。迄今為止，國內(nèi)外對蛙類分泌物中生物活性肽的研究有四十多年歷史，涉及500多種蛙類。所分離的抗菌肽按照其結(jié)構(gòu)特征可以分為多個家族，主要有Magainin、Bombsnin、Bombinin-like、Brevinin、Eseulentin、Ranatuerin、Temporin、Ranalexin、Aurein、Caerin和Citropin家族等。目前對兩棲類抗菌肽的功能研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽不僅具有抗菌（包括細(xì)菌和真菌）活性，很多抗菌肽還有抗腫瘤活性、抗病毒活性、抗原蟲活性、抗精

7、子作用及溶血作用等。目前，隨著對蛙皮多肽分子結(jié)構(gòu)與生物功能研究的不斷深入，已將其應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。國內(nèi)許多學(xué)者都對其所在地區(qū)的特有兩棲類種屬進(jìn)行了大量的研究，其中比較突出的是對云南臭蛙屬以及長白山林蛙的研究。目前尚未有研究者對我省秦嶺山區(qū)分別的中國林蛙進(jìn)行抗菌肽方面的研究工作。分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在前期的工作中，從秦嶺林蛙皮膚中分離、克隆了數(shù)個抗菌肽基因，經(jīng)過分析比較，均為未報道的新基因。本實(shí)驗(yàn)在前期基礎(chǔ)上，擬研究新抗菌肽基因的表達(dá)特征。2、項(xiàng)目的主要內(nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)、擬解決的關(guān)鍵問題主要內(nèi)容：以基因工程技術(shù)構(gòu)建含有林蛙抗菌肽基因的原核表達(dá)載體，于體外表達(dá)抗菌肽；并優(yōu)化原核系統(tǒng)表達(dá)抗

8、菌肽的條件，期望可以通過體外表達(dá)的方式大量合成抗菌肽，為后期抗菌肽的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。創(chuàng)新點(diǎn)：本實(shí)驗(yàn)擬表達(dá)的林蛙抗菌肽基因?yàn)榉肿游⑸飳?shí)驗(yàn)室獲得的一個新基因，從未有其他研究報道。擬解決問題：通過實(shí)驗(yàn)研究優(yōu)化抗菌肽體外表達(dá)的條件，為后期抗菌肽的開發(fā)利用積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并提供技術(shù)支持。3、研究方案（技術(shù)路線）及可行性分析研究方案：第一部分：原核表達(dá)載體的構(gòu)建1) 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)已克隆的林蛙抗菌肽基因(lw-3)設(shè)計(jì)引物2) 原核表達(dá)載體制備：提取質(zhì)粒(pGEX-6p-1)，進(jìn)行酶切得到載體3) 目的基因的獲得：提取含有l(wèi)w-3基因的克隆載體質(zhì)粒，以其為模板，用1）中設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，酶

9、切獲得插入片段4) 連接和轉(zhuǎn)化：將純化回收插入片段和載體，在T4噬菌體連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞HB1015) 陽性克隆的篩選：將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含抗生素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行抗性篩選；再以菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切兩種方法對克隆進(jìn)行的進(jìn)一步鑒定6) 測序：對陽性克隆進(jìn)行序列測定第二部分：原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)1） 構(gòu)建表達(dá)菌株：將確定的原核表達(dá)載體pGEX6p1-lw3轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21中2） 誘導(dǎo)表達(dá)：將表達(dá)菌株接種培養(yǎng)至OD6000.6時，用IPTG誘導(dǎo)lw-3基因表達(dá)；表達(dá)4hr后收集表達(dá)產(chǎn)物3） 表達(dá)產(chǎn)物檢測：將表達(dá)產(chǎn)物制備為蛋白質(zhì)電泳樣品，進(jìn)行SDS-PAG

10、E電泳，檢測表達(dá)結(jié)果4） 表達(dá)條件優(yōu)化：分別優(yōu)化接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、IPTG濃度等因素，獲得最佳表達(dá)條件可行性分析：本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的微生物學(xué)、分子生物學(xué)及生物化學(xué)等相關(guān)學(xué)科的理論知識及技術(shù)方法我們都已經(jīng)學(xué)習(xí)了。本項(xiàng)目所依托的分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室也能夠提供研究所需的材料、試劑及相關(guān)儀器設(shè)備。相信在李治老師的指導(dǎo)下，我們可以完成相關(guān)的研究內(nèi)容。4、研究計(jì)劃2008年6月10月： 原核表達(dá)載體的構(gòu)建2008年10月： DNA測序 (送交上海生工公司完成)2008年11月2009年1月：原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)效果檢測2009年2月-4月： 表達(dá)條件的優(yōu)化2009年5月-6月： 整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，完成項(xiàng)目結(jié)題報告；論文寫作及投稿5、成果形式及預(yù)期結(jié)果獲得一個含有新抗菌肽基因的基因工程表達(dá)菌株發(fā)表論文1篇經(jīng)費(fèi)預(yù)算支出類別預(yù)算金額（元）主要用途實(shí)驗(yàn)耗材800實(shí)