大鼠彌漫性腦損傷后早期c-fos基因表達的法醫(yī)學(xué)研究

1、大鼠彌漫性腦損傷后早期c-fos基因表達的法醫(yī)學(xué)研究        【摘 要】 目的 觀察大鼠彌漫性腦損傷后cf0s基因表達的規(guī)律。方法采用marmarou的彌漫性腦損傷模型，分別于傷后15 min，30min，lh，3h，6h，12h，24h取腦組織，運用免疫組化sabc法觀察cfos基因的表達。結(jié)果 打擊后15 min時，即可觀察到cfos基因的表達，1 h后表達明顯增加，3 h達到高峰，隨著損傷時間的延長，陽性反應(yīng)細胞逐漸減少，24 h可見少量表達。表達呈彌漫性，以皮層、腦干最為明顯，不同部位的變化趨勢一致。

2、對照組未見陽性反應(yīng)細胞 結(jié)論cfos基因的表達規(guī)律可用于彌漫性腦損傷的早期鑒定及損傷經(jīng)過時間的推斷【關(guān)鍵詞】彌漫性腦損傷；cfos基因；免疫組織化學(xué)；嗜銀染色；損傷經(jīng)過時間【中圖分類號】r36【文獻標(biāo)識碼】a【文章編號】10079297(2005)01004203study on the expression of c-fos gene in the early stage of difuse brain injury in rats and its forensic implicationchen renhui，l1 yo ong，cheng libaodepartment offorens

3、ic pathology，wannan medical college， u 241001【abstract】0bjective to investigate the expression of cfos gene in diffuse brain injury(dbi)methods based onmarmarou s model of dbi and took the samples at 15min，30min，lh，3h，6h，12h，24h after brain injurythe expression of cf0sgene was observed by immunohist

4、ochemical sabc results rhe expression of c-fos gene could be detected at 15min afterinjury，increased at lh and peaked at 3hpositive cells decreased with the prolongation of injury timelittle expression wasf0und at 24h ihe expression of cfos gene was f0und in wide range but significant in cortex and

5、brain stem ihe chan gingtendency of diferent areas was same rhe control group showed negative staining conclusion rhe c-fos gene can diagn oseand date early dbi【key words】difuse brain injury；cfos gene；immunohistochemistry；silver staining；injury time腦損傷是法醫(yī)學(xué)鑒定中最常見的損傷，彌漫性腦損傷(diffuse brain injurydbi)作為閉

6、合性腦損傷的一種，多見于交通事故。cfos基因?qū)儆诩纯淘缁蚣易?immediate early gene，iegs)，在正常情況下參與神經(jīng)細胞的生長、發(fā)育、分化、記憶和信息傳遞過程，生理情況下不易被檢測到。當(dāng)神經(jīng)組織受到病理性刺激如腦缺血、外傷等作用后，cfos基因快速表達，02 因此被稱為快速反應(yīng)原癌基因。cfos基因表達是神經(jīng)組織受傷害的早期指標(biāo)。目前有關(guān)dbi后cfos基因表達的文獻很少，作者擬采用marmarou的彌漫性腦損傷模型31初步探討大鼠dbi后cfos基因表達的規(guī)律。材料與方法一、試驗動物健康雄性sd大鼠48只f南京青龍山實驗動物中心提供)，體重300320 g，隨機分成d

7、bi 15min、30min，1 h，3 h，6h，12h，24h組及及對照組，共8組。每組6只大鼠二、模型制作采用marmarou腦損傷模型，用1戊巴比妥         鈉腹腔注射(30 mgkg)，麻醉成功后，大鼠頭部做中線切口，暴露顱骨將直徑10 mm、厚3 mm的打擊墊片用高分子聚脂固定于顱頂?shù)墓跔羁p與人字縫之間的中央部然后將大鼠俯臥固定已知厚度及彈性系數(shù)的海綿床上，待動物開始蘇醒、有肢體活動時，移至一有機塑料管下端墊片正對管中央。450g鐵棒從2m高度自管內(nèi)自由墜落至打擊墊片上立即移開海綿床以免二次損傷

8、。三、組織處理及切片在設(shè)定的時間內(nèi)處死動物：將動物過量麻醉后，斷頭取腦打開顱骨后迅速用4多聚甲醛液預(yù)固定：【作者簡介】陳仁輝(1979一)，男，安徽寧國人，碩士，主要從事閉合性顱腦損傷的研究。聯(lián)系方式：+861 3855347401： email：wnmccrhhotmailcorn法律與醫(yī)學(xué)雜志2005年第12卷(第1期)取 大鼠全腦于4多聚甲醛液后固定12h沿大腦正中裂矢狀切開大腦、小腦、腦干，于正中切面左有外側(cè)3 mm處切取左有大腦皮質(zhì)、 腦以及腦干組織各l塊，分別做常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 m。分別作he染色、嗜銀染色及cfos免疫組織化學(xué)染色四、試劑及方法rabbit anticfos

9、：dab顯色試劑盒及sabc試劑盒(武漢博士德公司)，按說明書進行操作。f】pbs取代一抗、二抗作陰性對照，以細胞核fi現(xiàn)黃色產(chǎn)物為陽性結(jié)果。硝酸銀、氯化金、硫代硫酸鈉、飽和氨水，按gleesmarslands染色法進行五、圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理高倍視野fx400)下分別對大腦皮質(zhì)、丘腦以及腦干隨機選取5個視野依次計數(shù)每個視野內(nèi)陽性細胞數(shù)，以其平均值作為該切片層面的陽性細胞數(shù)，以同一動物6個切片層面的平均陽性細胞數(shù)作為該動物的陽性細胞數(shù) 各組動物再分別計算其組內(nèi)陽性細胞數(shù)。實驗數(shù)據(jù)采用spss 100統(tǒng)計軟件進行方差分析、檢驗。結(jié) 果一、大體及鏡下觀察實驗組可見蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦表面基本正常，無

10、大面積挫傷或局灶性挫裂傷灶。少數(shù)動物可見腦干有灶性出血、側(cè)腦室出血。未見腦組織局灶性病灶。鏡下可見神經(jīng)元胞體明顯腫脹，結(jié)構(gòu)不清核固縮，胞漿紅染加深神經(jīng)元損害主要分布于兩側(cè)大腦皮質(zhì)。膠質(zhì)細胞腫脹明顯。細胞周圍間質(zhì)水腫。嗜銀染色示軸索變粗、腫脹，呈串珠狀、波浪狀或螺旋狀改變(圖1)可見軸索斷端膨大呈球形改變。二、免疫組織化學(xué)染色dbi后15min即可觀察到陽性反應(yīng)細胞呈散存少量分布f圖2)。陽性產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于胞核內(nèi)，胞漿內(nèi)以及大的突起根部也有表達。1 h后表達明顯增加(圖3)，并于3 h達到高峰(圖4)。隨著損傷時間延長，陽性反應(yīng)細胞逐漸減少24h后可見少量表達。表達呈彌漫性以皮層、腦干最

11、為明顯，不同部位的變化趨勢一致 陽性反應(yīng)細胞包括神經(jīng)元及各類膠質(zhì)細胞 clos基因表達的陽性細胞數(shù)，見表l 正常對照組大腦皮質(zhì)、丘腦以及腦干未見陽性反應(yīng)細胞。討論彌漫性腦損傷(diffuse brain injury dbi)是一類常見的、后果嚴(yán)重的原發(fā)性腦損傷，具有較高的致殘率· 43 ·和病死率，在法醫(yī)學(xué)中較常見。一般認為dbi主要包括彌漫性軸索損傷、彌漫性腦腫脹、缺氧性腦損害、彌漫性血管損傷等4種基本類型。51 4種病理變化常可同時存在。本實驗采用marmarou的模型制作方法在鏡下可以觀察到神經(jīng)元腫脹，結(jié)構(gòu)不清，核固縮改變。細胞間質(zhì)水腫明顯。軸索增粗、腫脹，斷端可見

12、軸索球形成等。符合dbi的病理學(xué)改變，并且隨著損傷時間的延長，上述病理學(xué)改變逐漸加重原癌基因clos是fbj和fbr小鼠特發(fā)性骨肉瘤(msv)中病毒癌基因vlos的細胞同源物。clos原癌基大j高度保守，小鼠、大鼠與人的los同源性分別為97和94。人類的clos基因定位于第14號染色體(14q)61由35kb的dna片段組成，當(dāng)clos基因被激活后迅速轉(zhuǎn)錄mrna，然后進入胞質(zhì)在胞質(zhì)中合成cfos蛋白之后較快地進入胞核，稱為核磷酸蛋白，它由380個氨基酸組成其分子量為55kb，是dna結(jié)合蛋白cfos基因為神經(jīng)系統(tǒng)最常見的即刻早基因在外界刺激下數(shù)十分鐘內(nèi)cfos基因即開始表達，其表達產(chǎn)物cf

13、os蛋白與ciun基因的表達產(chǎn)物ciun蛋白通過“亮氨酸拉鏈”形成f0s-jun異源二聚體構(gòu)成ap一1轉(zhuǎn)錄因子，進一步激活目的基因的表達。7】cfos基因的表達在創(chuàng)傷的初始應(yīng)答與繼發(fā)性病理生理改變之間可能成為重要的中介f8如參與了細胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)、細胞凋亡及繼發(fā)性顱腦損傷等。本文應(yīng)用marmarou的彌漫性腦損傷模型研究了clos基因的表達情況。實驗顯示，打擊后15 min，腦皮層、腦干等部位中即出現(xiàn)clos基因的表達，1 h后表達明顯增加，3 h達到高峰，整個鼠腦組織中，包括腦皮層、皮層下、丘腦、腦干等區(qū)域均呈彌漫性表達，不同部位的變化趨勢一致，而后逐漸下降，24h后仍可見少量表達。關(guān)于腦創(chuàng)

14、傷后clos基因的表達機制據(jù)認為是通過谷氨酸n一甲基一d一天門冬氨酸受體(nmdar)介導(dǎo)的并隨著谷氨酸釋放增多而上升。i 9i谷氨酸的釋放激活神經(jīng)細胞膜nmda受體，使受體活化而介導(dǎo)clos基因的表達 另一種觀點認為神經(jīng)元中clos基因的表達是由leao播散性抑制(spreading depressionsd)所致。機械性損傷可以誘發(fā)sd，sd可將細胞外ca 轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，造成細胞外caz 濃度下降，引起皮層神經(jīng)元去極化。ca 內(nèi)流及神經(jīng)元去極化均可引起clos基因的表達。本實驗通過成功復(fù)制dbi動物模型運用he、神經(jīng)纖維特殊染色以及免疫組化技術(shù)，不僅說明dbi存在復(fù)雜的病理學(xué)改變同時clo

15、s 固表選的即時性1技fj問上的相對規(guī)律性也為我們早期鑒定dbi手u推斷其掘協(xié)彝過時間提供了參考，、女i1】morgan sgr 目#mg the regulation i ful：li-in ui dthor【e(：s in i vmmui neon 1990 4( ，7 s7l l lj i lp1 m，ilox,cla da el g pmb r 1iiilly indeedby dedolerkzati0n lw¨ j c b ·jj 皿1 f j 2002 1'1k287395 n_b m m a 肚w model ii dilttt brain1 lp蛆morl,oloweal ch n【 j n ，l994 f,：b：80(21：30i一313i4】“ 譯 + imj ：¨ mi 2 4j1 衄dim l¨¨ tk jl·1i f ji il in ¨rp法律 醫(yī)學(xué)雜 2005年第l2卷f第1期)aum4jl j n ld exp neuml 2 mj 641651嘲ba rke r pe rohim