精編湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)基因工程重點(diǎn),更具老師整理

1、1909年，丹麥生物學(xué)家，創(chuàng)造了基因（gene）詞1944年，美國(guó)著名微生物學(xué)家 O.T.Avery證明了基因的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA1953年，J.Watson和F.Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，揭示了 DNA的分子結(jié)構(gòu)特別是 DNA半保留復(fù)制規(guī)律。DNA的半保留復(fù)制復(fù)制子：由復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始合成的一段DNA序列。復(fù)制起點(diǎn)：在大腸桿菌中其復(fù)制起點(diǎn)由245個(gè)堿基對(duì)組成，由兩段保守的重復(fù)序列組成。1958 年，F(xiàn).Crick提出了描述DNA、RNA 和蛋白質(zhì)三者關(guān)系的所謂中心法則（cen traldogma）5.基因的表達(dá)與調(diào)控（操縱子學(xué)說(shuō)）基因依其功能差別可以分成調(diào)節(jié)基因、操縱基因和結(jié)構(gòu) 基因三大類

2、。一、基因工程的概念是指按照人們的科研或生產(chǎn)需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)（DNA片段），在體外切割、拼接形成重組DNA，然后將重組 DNA與載體的遺傳物質(zhì)重新組合，再將其引入到?jīng)]有該DNA的受體細(xì)胞，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出新性狀，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代。供體、受體和載體稱為基因工程的三大要素。技術(shù)上的三大發(fā)明：DNA分子的體外切割與連接技術(shù)、基因工程載體的使用、DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉(zhuǎn)移雜交等技術(shù)基因工程的主要研究?jī)?nèi)容或步驟分、從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。切、在體外

3、，用限制性內(nèi)切核酸酶切割目的基因和基因載體，以利于將兩者連接形成重組體接、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組 DNA分子。轉(zhuǎn)、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞），并與之一起增殖 篩、從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組 DNA分子的受體細(xì)胞克隆 表。外源基因的高效表達(dá)的措施 ：1、提高外源基因的劑量2、篩選、修飾充足基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件：?jiǎn)?dòng)子，增強(qiáng)子，上游調(diào)控序列，操作子， 終止子3、修飾和構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元：選擇、修飾和重組核糖體結(jié)合位點(diǎn)及密碼子 等mRNA的翻譯調(diào)控原件，強(qiáng)化受體細(xì)胞中蛋白的生物

4、合成過(guò)程。這些涉及到基因表達(dá)調(diào) 控的分子生物學(xué)原理。4、工程菌的穩(wěn)定生產(chǎn)與增殖：合理控制微型生物反應(yīng)器的增值速度和最終數(shù)量。第二章基因操作基本技術(shù)第一節(jié)凝膠電泳技術(shù)電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù) 就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異， 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。一、電泳的基本原理在溶液中任何一個(gè)帶電顆粒在電場(chǎng)作用下的移動(dòng)大致要受到三方面的影響： 顆粒的性質(zhì)，如：實(shí)際電荷，大小及形狀，解離強(qiáng)度的難易等。 所處的環(huán)境，如：電解質(zhì)或緩沖液的濃度，離子強(qiáng)度，pH，粘度，

5、溫度等。 應(yīng)用電場(chǎng)的性質(zhì)，如：電場(chǎng)強(qiáng)度不同帶電顆粒在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度不同，常用泳動(dòng)度或遷移率來(lái)表示，遷移率是指帶電顆粒電場(chǎng)強(qiáng)度下泳動(dòng)的速度。三、電泳的分類按有無(wú)固體支持物區(qū)分又可以分為：自由電泳和支持物電泳 兩大類四、凝膠電泳色（1 ）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從海藻中提取出來(lái)的一種線狀高聚物，是由D 半乳糖和3、6 脫水一L半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖。1瓊脂糖凝膠電泳的原理概述在pH值為8.08.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。 采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下， 使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離

6、核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間 氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)， 低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。2、DNA分子的遷移速率由下列多種因素決定:1 ） DNA的分子大?。壕€狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與 DNA分子量成反比。分子越大 則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中泳動(dòng)， 因而遷移得越慢。分子越小，所受阻力越小， 遷移得越快。2）凝膠濃度凝膠濃度直接影響凝膠的孔徑。濃度越高，孔徑越小，其分辨力越強(qiáng)。DNA分子電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。3）D

7、NA分子的構(gòu)型相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，共價(jià)閉合環(huán)環(huán)狀 DNA （ cccDNA） 直線 DNA （ LDNA） 開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀 DNA（ocDNA）。4）電源電壓一般電壓不得超過(guò) 5v/cm 。5）離子強(qiáng)度影響在沒(méi)有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠）,電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的 緩沖液中（如誤加10 X電泳緩沖液）,則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。2）緩沖液系統(tǒng)常用的電泳緩沖液有 EDTA （ pH8.0 ）和Tris-乙酸（TAE）, Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸 （TPE ）等，濃度約為 5

8、0mmol/L（pH7.57.8）。3）凝膠的制備以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。4 ）樣品配制與加樣DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使樣品集中5）電泳5V/cm 。為了獲得電泳分離 DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于6）染色和拍照常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。EB：即卩3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽

9、，（EthidiumBromide） 。它能夠插入 DNA 分子中的堿基對(duì)之間而與 DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在波長(zhǎng)為300nm的紫外光的照射下，凝膠電泳中的 DNA條帶呈現(xiàn)出熒光，易于檢測(cè)?？梢詸z測(cè)10ng的DNA。（四）脈沖電場(chǎng)凝膠電泳一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因?yàn)樵诃傊悄z中，DNA分子的有效直徑超過(guò)凝膠孔徑時(shí)， 在電場(chǎng)作用下，迫使DNA變形擠過(guò)篩孔，而沿著泳動(dòng)方向伸直， 因而分子大小對(duì)遷移率影響不大。如此時(shí)改變電場(chǎng)方向，則DNA分子必須改變其構(gòu)象，沿新的泳動(dòng)方面伸直，而轉(zhuǎn)向時(shí)間與 DNA分子大小關(guān)系極為密切。（2 ）聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠濃度及其分離范

10、圍分離DNA 大小的范圍為 1-1000bp蛋白質(zhì)電泳中SDS凝膠檢測(cè)常采用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)、硝酸銀染色、熒光染色法銀染的機(jī)制：來(lái)源于攝影銀染技術(shù)，是將蛋白分子結(jié)合的銀離子還原作成金屬銀。優(yōu)點(diǎn):檢測(cè)靈敏度高，較普通考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度要高50-100倍，可在蛋白質(zhì)中找到含量較低的蛋白，而且所需的上樣量較少（每點(diǎn)僅需0.1 ng ）。缺點(diǎn):可重復(fù)性差耗費(fèi)人力質(zhì)譜測(cè)定有一定的干擾 聚丙烯酰胺凝膠的主要優(yōu)點(diǎn): 也 分辨率高。具有三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，電荷效應(yīng)；長(zhǎng)度僅僅相差0.2 % （即500bp中的1bp）的DNA分子即可分開(kāi)；（例）曲所能裝載的DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；曲從聚丙

11、烯酰胺凝膠中回收的 DNA純度很高。/可根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小控制凝膠濃度制成不同孔徑的凝膠。曲丙烯酰胺較穩(wěn)定，無(wú)色透明，機(jī)械強(qiáng)度好，易觀察，可用檢測(cè)儀直接測(cè)定。5、等電聚焦：在某一 PH下，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，即靜電荷為零，則此PH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。/ 優(yōu)點(diǎn)： 分辨率很高； 樣品可混入膠中或加在任何位置，在電場(chǎng)中隨著電泳的進(jìn)行區(qū)帶越來(lái)越窄，克服了一般電泳的擴(kuò)散作用。 電泳結(jié)束后，可直接測(cè)定蛋白質(zhì)pI。 分離速度快，蛋白質(zhì)可保持原有生物活性?？?cè)秉c(diǎn)：諭電泳中應(yīng)使用無(wú)鹽樣品溶液，否則高壓中電流太大而發(fā)熱。但無(wú)鹽時(shí)有些蛋白質(zhì)溶解性能差易發(fā)生沉淀，可在樣品中多加些兩性電解質(zhì)。必許多蛋

12、白質(zhì)在pI附近易沉淀而影響分離效果，可加些脲或非離子去垢劑解決。蛋白質(zhì)雙向電泳中 SDS凝膠檢測(cè)常采用的染色方法有 考馬斯亮藍(lán)、硝酸銀染色、熒光染色 法、免疫染色法以及蛋白質(zhì)印跡法。8、蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡方法將高分辨率的電泳技術(shù)與靈敏的、專一的免疫探測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，用針對(duì)蛋白特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于蛋白質(zhì)，通常使用的探針是抗體，它與附著于固定基質(zhì)上的靶蛋白發(fā)生特異性反應(yīng) 9、免疫電泳1、抗原抗體特異性反應(yīng)。2、抗原在PH8.6時(shí)通常帶強(qiáng)負(fù)電，而抗體不帶電。3、抗原在含有抗體的凝膠中電泳時(shí)發(fā)生免疫反應(yīng)，抗原過(guò)量，僅產(chǎn)生可溶性的免疫復(fù)合物與抗原一起向陽(yáng)極移動(dòng)。4、抗原與抗體

13、濃度達(dá)到當(dāng)量點(diǎn)時(shí)，形成免疫沉淀帶。免疫電泳：是將區(qū)帶電泳與雙向免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化學(xué)分析技術(shù)。先將蛋白質(zhì)抗原在瓊脂平板上進(jìn)行電泳， 使不同的抗原成分因所帶電荷、分子量及構(gòu)型不同，電泳遷移率各異而彼此分離。然后在與電泳方向平行的瓊脂槽內(nèi)加入相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫分散。分離成區(qū)帶的各種抗原成分與相應(yīng)抗體在瓊脂中擴(kuò)散后相遇，在二者比例合適處形成肉眼可見(jiàn)的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，與已知的標(biāo)準(zhǔn)（或正常）抗原抗體形成的沉淀線比較，即可對(duì)樣品中所含成分及其性質(zhì)進(jìn)行分析、鑒定。對(duì)流免疫電泳：雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的技術(shù)。在pH8.6的緩沖液中，抗原向正極泳動(dòng)；而抗體大部分屬于Ig，由于

14、分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩慢， 同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng)（電滲使液體向負(fù)極泳動(dòng)）在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。由于電場(chǎng)的作用，限制了抗原、抗體的自由擴(kuò)散，而使其定向泳動(dòng)，因 而增加了試驗(yàn)的靈敏度，并縮短反應(yīng)時(shí)間。此法操作簡(jiǎn)便，僅需3060分鐘，靈敏度比雙向擴(kuò)散高1015倍；但缺點(diǎn)是特異性不如雙向瓊脂擴(kuò)散高?；鸺庖唠娪荆菏菍蜗蛎庖邤U(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測(cè)技術(shù)。電泳時(shí)，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)， 而在電場(chǎng)的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動(dòng)。當(dāng)抗原與抗體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與撿樣中的抗原濃度

15、呈正相關(guān)。 因此，當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時(shí)，以不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的沉淀峰長(zhǎng)度即可計(jì)算出待 測(cè)抗原的含量；反之，當(dāng)瓊脂中抗原濃度固定時(shí)，便可測(cè)定待測(cè)抗體的含量（即反向火箭免疫電泳）。DNA序列分析法：雙脫氧末端終止測(cè)序法十二烷基磺酸鈉 SDS :是一種陰離子去污劑，它在水溶液中以單體和分子團(tuán)的混合形式存 在。這種陰離子去污劑能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原劑打開(kāi)并不易再氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合從而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。第四章基因工程載體載體：是一類可

16、供外源 DNA插入并攜帶重組 DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞的DNA分子。絕大多數(shù)分子克隆實(shí)驗(yàn)所使用的載體是DNA雙鏈分子。它的本質(zhì)是 DNA復(fù)制子。復(fù)制子（Replicon） : DNA中發(fā)生復(fù)制的獨(dú)立單位稱載體的功能：1. 為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。2. 為外源基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制能力或整合能力。3. 為外源基因提供在受體細(xì)胞中的擴(kuò)增和表達(dá)能力。一個(gè)理想的載體至少應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：（1 ）能自我復(fù)制并能帶動(dòng)插入的外源基因一起復(fù)制。（2 ）具有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。（3）具有合適的篩選標(biāo)記，如抗藥性基因等。（4 ）在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)要多，這樣才能使外源基因得以擴(kuò)增。（5 ）載體

17、的相對(duì)分子質(zhì)量要小，這樣可以容納較大的外源DNA插入片段。（6 ）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失?？寺≥d體的基本結(jié)構(gòu)1）至少有一個(gè) 復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制；2） 至少應(yīng)有一個(gè) 克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入；多克隆位點(diǎn)區(qū)（multiplecloningsiteMCS）。即載體上人工合成的含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)DNA片段。3） 至少應(yīng)有一個(gè)選擇標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。標(biāo)記基因的功能是：指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。指示哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)化細(xì)胞。標(biāo)記基因的種類：1）抗性標(biāo)記基因：抗生素抗性基因氨芐青霉

18、素抗性基因（Ampr ）、四環(huán)素抗性基因（Ter）、氯霉素抗性基因（Cmlr ）、卡那霉素抗性基因（Kanr ）、G418抗性基因（G418r ）、潮霉素抗性基因（Hygr ）、新霉素抗性基因（Neor ）。ii. 重金屬抗性基因。目前所用的重金屬抗性基因有：銅抗性基因（Cur），鋅抗性基因（Znr），鎘抗性基因（Cdr）。iii. 代謝抗性基因?？钩輨┗?，胸苷激酶基因（TK）。2） 營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因。這類基因主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng)物合成酶類的基因， 如色氨酸合成酶基因（TRP1），尿嘧啶合成酶基因（URA3），亮氨酸合成酶基因（LEU2），組氨 酸合成酶基因（HIS4）等。3

19、）生化標(biāo)記基因。這類標(biāo)記基因的表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，常用的基因有B-半乳苷酶基因（lacZ ）、葡萄糖苷酸酶基因（GUS ）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT ）。 載體類型從構(gòu)建載體的DNA來(lái)源分，有質(zhì)粒載體、病毒載體、噬菌體載體、黏粒載體、噬菌粒載體、 人工染色體等。從應(yīng)用范圍分，有表達(dá)載體、克隆載體、啟動(dòng)子探測(cè)載體、轉(zhuǎn)化載體、穿梭載體、測(cè)序載體、 多功能載體等。從表達(dá)所用的受體細(xì)胞分，有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞載體，大腸桿菌載體、酵母載體、植物細(xì)胞載體和動(dòng)物細(xì)胞載體。質(zhì)粒載體噬菌體載體：噬菌體絲、狀噬菌體粘粒載體綜合型載體細(xì)菌與酵母人工染色體第一節(jié)質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒的各種元件為

20、基礎(chǔ)組建而成的基因工程載體。它必須包含3種共同的組成成分。復(fù)制必需區(qū)、選擇標(biāo)記基因和限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（克隆位點(diǎn)）。一、質(zhì)粒的種類質(zhì)粒是存在于細(xì)胞中的一類獨(dú)立于染色體外的自主復(fù)制的共價(jià)、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子, 其大小通常為1-500kb范圍內(nèi)。1 ） F質(zhì)粒：又稱F因子或性質(zhì)粒。它們能夠使寄主染色體上的基因和F質(zhì)粒一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體細(xì)胞中。2）R質(zhì)粒：通稱抗藥性因子。編碼一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且能將抗性轉(zhuǎn)到缺乏該質(zhì)粒的受體細(xì)胞，使后者也獲得該抗性。3） Col質(zhì)粒：大腸桿菌素因子。編碼抗制大腸桿菌素（可使不帶Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系的細(xì) 菌菌株致死的蛋白質(zhì)）合成的基

21、因。雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：1. 當(dāng)其兩條鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時(shí)，稱之為共價(jià)閉合環(huán)形 DNA ,（CCC）這樣的DNA通常呈超螺旋的構(gòu)型（SC）；2. 如果兩條核苷酸鏈中只有一條保持完整的環(huán)形構(gòu)型，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口時(shí)，稱之為開(kāi)環(huán) DNA （ OC）；3. 若雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線性分子，則通稱為L(zhǎng)構(gòu)型。質(zhì)粒的基本特征1） 自主復(fù)制性。質(zhì)粒DNA含有自己的復(fù)制起始位點(diǎn)（Origin，簡(jiǎn)稱ori ）以及控制復(fù)制頻 率的調(diào)控基因，有些質(zhì)粒還攜帶特定的復(fù)制因子編碼基因，形成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子結(jié)構(gòu)。有些質(zhì)粒處于“嚴(yán)緊控制”之下，即它們的復(fù)制是同宿主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步的。因此在

22、每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒只有一份拷貝，或最多只有幾份拷貝。這稱為“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒。另一些質(zhì)粒則是處于“松弛控制”之下的“松弛型”質(zhì)粒。每個(gè)細(xì)菌中可以有101000份拷貝。更重要的是松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)可因宿主細(xì)胞停止合成蛋白質(zhì)而增加至幾千份。宿主細(xì)胞不合成蛋白質(zhì)時(shí)，染色體和嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制都中止。但松弛型質(zhì)粒仍繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制。2）可轉(zhuǎn)移性。tra基因mob基因部分質(zhì)粒含有tra基因，指令宿主細(xì)胞產(chǎn)生菌毛，合成細(xì)胞表面物質(zhì)，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞接合，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一細(xì)胞中。含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。部分質(zhì)粒雖不含有tra基因，但是有bom位點(diǎn)，當(dāng)宿主細(xì)胞同時(shí)存在含有mob基因的輔助質(zhì)粒

23、和接合質(zhì)粒時(shí)，mob基因產(chǎn)物可打開(kāi)非接合質(zhì)粒的bom位點(diǎn)，借助于接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動(dòng)遷移到受體細(xì)胞中，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過(guò)程稱為遷移作用。3 ）不相容性：在無(wú)選擇壓力下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能共存于同一宿主的現(xiàn)象。質(zhì)粒DNA的提?。?. 氯化銫密度梯度離心法：在細(xì)胞裂解和分離 DNA的過(guò)程中，大分子量的細(xì)菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應(yīng)的線性DNA片段，而質(zhì)粒 DNA則由于其分子量小、結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的環(huán)狀分子。當(dāng)將含有溴化乙錠（EB）的氯化銫溶液加入大腸桿菌裂解液中，EB扁平分子就會(huì)插入到堿基對(duì)間而結(jié)合在 DNA鏈上，并因此導(dǎo)致雙

24、螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋。線性和開(kāi)環(huán)的分子，因其具 有游離末端而易于解旋，故可結(jié)合大量的EB分子。而質(zhì)粒由于具有共價(jià)閉合環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有游離的末端，只能發(fā)生有限的解旋反應(yīng)，結(jié)果限制了EB分子結(jié)合的數(shù)量。因此染色體DNA片段要比質(zhì)粒 DNA結(jié)合更多的EB分子。在EB-DNA復(fù)合物中，結(jié)合的EB分子越多 起密度越低。因此在 EB達(dá)到飽和濃度的條件下，質(zhì)粒DNA-EB復(fù)合物比線性DNA-EB復(fù)合物具有更高的密度，通過(guò)氯化銫密度梯度離心后，它們將停留在不同的位置。2. 堿裂解法在pH值介于12-12.5間時(shí)，線性DNA雙鏈間的氫鍵斷裂變成兩條完全分開(kāi)的單鏈。雖然質(zhì)粒cccDNA雙鏈間的氫鍵也斷裂，但兩條單鏈并

25、沒(méi)有完全分開(kāi)，仍然緊密的結(jié)合在一起。一旦pH值恢復(fù)成中性，線性 DNA和質(zhì)粒cccDNA 度都會(huì)復(fù)性，質(zhì)粒 cccDNA 兩條單鏈 并沒(méi)有完全分開(kāi)，因此復(fù)性快速而準(zhǔn)確。但線性DNA兩條單鏈完全分開(kāi)，復(fù)性作用就沒(méi)有cccDNA那樣快速和準(zhǔn)確，它們聚集形成線性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心便和變性的蛋白質(zhì)及RNA分子一起沉淀下來(lái)。三構(gòu)建理想質(zhì)粒載體必須具備的條件1）分子量較小2 ）具有復(fù)制起始點(diǎn)3）帶有可供選擇的標(biāo)記4 ）帶有盡可能多的單一限制性酶切位點(diǎn)5 ）質(zhì)粒拷貝數(shù)較高6）缺失mob基因7 ）插入外源基因的重組質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)選擇標(biāo)記：抗生素作用機(jī)制：氨芐青霉素一與細(xì)菌膜上的與細(xì)胞壁合成有

26、關(guān)的酶類結(jié)合并抑制其活性。而氨芐青霉素抗 性基因（Amp r）編碼的酶可水解B -內(nèi)酰胺環(huán)，從而解除氨芐青霉素的毒性。四環(huán)素一與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。而四環(huán)素抗性基 因（tetr）編碼一個(gè)膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。氯霉素一與核糖體50S亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。氯霉素抗性基因（ Cmlr或cat）編碼 一個(gè)四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白，在乙酰輔酶A存在的條件下，該蛋白催化氯霉素羥乙酰氧基衍生物的形成，使之不能與核糖體結(jié)合而解毒。卡那霉素和新霉素一是一類與30S核糖體結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成的脫氧鏈霉胺氨基糖苷， 可被氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶所滅活。載體上帶有一個(gè)來(lái)自大腸桿菌

27、的lac操縱子的DNA區(qū)段（細(xì)菌lac操縱元中的lacI基因，啟動(dòng)子和lacZ的 肽基因），即lacZ'基因，lacZ'基因編碼B -半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸 的（肽）。宿主菌具有缺失突變 LacZ基因，合成的是一種缺失 N端11-41氨基酸的缺陷 性的B-半乳糖苷酶，簡(jiǎn)稱3肽。由于缺失故不能將無(wú)色底物 X-gal水解成藍(lán)色物質(zhì)。若將帶 有l(wèi)acZ'基因的載體導(dǎo)入該宿主，當(dāng)培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)物IPTG和生色底物X-gal時(shí)，lacZ'基因被誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的B -半乳糖苷酶 N端 肽與宿主菌表達(dá)的3肽實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)的互補(bǔ)而產(chǎn) 生具有活性的B -半乳糖苷酶。質(zhì)粒和宿主編

28、碼的肽段各自都沒(méi)有酶活性，兩者由于功能互補(bǔ)而具有B -半乳糖苷酶活性，這種現(xiàn)象成為稱為-互補(bǔ)（a compleme ntati on）。3-半乳糖苷酶水解X-gal而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，在lacZ'的5'端又插入了一段人工設(shè)計(jì)合成的DNA序列MCS ,當(dāng)外來(lái)序列插入后則破壞了lacZ'編碼的半乳糖苷酶氨基端片段活性，從而破壞了互補(bǔ)作用，生長(zhǎng)的菌落就呈白色，這種顏色標(biāo)志的變化就很容易區(qū)分和挑選含有和不含有 插入序列或基因的轉(zhuǎn)化菌落，稱為藍(lán)白篩選法。插入失活：因DNA插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象 。四質(zhì)粒載體的改造與構(gòu)建 早期：pSC101,ColE1和pCR1缺點(diǎn)：復(fù)制效率低；選

29、擇標(biāo)記不合適；限制性酶切位點(diǎn)少（<2 ）發(fā)展期：pBR313優(yōu)點(diǎn)：松弛型復(fù)制；兩個(gè)選擇標(biāo)記（ tetr和amp r）缺點(diǎn)：太大成熟期：pBR322 （4.36kb ）衍生質(zhì)粒長(zhǎng)度盡可能?。恨D(zhuǎn)化效率高（<15kb ）;容納外源DNA長(zhǎng)；復(fù)制拷貝數(shù)高。限制性酶切位點(diǎn)盡可能多：多克隆位點(diǎn)（MCS）。輔助序列：肉眼鑒定重組克?。煌庠吹鞍踪|(zhì)表達(dá)。五常用的質(zhì)粒載體1）pSC101 質(zhì)粒2）pBR322 質(zhì)粒載體3）pUC系列pBR322質(zhì)粒作為克隆載體的缺陷：一是很多常用的限制性內(nèi)切酶沒(méi)有單一切點(diǎn)；二是選擇重組子和轉(zhuǎn)化子時(shí)費(fèi)時(shí)又繁瑣。一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括如下四個(gè)組成部分：（1

30、）來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；（2 ）氨芐青霉素抗性基因，但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶的單識(shí)別位點(diǎn)；（3 ）大腸桿菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼該基因氨基端-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ'基因；（4）位于lacZ'基因中的靠近5'端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。pUC系列的優(yōu)點(diǎn)：a:具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。（500-700copy/cell ）；b:引入人工合成的具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的序列，使質(zhì)粒上帶多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)；多克隆位點(diǎn)（MCS:Multi-cloningSite）；

31、c:引入細(xì)菌染色體上乳糖操縱元的一段區(qū)域，使轉(zhuǎn)化子可以實(shí)現(xiàn)藍(lán)白篩選。4 ）穿梭質(zhì)粒載體： 人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記而可在兩種不同的寄主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。如：大腸桿菌-啤酒酵母穿梭質(zhì)粒載體。5 ）表達(dá)質(zhì)粒載體：專用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。除具有一般載體的基本特性外，還需要如啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合序列（ S-D序列），轉(zhuǎn)錄終止子。目的基因 必須處于正確的閱讀框架中。7.T載體（T-A克?。? T-vector兩條鏈的5 '端含有一個(gè)游離的 T?PCR過(guò)程中，普通的 Taq酶在產(chǎn)物的3 '端多加一個(gè) A第二節(jié)病毒（噬菌體）載體一.-雙鏈DNA噬

32、菌體載體三.單鏈DNA噬菌體載體噬菌體（bacteriophage,phage） :是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。噬菌體具有病毒的一些特性：個(gè)體微小，可以通過(guò)濾菌器；沒(méi)有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成的衣殼和包含于其中的核酸組成； 只能在活的微生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增值， 是一種專性 細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物。噬菌體分布極廣，凡是有細(xì)菌的場(chǎng)所，就可能有相應(yīng)的噬菌體的存在。一.-雙鏈DNA噬菌體載體諭噬菌體是一種中等大小的溫和噬菌體。DNA為線狀雙鏈分子，長(zhǎng)度為48502bp。迄今已經(jīng)定位的噬菌體的基因至少有 61個(gè)，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的活動(dòng)- 噬菌體的必要基因。/另一部

33、分基因，當(dāng)它們被外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能 -噬菌體的非必要的基因。諭DNA兩端具有由12個(gè)核苷酸組成的粘性末端（這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點(diǎn)）。當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后，雙鏈 DNA分子通過(guò)COS而成環(huán)狀。諭噬菌體可以進(jìn)行體外包裝，只要被包裝DNA在36.4 50.9kb的雙鏈處有兩個(gè)COS序列。總DNA可通過(guò)噬菌體特異性感染高效進(jìn)入宿主細(xì)胞或受體細(xì)胞，以及-DNA在大腸桿菌細(xì)胞中的高拷貝復(fù)制，這是-DNA在分子克隆技術(shù)發(fā)展早期就被選作載體使用的原 因。重組噬菌體分子的體外包裝所謂 DNA的體外包裝，就是在試管中完成噬菌體在寄主細(xì)胞內(nèi)的全部組裝過(guò)程。其基本 原

34、理是：噬菌體頭部和尾部的裝配是分開(kāi)進(jìn)行的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部，而尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成頭部。將這兩種不同突變型的噬菌體提取物混合起來(lái)，就能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。Ter體系：位點(diǎn)特異的切割體系，能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的cos位點(diǎn)，將多連體分子切割成入單位長(zhǎng)度的片段，并將它們包裝到入噬菌體頭部中去。包裝限制：噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納DNA的能力：75%-105% ;包裝底物：多連體的DNA分子。1 ) DNA載體的構(gòu)建：(1 )縮短野生型 -DNA的長(zhǎng)度，提高外源 DNA片段的有效裝載量。-DNA的包裝范圍為-DNA 總長(zhǎng)度的 75%-105%(36.4

35、 50.9kb )。(2 )刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)，引入單一的多酶切位點(diǎn)接頭序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性。(3 )滅活某些與裂解周期有關(guān)基因，使-DNA載體只能在特殊的實(shí)驗(yàn)條件下感染裂解宿主細(xì)菌，以避免可能出現(xiàn)的生物污染現(xiàn)象的發(fā)生。(4 )引入合適的選擇標(biāo)記基因，便于重組噬菌體的檢測(cè)2) 噬菌體載體的主要類型(i) 插入型載體：只具有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以便于外源DNA的插入。外源的DNA克隆到插入型的載體分子上，會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)。根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性， 插入型的 載體分為免疫功能失活和大腸桿菌B-半乳糖苷酶失活兩種亞型。插入型載體的長(zhǎng)度正好是噬

36、菌體包裝的下限，因?yàn)楸旧硪材鼙话b，因而所承受的外源插入DNA片段較小(014.5kb )( 50.9-36.4 )，一般在10kb以內(nèi)，廣泛應(yīng)用于 cDNA及小 片段DNA的克隆。利用這類載體必須使用載體所攜帶的選擇標(biāo)記基因來(lái)篩選重組噬菌體。(ii )替換型載體又叫做取代型載體：具有兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其中央的DNA區(qū)段可以被外源DNA分子所取代的克隆載體。取代型載體的-DNA分子長(zhǎng)度約為40kb，在其非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口，兩者間的距離為14kb，使用時(shí)用酶切開(kāi)載體分子，分離去除非必需DNA片段，然后用外源DNA片段取而代之，形成重組分子。這類載體的裝載量不僅比插入型載體大，而

37、且被克隆的DNA片段必定在10.4kb24.9kb之間(去除I4kb非必需DNA片段后的載體片段總長(zhǎng)為 26kb)。取代型載體不再需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭盏妮d體分子只有26kb，不能被包裝成成熟的噬菌體顆粒。含有小于10kb和大于25kb外源DNA片段的重組分子也不能形成噬菌斑。3) 重組噬菌體的篩選與質(zhì)粒載體不同，噬菌體載體不具有抗菌素抗性選擇記號(hào)。對(duì)重組體分子的選擇，主要是依據(jù)噬菌斑的形態(tài)學(xué)特征和X-gal-IPTG 顯色反應(yīng)作出判斷的。(i) cI基因功能選擇法：cl基因編碼的阻遏蛋白質(zhì)，是促使感染了大腸桿菌的噬菌體在寄主細(xì)胞進(jìn)入溶源化狀態(tài)的必要條件。如果在噬菌體載體的cI基因區(qū)域插入了或替

38、換了外源DNA片段，重組體分子的表型將是cl-,重組噬菌體因不能建立溶源狀態(tài)形成透明噬菌斑；而非重組體分子的則是 c I +表型,重組體分子。形成混濁型的噬菌斑。所以，根據(jù)噬菌斑形態(tài)學(xué)特征的差異，便可以選擇出(ii) LacZ基因功能選擇法：根據(jù)lacZ基因編碼產(chǎn)物B -半乳糖苷酶在 X-gal-IPTG 培養(yǎng)基 平板上顯色反應(yīng)的原理，并且在某些噬菌體載體的lacZ基因中，引入了若干常用的核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)外源DNA片段插入到這些克隆位點(diǎn)時(shí)，形成的是無(wú)功能活性的B -半乳糖苷酶。于是被感染的大腸桿菌寄主細(xì)胞，就將在含X-gal-IPTG 的培養(yǎng)基平板上形成無(wú)色的噬菌斑；而相反的，只噬菌

39、體載體將會(huì)形成藍(lán)色的噬菌斑(iii) Spi-選擇法(SensitivetoP2inhibition):基本原理： 噬菌體的red和gam 基因的編碼產(chǎn)物，會(huì)抑制噬菌體在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌細(xì)胞中正常生長(zhǎng)，其表型為Spi+。而red-gam-突變型的噬菌體，卻可以在 P2溶源性的細(xì)菌中正常生長(zhǎng)并形成噬菌斑，即Spi-。4) 重組噬菌體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)染： 重組體DNA分子直接感染大腸桿菌，使之侵入寄主細(xì)胞內(nèi)。5) 質(zhì)粒和噬菌體載體比較：質(zhì)粒載體克隆外源 DNA片段的大小一般不超過(guò)15Kb ;噬菌體載體容納的外源DNA片段較大；以感染途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞的效率比轉(zhuǎn)化高；但對(duì)克隆基因的分析鑒定

40、較難。6) 常用的噬菌體載體lambdagt10 插入型載體、Iambdagt11插入型載體容量：5kb，適用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建EMBL3替換型載體9-23kb 的置換容量二柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體又稱粘粒是一類由人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。1) 柯斯質(zhì)粒的特點(diǎn)：(i )具有噬菌體的特性：在克隆了外源片段后可在體外被包裝成噬菌體顆粒，高效地感染對(duì)入噬菌體敏感的大腸桿菌細(xì)胞。（ii）具有質(zhì)粒載體的特性：在寄主細(xì)胞內(nèi)如質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，攜帶有抗性基因和克隆位 點(diǎn)，并具氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)。（iii ）具有高容量的克隆能力柯斯質(zhì)粒用于克隆大片段的DNA分子特別有效2）

41、柯斯質(zhì)粒的優(yōu)越性：1高效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi) 2柯斯質(zhì)?？梢源笠?guī)模擴(kuò)增 3具有很強(qiáng)的選擇性 4質(zhì)粒上的選擇性 標(biāo)記可直接用來(lái)篩選感染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。與-噬菌體DNA不同的是：柯斯質(zhì)粒重組分子進(jìn)入受體細(xì)胞后，依靠質(zhì)粒DNA部分的復(fù)制子結(jié)構(gòu)進(jìn)行自主復(fù)制，其拷貝數(shù)取決于質(zhì)粒本身的性質(zhì)，而且由于重組分子失去了體內(nèi)包裝的能力，故其分離純化只能采用質(zhì)粒的方法。3）柯斯克隆應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫做“柯斯克隆”。三.單鏈M13DNA 噬菌體載體M13基因組為環(huán)狀單鏈 DNA，大小為6407bpM13噬菌體有下述特點(diǎn)： 不論是RFDNA還是單鏈DNA，都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸

42、桿菌； M13單鏈DNA噬菌體可大可小，只受 DNA的大小控制。因此 M13不受外殼蛋白的包 裝限制。 RFDNA可作為克隆載體使用，單鏈 DNA適合測(cè)序等。2.M13單鏈DNA噬菌體載體的構(gòu)建1) 在IG內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的lac操縱子片段。2) 在M13mp2的EcoRI位點(diǎn)上，加入一種化學(xué)合成的具有多克隆位點(diǎn)的多聚銜接物(polyli nker)，使其成為適用于多種核酸內(nèi)切限制酶的克隆載體。M13克隆載體的缺陷 是克隆外源DNA的能力較小，一般只適于克隆3004OObp的外源DNA片段，其最大容量1500bp。插入外源片段后，遺傳穩(wěn)定性下降。第三節(jié)噬菌粒載體噬菌粒載體：一類由質(zhì)粒載體和單

43、鏈?zhǔn)删w而成的新型載體系列。它們均具有以下的基本結(jié)構(gòu)：(1 )在多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS)的兩側(cè)，存在一對(duì) T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，用以定向地指導(dǎo) 插入在多克隆位點(diǎn)上的外源DNA或(基因)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；(2 )同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，pBluescript噬菌粒載體便可按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或雙鏈的DNA ;(3)編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，供作轉(zhuǎn)化子克隆的選擇記號(hào)；(4 )含有一個(gè)lacZ基因，可以按照 Xgal-IPTG 組織化學(xué)顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體的重 組子。酵母人工染色體染色體含有三種必需成分：著絲粒、端粒和自主復(fù)制序

44、列。著絲粒(CEN)在有絲分裂時(shí)結(jié)合微管并調(diào)控染色體的運(yùn)動(dòng)，接收細(xì)胞信號(hào)而使姐妹染色體分開(kāi)到各子細(xì)胞中去。端粒(TEL):主要功能是防止染色體融合、降解、確保其完整復(fù)制。維持染色體的穩(wěn)定。自主復(fù)制序列(ARS),即復(fù)制起點(diǎn)：DNA復(fù)制通常由起始蛋白與該序列相互作用開(kāi)始，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號(hào)。無(wú)義突變：由于一對(duì)或幾對(duì)堿基對(duì)的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子 的基因突變叫無(wú)義突變。其中密碼子改變?yōu)?UAG的無(wú)義突變又叫琥珀突變，密碼子改變成 UAA的無(wú)義突變又叫赭 石突變。細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC):用

45、F質(zhì)粒及其調(diào)控基因構(gòu)建細(xì)菌載體，克隆大片段DNA。是通過(guò)去除了 F質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移區(qū)及整合區(qū)等復(fù)制非必需區(qū)段，并引入了多克隆位點(diǎn)及選擇標(biāo)記而構(gòu)成的。BAC的優(yōu)點(diǎn)1.易于用電擊法轉(zhuǎn)化E.coli (轉(zhuǎn)化效率比轉(zhuǎn)化酵母高10-100倍)；2 .超螺旋環(huán)狀載體，易于操作；3 . F質(zhì)粒本身所帶的基因控制了質(zhì)粒的復(fù)制；4 .很少發(fā)生體內(nèi)重排，穩(wěn)定；5. 克隆容量可達(dá)300kb。第三節(jié)表達(dá)型載體1.基因表達(dá)的過(guò)程轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，是遺傳信息從DNA分子轉(zhuǎn)移到RNA分子的過(guò)程?；虮磉_(dá)的第二步是轉(zhuǎn)譯，是mRNA分子指導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽鏈合成的過(guò)程?；虻木幋a區(qū)叫做開(kāi)放閱讀框架表達(dá)型載體：包括轉(zhuǎn)錄起始必需的啟動(dòng)子

46、、翻譯起始所必需的核糖體識(shí)別序列，正確的閱讀框架等。3 .分泌型表達(dá)載體4 .原核生物的表達(dá)載體大多數(shù)原核生物表達(dá)載體的啟動(dòng)子主要是入噬菌體的Pl啟動(dòng)子、大腸桿菌乳糖操縱子的lac啟動(dòng)子、色氨酸操縱子的trp啟動(dòng)子以及pBR322質(zhì)粒的B -內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子第三章工具酶 核酸酶：通過(guò)切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，使核酸分子多核苷酸發(fā)生水解 斷裂的酶。核糖核酸酶(Rnase)專門水解斷裂 RNA分子，脫氧核糖核酸酶(DNase)特異水解斷裂 DNA分子。按水解斷裂核酸分子的不同方式核酸酶分為兩種類型: 核酸外切酶(exonuclease):從核酸分子的末端開(kāi)始，一個(gè)核苷酸一個(gè)核苷酸地消

47、化降解多 核苷酸鏈。切害V DNA核酸內(nèi)切酶(en do nuclease):從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑?。限制性核酸?nèi)切酶I ra iDNA連接酶I生成3 -5 '磷酸二酯鍵DNA聚合酶I探針標(biāo)記、補(bǔ)平 3 '末端反轉(zhuǎn)錄酶多聚核苷酸激酶5 '磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3 '末端多聚尾堿性磷酸酶I切除末端磷酸基cDNA合成第一節(jié)限制性內(nèi)切酶 Restrictio nEn zyme(RE)修飾作用：第二個(gè)寄主菌株賦予入噬菌體非遺傳的變化，使之再感染時(shí)能夠有效生長(zhǎng)，而沒(méi)有再次受到限制的現(xiàn)象。限制性內(nèi)切酶是 一類能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的某種特定核

48、苷酸序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。3限制酶的種類根據(jù)限制酶識(shí)別和切割 DNA的特點(diǎn)，可將限制酶分為 I、II、山三種類型.I型：能識(shí)別專一的核苷酸順序，在距識(shí)別點(diǎn)數(shù)千堿基處隨機(jī)切割DNA分子中的雙鏈。III型：有專一的識(shí)別順序。它在識(shí)別順序下游約25bp處幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的。II型：識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)或附近的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段,并能構(gòu)建來(lái)自不同基因組的DNA片段，形成雜合 DNA分子。4. n型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性：

49、4.1 n型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列絕大多數(shù)的n型核酸內(nèi)切限制酶，都能夠識(shí)別由4 一 6個(gè)核苷酸對(duì)組成的特定的核苷酸序列，我們稱這樣的序列為核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列。而限制酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此識(shí)別序列又稱內(nèi)切酶的靶子序列。識(shí)別序列通常具有二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，序列呈回文結(jié)構(gòu)(palindromicstructure)。即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”核苷酸順序都完全相同。識(shí)別序列在DNA分子中出現(xiàn)的頻率：如果四種堿基按完全隨機(jī)分布的原則，則某種限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列在DNA分子中出現(xiàn)的頻率為(1/4 ) nn為識(shí)別序列的核苷酸數(shù)目。4.2 n型限制性內(nèi)切酶的酶切特點(diǎn)絕大

50、多數(shù)n型限制性內(nèi)切酶在其識(shí)別順序切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3' OH和5 ' P片段。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種單鏈末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端 如果切點(diǎn)在中軸的左上側(cè)和右下側(cè)，則產(chǎn)生5 '突出粘性末端(cohesiveend ):5 'GJAATTC 35 'GOHpTTAAC 3'3 'CATAA 1G 5 ' EcoR I 3'CTTAApOHG 5' 如果切點(diǎn)在中軸的右上側(cè)和左下側(cè)，則產(chǎn)生3'突出的粘性末端：5 '

51、CTGCA G 3' t 5 'CTGCAOHpG 3'3 'GgCGTC 5' Pst I 3 'GpOHACGTC 5'另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端，即堿基配對(duì)完好的末端。5同裂酶同裂酶：來(lái)源不同的限制酶卻識(shí)別和切割相同的序列?！巴耆衙浮蹦茏R(shí)別和切割完全相同的序列，如HindIII與HsuI , (A/AGCTT ) “不完全同裂酶”雖能識(shí)別相同序列， 但切割方式不同，如Xmal和Smal。( CCCG/GG和CCC/GGG ) 6同尾酶同尾酶：來(lái)源不同的限制酶，識(shí)別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端。7

52、限制酶的識(shí)別位點(diǎn)與切割方式之間的關(guān)系：(1 )識(shí)別順序不同，切割方式也不同；(如EcoR I和Pstl，前者產(chǎn)生的是5 '粘端，后者產(chǎn)生的是3'粘端。)(2 )識(shí)別順序不同，切割產(chǎn)生的粘末端相同；(同尾酶)(3)識(shí)別順序相同，切割方式不同；(如Smal與X mal)(4 )相同的識(shí)別順序，切割方式亦相同；8 .影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素：核酸內(nèi)切限制酶的單位是這樣定義的，在20ul終反應(yīng)體系中，1h完全酶解1底物DNA所需要的酶量，為I個(gè)單位的內(nèi)切酶(1U )。(1 ) DNA樣品的純度：純度越高越有利酶切(2 ) DNA的甲基化程度：甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì) DNA修飾后，使得自身 D

53、NA不受到體內(nèi)限制性 內(nèi)切核酸酶的酶切(3)酶切消化反應(yīng)的溫度：不適合的溫度酶會(huì)失活。(4 ) DNA的分子結(jié)構(gòu)：酶切超螺旋DNA和病毒DNA需要的的酶量比線性 DNA多(5 )核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液：放止酶變性(6)酶的純度：越高越好內(nèi)切酶的星號(hào)活性： 在某些反應(yīng)條件下，識(shí)別順序的特異性可能發(fā)生變化，可能切割一些與特異識(shí)別序列相類似的序列。促使內(nèi)切酶產(chǎn)生星號(hào)活性的因素有多種，主要由如下一些因素引起。(1 )甘油濃度過(guò)高。這是引起星號(hào)反應(yīng)的常見(jiàn)原因。(2 )離子強(qiáng)度不合適。某些內(nèi)切酶需要在高鹽緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，鹽濃度降低也可能引起 星號(hào)反應(yīng)。(3)陽(yáng)離子變化。若將 Mg2+改為Mn 2+可能促

54、使EcoR I和Hi nd川產(chǎn)生星號(hào)活性。(4 )溶液中pH變化。如用EcoRI酶切時(shí)，反應(yīng)溶液的 pH值由7.5升高到8.5時(shí)也會(huì)出 現(xiàn)星號(hào)反應(yīng)。(5 )有機(jī)溶劑殘留的影響。9.核酸內(nèi)切限制酶在分子克隆中的應(yīng)用DNA重組，組建新質(zhì)粒， DNA分子雜交， 制備DNA放射性探針，繪制 DNA物理圖譜，DNA序列分析，DNA甲基化堿基的 識(shí)別與切割，基因定位及 DNA同源性研究。第二節(jié)甲基化酶甲基化酶 使識(shí)別順序中的某個(gè)堿基發(fā)生甲基化，保護(hù)DNA不被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)。第三節(jié)DNA連接酶DNA連接酶（ligase）:能借助ATP或NAD水解提供的能量催化 2條雙鏈DNA片段緊靠 在一起的3 '

55、;羥基末端與5 '磷酸基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接的酶。1. DNA連接酶的作用機(jī)理DNA連接酶與細(xì)胞內(nèi)的能源分子形成復(fù)合物，“用力拉住”-P末端并將其'“送到”3 '-OH末端上，促使兩者形成磷酸二酯鍵，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)DNA分子的連接。細(xì)胞內(nèi)的能源分子主要是指煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+ ）和腺苷三磷酸（ATP ）。2連接酶的種類E.coliDNA 連接酶：簡(jiǎn)稱DNA連接酶，是由大腸桿菌染色體編碼的。只能催化雙鏈DNA片段黏性末端之間的連接， 不能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接。用NAD+作能源輔 助因子。T4DNA 連接酶：是由大腸桿菌 T4噬菌體DNA

56、編碼的。既可用于雙鏈 DNA片段黏性末 端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較 低。用ATP作作能源輔助因子。連接反應(yīng)的最佳溫度為 4-15 °C3. DNA片段的連接特點(diǎn)和連接方式（1 ）粘性末端連接：由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的粘性末端，或由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段，具有相同類型的粘性末端，都可以在DNA連接酶催化作用下形成共價(jià)結(jié)合的重組DNA分子。(2 )平末端連接：用T4DNA連接酶直接將平末端的 DNA片段連按起來(lái)，或是用末端脫 氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的 DNA片段加上poly(dA)-poly(dT) 同聚物尾巴之后，再用 DNA連接酶將它們連接起來(lái)。(3 )同聚物加尾連接：運(yùn)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，將