微生物的生理生化實驗實驗報告

1、微生物的生理生化實驗李 越201500140086組員：隋心怡、王運澤、徐承鵬2016/11/26一 實驗?zāi)康恼莆諑追N常用的生理生化實驗方法并了解其原理。（1.證明不同微生物對各種有機大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進行微生物大分子物質(zhì)水解試驗的原理和方法。 3.了解糖發(fā)酵的原理和在腸細(xì)菌鑒定中的重要作用。4.掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。5.了解吲哚和甲基紅試驗的原理以及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。）二 實驗原理1. 在所有生活細(xì)胞中存在的全部生物化學(xué)反應(yīng)稱之為代謝，代謝過程主要是酶促反應(yīng)過程，由于各種 微生物具有不同的酶系統(tǒng)，所以他們能利用的

2、底物不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應(yīng)來鑒別不同的細(xì)菌，尤其是在腸桿菌科細(xì)菌的鑒定中，生理生化 試驗占有重要的地位。2. 淀粉的水解：由于微生物對淀粉這種大分子物質(zhì)不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì) 分解才能被微生物吸收利用 ，胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物，使其能被運輸至細(xì)胞內(nèi) 。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精，雙糖和單糖；而淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，則能利用其周圍的淀粉。 在淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)用碘處理 ： 其菌落周圍不呈藍色，而是無色透明圈，據(jù)此可分辨微生物能否產(chǎn)生淀粉酶3. 油脂的水解：在

3、油脂培養(yǎng)基上接種細(xì)菌，培養(yǎng)一段時間后觀察菌苔的顏色，若出現(xiàn)紅色斑點，則說 明此中菌可產(chǎn)生分解油脂的酶4. 糖發(fā)酵試驗：糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng),在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要。絕大多數(shù) 細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的異。有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫氣、甲烷、二氧化碳等); 有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。 產(chǎn)酸后再加入溴甲酚指示劑后會使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會收集到一部分氣體。若細(xì)菌不能使糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則最后溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無氣體。 5. IMVIC實驗主

4、要用于快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。 （1）吲哚試驗：是用來檢測吲哚的產(chǎn)生，在蛋白胨培養(yǎng)基中，若細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，則可將蛋白胨中的色氨酸分解為丙酮酸和吲哚，吲哚與對二甲基苯甲醛反應(yīng)生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，所以吲哚實驗可以作為一個生物化學(xué)檢測的指標(biāo)。大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性（2）甲基紅試驗 （ MR ） ： 某些細(xì)菌在糖代謝過程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者進而被分解產(chǎn)生甲酸，乙酸和乳酸等多種有機酸，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，即甲基紅反應(yīng)。大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性三實驗材料菌種：枯草芽孢桿

5、菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌 培養(yǎng)基：固體淀粉培養(yǎng)基、固體油脂培養(yǎng)基（大分子水解試驗）；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管） （糖發(fā)酵試驗） ；蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗）；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基； 試劑：盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水等 儀器：酒精燈、接種針、培養(yǎng)皿、試管、試管架、燒杯、量筒、德漢氏小管等四實驗方法1.淀粉水解實驗（1 ）倒平板：按照淀粉培養(yǎng)基配方配制固體淀粉培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至 50 左右，在酒精燈火焰旁倒平板，每組兩個平板。 （2）用記號筆在平板底部劃成四部分。 （3）接種：在無菌操作臺上，將枯草芽孢桿菌、

6、大腸桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌分別在不同的部分點種，注意僅用接種針接觸極少面積的培養(yǎng)基，在平板的反面對應(yīng)部分貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別寫上菌名，以免混淆。 （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在 28 溫箱中培養(yǎng)兩天。 （5）觀察：取出培養(yǎng)基，觀察各種細(xì)菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個平板，觀察培養(yǎng)皿中菌落周圍是否有無色透明圈，若有無 色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已經(jīng)被水解，為陽性，反之則為陰性。記錄實驗結(jié)果。2. 油脂水解試驗 （1）倒平板：按照油脂培養(yǎng)基配方配制固體油脂培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至 50 左右，充分振蕩，使油脂均勻分布，在酒精燈火焰下倒平板

7、，每組兩個平板。 （2）用記號筆在在平板底部劃成四部分。 （3）接種：在無菌操作臺上將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌分別劃十字線 接種于平板相對應(yīng)部分的中心，并貼好標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明菌種的名稱。 （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在 28 溫箱中培養(yǎng)兩天。 （5）觀察：取出平板，觀察菌苔顏色，如果出現(xiàn)紅斑點，說明脂肪水解，為陽性反應(yīng)。記錄實驗結(jié)果。 淀粉水解試驗接種示意圖 油脂水解試驗接種示意圖3. 葡萄糖發(fā)酵實驗 （1）培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏小管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進入空氣，每組3

8、只試管，滅菌。 （2）接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時，取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管 1支接入大腸桿菌，再取另1支接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡，第3支不 接種，作為對照。在各試管外壁上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細(xì)菌菌名。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于 28 下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實驗結(jié)果。4. 乳糖發(fā)酵實驗 （1）培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏小 管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要

9、讓德漢氏小管中進入空氣，每組2只試管，滅菌。 （2）接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時，在無菌操作臺上，取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管 1支接入大腸桿菌，再另取1只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。在各試管外壁上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細(xì)菌菌名。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于 28 下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實驗結(jié)果。 5. 吲哚試驗 （3）培養(yǎng)基的配制：按照蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組五只試管，在高壓蒸氣鍋內(nèi)滅菌。 （2）接種：待培養(yǎng)基冷卻后

10、，在無菌操作臺上將大腸桿菌接入 1 支蛋白胨水培養(yǎng)基，產(chǎn)氣腸桿菌接入另1 支蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對照，貼好標(biāo)簽。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于 28 下培養(yǎng)兩天。6. 甲基紅試驗 （1）培養(yǎng)基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組五只試管，在高 壓蒸氣鍋內(nèi)滅菌。 （2）接種：待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌操作臺上將大腸桿菌接入 1支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，產(chǎn)氣腸桿菌 接入 1支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對照，貼好標(biāo)簽。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中

11、于 28 下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：培養(yǎng)兩天后后，將每支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)物內(nèi)加入 2 滴甲基紅試劑，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性，變?yōu)辄S色者為陰性。觀察試管內(nèi)的顏色變化，并記錄實驗結(jié)果。五實驗結(jié)果1. 淀粉分解實驗菌種 陽/陰性 結(jié)論大腸桿菌 + 能水解淀粉枯草芽孢桿菌 + 能水解淀粉變形桿菌 + 能水解淀粉銅綠假單胞菌 不能水解淀粉大腸桿菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌變形桿菌淀粉分解試驗結(jié)果2. 油脂分解試驗 菌種 陽/陰性 結(jié)論 大腸桿菌 - 不可以水解油脂 枯草芽孢桿菌 - 不可以水解油脂 銅綠假單胞菌 + 可以水解油脂變形桿菌 - 不可以水解油脂3葡萄糖發(fā)酵實驗 樣品 大腸桿菌 變形桿菌

12、 空白 顏色變化 黃 黃 紫 是否產(chǎn)氣 是 是 否 陰/陽性 + + - 結(jié)論 可以分解葡萄糖 可以分解葡萄糖 對照組 產(chǎn)酸產(chǎn)氣 產(chǎn)酸產(chǎn)氣4乳糖發(fā)酵實驗樣品 大腸桿菌 變形桿菌 空白顏色 紫 紫 紫是否產(chǎn)氣 否 否 否陰/陽性 - - -結(jié)論 不分解 不分解 不分解 葡萄糖分解試驗 乳糖分解試驗5. 甲基紅試驗樣品 大腸桿菌 產(chǎn)氣桿菌顏色變化 變紅 變黃陰/陽性 + -結(jié)論 大腸桿菌在培養(yǎng) 產(chǎn)氣腸桿菌轉(zhuǎn)化有機酸為期仍維持酸性ph 非酸性末端產(chǎn)物6. 吲哚試驗樣品 大腸桿菌 產(chǎn)氣桿菌顏色變化 產(chǎn)生紅色圈狀區(qū) 無變化陰/陽性 + -結(jié)論 可分解色氨酸產(chǎn)生 不分解色氨酸 吲哚 甲基紅試驗 吲哚試驗附錄牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g瓊脂 1520g水 1000mlPh 7.07.212120min滅菌淀粉培養(yǎng)基蛋白胨 10gNaCl 5g牛肉膏 5g可溶性淀粉 2g水 1000ml瓊脂 1520g12120min油脂培養(yǎng)基蛋白胨 10g牛肉膏 5gNaCl 5g花生油或香油 10g1.6中性紅水溶液 1ml瓊脂 1520g蒸餾水 1000mlPh 7.212120min注：1.不能使用變質(zhì)油 2.調(diào)好ph再加中性紅 蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨 10gNaCl 5g蒸餾水 1000mlPh 7.612120min糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨