丹酚酸B對內皮細胞氧化損傷的保護作用及機制研究

1、丹酚酸B對內皮細胞氧化損傷的保護作用及機制研究                        【摘要】  目的：研究丹酚酸B對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）氧化損傷的保護作用,并探討其對HUVECs CD54表達和中性粒細胞黏附率的影響。方法:以H2O2為損傷劑，觀察丹酚酸B對HUVECs培養(yǎng)上清中LDH、NO、MDA含量的影響,并利用免疫組化方

2、法和顯微計數(shù)法觀察該藥對H2O2存在下CD54表達和中性粒細胞黏附率的影響。結果:丹酚酸B可劑量依賴性地減少H2O2所致內皮細胞LDH外漏和MDA生成,并提高NO釋放,還能有效抑制H2O2存在下CD54表達和增加中性粒細胞黏附率。結論:丹酚酸B具有減輕H2O2所致內皮細胞的氧化性損傷，降低血管內皮細胞表面細胞黏附分子表達和抑制中性粒細胞黏附的作用，這一作用可能是丹酚酸B抗心肌缺血/再灌注損傷的作用機制之一。 【關鍵詞】  丹酚酸B 內皮細胞 CD54 中性粒細胞    丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干

3、燥根及根莖。丹參歸心、肝經(jīng),藥性微寒,味苦、無毒,具有祛瘀止痛、活血調經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。近年研究顯示，丹參有廣泛的生物活性，其治療心血管系統(tǒng)疾病的作用尤其受到關注，并已有相關藥物在臨床使用14。目前已有研究表明,其水溶性有效成分為治療心血管疾病的主要藥效物質基礎，而丹酚酸B是其中較為重要的成分之一。目前關于丹酚酸B的研究主要集中于心肌缺血/再灌注損傷和缺氧/復氧損傷，而關于丹酚酸B對內皮細胞氧化性損傷的研究尚未見報道。鑒于血管內皮細胞所處的特殊位置（血液與間質組織間的一層半透性的屏障）及其損傷對心肌缺血/再灌注損傷的重要影響，我們研究了丹酚酸B對血管內皮細胞氧化性損傷的影響，以期為更全面了解

4、丹酚酸B的藥理作用提供相關依據(jù)。    1  材料和方法    1.1  藥品、試劑和儀器    丹參注射液，生藥1.5  g·ml-1，正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號0405202。肝素鈉注射液，常州生物千紅制藥有限公司，批號030212。RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco產品。新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號041030。胰蛋白酶（1250），Amresco分裝。3%雙氧水，南京興藍箭科技公司，批號200309011。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，

5、南京建成生物工程研究所，批號20050225。一氧化氮（NO）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20050112。丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20050203。Rabbit Anti CD54(ICAM1)，0.1 ml(200 g·ml-1)，武漢博士德生物工程有限公司。即用型SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。Percoll，100 ml(1.131 g·ml-1),北京夏斯生物有限公司，批號301944。Beckman冷凍臺式離心機，美國Beckman公司。萊卡顯微工作站，德國

6、萊卡公司。精密移液器，吉爾森公司。Forma細胞培養(yǎng)箱，美國Forma公司。全自動高壓滅菌鍋，日本SANYO公司。超凈工作臺，蘇州凈化設備廠。24孔培養(yǎng)板，Costa公司。    12  藥物對H2O2所致HUVECs氧化損傷的影響    121  HUVECs的培養(yǎng)及氧化損傷模型的建立5  HUVECs按常規(guī)方法復蘇后接種于40 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37、95% O2、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底后，加入0.25%胰蛋白酶37 消化23 min，

7、用新生牛血清終止消化。將細胞懸液移入離心管，1 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，用新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液重新懸浮細胞，將細胞濃度調整為1×108 L-1的細胞懸液，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長滿單層融合后，棄去上清，以含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使其同步化生長，即可用于試驗。接種于24孔板的HUVECs同步化生長后，加入含有終濃度為200 mol·L-1 H2O2的無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，作用24 h。    122  實驗分組  （1)正常對照組：無血清的RPMI 1

8、640培養(yǎng)液；（2）模型組：無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液加200 mol·L-1  H2O2作用24 h；（3）丹參注射液組：加入含有丹參注射液終質量濃度為3.0 g·L-1的培養(yǎng)液預孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（4）丹酚酸B低劑量組：加入含有丹酚酸B終質量濃度為1×10-6 g·L-1的培養(yǎng)液預孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（5）丹酚酸B中劑量組：加入含有丹酚酸B終質量濃度為1×10-5 g·L-1的培養(yǎng)液

9、預孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（6）丹酚酸B高劑量組：加入含有丹酚酸B終質量濃度為1×10-4g·L-1的培養(yǎng)液預孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h。    123  細胞形態(tài)學觀察及生化指標測定  各組HUVECs經(jīng)H2O2處理24 h后，于相差倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學變化，并檢測培養(yǎng)液中LDH、NO、MDA含量。    13  HUVECs CD54表達的測定方法 &

10、#160;  將HUVECs按1×10-4ml-1的密度接種于預先鋪有玻片（5 mm×5 mm）直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中4塊玻片。37、95% O2、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞長至80%融合后吸去上清，以含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使其同步化生長，即可用于實驗。    將長滿細胞的涂片從培養(yǎng)皿中取出，置于冰丙酮（100%）中固定10 min，晾干。將固定好的玻片用502膠固定于載玻片上，放入4冰箱中備用。取出4冰箱中的載玻片，用PBS潤洗1 min，晾干。30% H2O2  1份+純甲醇50份混合

11、，將載玻片置于其中浸泡30 min，以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水潤洗3次，晾干。滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體。滴加Rabbit Anti CD54抗體，稀釋度為1100，4過夜,PBS潤洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗兔IgG，濕盒中37 20 min，PBS潤洗3次，每次2 min。加試劑SABC，37 20 min，PBS潤洗4次，每次5 min。使用DAB試劑盒顯色，取1 ml蒸餾水加試劑A、B、C各1滴，混勻后加至載玻片，室溫顯色，鏡下控制反應時間530 min，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。  &#

12、160; 免疫組化染色陰性對照：用PBS代替Rabbit Anti CD54抗體4過夜，其余步驟同上。    每張切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)40×40下，隨機選取10個視野，計算平均單個視野CD54陽性細胞數(shù)。    14  HUVECs與嗜中性多形核白細胞（PMN）黏附率的測定    PMN的分離6：按文獻所述方法將分離所得的PMN用無血清的RPMI 1640混懸，調整細胞濃度為5×108  L-1，備用。    15  統(tǒng)計學處理

13、    所得數(shù)據(jù)用 SPSS軟件進行統(tǒng)計學處理，結果進行Studentst檢驗。                                 2  結    果    21 

14、HUVECs細胞形態(tài)學觀察    正常對照組HUVECs細胞呈棱形、三角形或多角形，融合成片后的細胞呈鵝卵石狀鑲嵌排列。經(jīng)H2O2處理后的模型組，可見細胞體積縮小，細胞間隙明顯增寬，細胞皺縮成球形，有的細胞腫脹、變圓，折光率下降，多數(shù)細胞從培養(yǎng)瓶壁脫落而懸浮在培養(yǎng)液中，部分已經(jīng)自溶。經(jīng)丹酚酸B預處理的HUVECs能明顯地減輕H2O2對細胞形態(tài)學的改變，大部分細胞仍成片貼壁生長，細胞間隙無明顯改變，部分細胞折光率降低，無明顯的細胞皺縮、腫脹、變圓的現(xiàn)象。因此，丹酚酸B對H2O2 處理所導致的HUVECs氧化損傷具有一定的保護作用。見圖1。  &#

15、160; 22  丹酚酸B對H2O2所致HUVECs 上清液中LDH含量、NO釋放及MDA生成的影響    H2O2損傷使得HUVECs上清液中LDH增多，與正常對照組比較，差異顯著（P<0.01）。丹酚酸B中、高劑量組可明顯減少氧化損傷所致上清液中LDH的增多（P<0.05，P<0.01）。見表1。    經(jīng)過H2O2處理后，HUVECs釋放的NO減少，與正常對照組比較，差異顯著（P<0.05）。丹酚酸B高劑量組能有效改善損傷細胞NO的釋放（P<0.05）。   

16、 另外，由于H2O2的氧化損傷，使得HUVECs上清液中脂質過氧化產物MDA的生成明顯增多，與正常對照組比較，差異顯著（P<0.01），丹酚酸B高劑量組能抑制MDA的釋放，使HUVECs脂質過氧化程度降低（P<0.05）。圖1  丹酚酸B對H2O2處理的HUVECs形態(tài)學的影響表1  丹酚酸B對H2O2所致HUVECs上清液中LDH含量、NO釋放及MDA生成的影響 HUVECs經(jīng)過H2O2處理后，CD54的表達明顯升高，與正常對照組比較，有顯著性差異（P<0.01），并且，隨著時間的延長，陽性細胞數(shù)有增多的趨勢（數(shù)據(jù)未顯示）。經(jīng)丹酚酸B 1×10

17、-4、1×10-5預處理的HUVECs，其CD54的表達有所抑制，與模型組比較，差異顯著（P<0.05，P<0.01）。    2.4  丹酚酸B對HUVECs與黏附率的影響    HUVECs經(jīng)過H2O2處理后，CD54表達增加的同時，PMN與HUVECs的黏附率也有所升高，與正常對照組比較，有顯著性差異（P<0.01），并且，隨著時間的延長，PMN的黏附率也相應增加。經(jīng)丹酚酸B 1×10-4、1×10-5預處理的HUVECs，其與PMN的黏附減少，與模型組比較，差異顯著（P

18、<0.05）。    3  討    論    目前，已有研究表明，血管內皮細胞不僅僅是作為血液與血管間的生理屏障而存在，還能分泌多種活性物質而對心血管系統(tǒng)進行調節(jié)。心臟一旦供血供氧不足，首先受到影響的感受器就是血管內皮細胞。正常的內皮功能一旦受到破壞，就可通過多種途徑反過來影響心肌缺血病程的發(fā)展。    血管內皮源性活性氧（ROS）的激活增多以及ROS所介導的信號轉導，首先是在觀察缺血再灌注損傷的病變過程中發(fā)現(xiàn)的7。在缺血再灌注導致血管內皮細胞功能損傷的機制

19、中，內皮細胞的氧化性損傷是最主要的原因之一。內皮細胞所產生的ROS主要包括O-2、H2O2、ONOO-、NO和OH-。過氧化氫作為活性氧家族中的一員8 ,可直接作用于膜脂質,形成脂質過氧化物,從而使MDA 生成增加,質膜通透性增加,外鈣內流增多,LDH 漏出也增多;H2O2還能通過抑制Na+K+ATP酶活性,使胞內鈣不能排出,導致鈣超載,并且H2O2可直接損傷內質網(wǎng)及線粒體鈣轉移系統(tǒng),使其喪失緩沖調節(jié)細胞內鈣的能力。異常升高的鈣可能通過啟動黃嘌呤黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)或花生四烯酸系統(tǒng)產生氧自由基及其他細胞毒物質,并可加劇線粒體功能障礙,使氧化磷酸化紊亂,導致內皮細胞損傷。  &#

20、160; 本實驗中在采用200 mol·L-1 H2O2處理后，HUVECs培養(yǎng)液中LDH的含量顯著增多，MDA的釋放量也明顯增加，這說明HUVECs確實受到了H2O2的損傷，并且脂質過氧化反應程度增加。與此同時，HUVECs培養(yǎng)液中NO的含量明顯減少，這表明血管內皮功能出現(xiàn)紊亂。本實驗結果表明，丹酚酸B可以降低HUVECs損傷后LDH的釋放，減輕脂質過氧化程度，并有效調節(jié)NO的釋放，此結果與在大鼠身上獲得的結果相符合，進一步驗證了丹酚酸B確實對血管內皮系統(tǒng)具有保護性調節(jié)作用。有研究表明，丹酚酸B具有較高的清除自由基活性,該物質所表現(xiàn)出來的治療心、腦血管疾病的作用可能與其抗自由基活性

21、有關9。而本實驗中丹酚酸B所顯示出的對H2O2所致的內皮細胞氧化性損傷的拮抗作用印證了上述結論。    近些年來的基礎與臨床研究表明,炎癥反應在缺血性心臟病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關重要的作用。無論是在充血性或是缺血性的心肌疾病中，都伴有標志炎癥反應的血管內皮細胞黏附分子表達的上調。    在心肌缺血尤其是在缺血后再灌注損傷過程中，中性粒細胞等炎癥細胞與血管內皮細胞、心肌細胞發(fā)生的黏附作用可通過多種機制造成血管功能障礙及組織損傷。此外，中性粒細胞是氧自由基產生的一個重要的途徑。缺血期間，中性粒細胞進入缺血組織，細胞因子轉錄和表達增加，白細胞聚集，促使細胞膜脫顆粒，釋放蛋白水解酶，炎癥浸潤線粒體，致使呼吸鏈電子傳遞受損，耗氧量增加，所攝取的氧經(jīng)NADPH氧化酶作用而形成自由基。    CD54為免疫球蛋白超家族黏附分子，在靜息狀態(tài)的血管內皮細胞呈低水平表達，但在適當?shù)沫h(huán)境中如自由基存在條件下，能迅速表達上調。    本實驗中利用H2O2來誘導HUV