液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定人血漿中利培酮的濃度

1、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定人血漿中利培酮的濃度 作者：溫預(yù)關(guān)，廖日房，曾轉(zhuǎn)萍，張明【摘要】 目的 建立測定人血漿中利培酮濃度的反相高效液相串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧檢測法。方法 以迪馬C18反相柱（ 4.6 mm150 mm，5 m）為色譜柱，流動相為甲醇5 mmolL-1甲酸銨（體積比9010），流速為1 mLmin-1，柱溫：25 ，以醋酸乙酯二氯甲烷（體積比41）為提取劑。樣品經(jīng)電噴霧離子源正離子化后，通過三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測對利培酮（m/z 411191）和內(nèi)標拉莫三嗪（m/z 256145）進行測定。結(jié)果 利培酮的高（50 gL-1）、中（25 gL-1）、低（1 gL-1）

2、3個濃度的方法回收率均大于96%，提取回收率均大于85%，日內(nèi)（n=5）、日間（n=3）RSD均小于10%；最低檢測濃度為0.5 gL-1；線性范圍為：0.5100 gL-1,回歸方程為F=55.9562-0.3423，r=0.999（n=8）。結(jié)論 該方法靈敏、準確、簡單、快速，可用于臨床血藥濃度監(jiān)測和藥動學(xué)研究。 【關(guān)鍵詞】 利培酮；血藥濃度；拉莫三嗪；反相高效液相串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧法Abstract:Objective To set up a rapid analysis method of risperidone in plasma by liquid chromatographyelec

3、trospray ionizationtandem mass spectrometry (LCESIMS/MS).Methods Risperidone was extracted from plasma with ethyl acetatedichiloromethane (41).The residues were analyzed on a Dikma diamonsil C18 column (4.6 mm150 mm，5 m) with the mobile phase consisted of methanol and 5 mmolL-1 of ammonium formate (

4、9010).The flow rate was 1 mLmin-1 and column temperature 25 .An Agilent 6410 triple quad mass spectrometer system equipped with an electrospray ionization iontrap source was used as the detector.The system was operated in the selected reaction monitoring mode transmitting m/z 411191 transitions for

5、both the analyte and the lamotrigine internal standard.Results The average recovery and extraction recovery for risperidone were more than 99.6% and 85%，respectively.The values for withinday and betweenday precision and accuracy were less than 10%.The calibration curves were linear over a concentrat

6、ion range of 0.5-100 gL-1(r = 0.998,n=8）.The limits of detection for risperidone was 0.5 gL-1 . Conclusion The method provides a sensitive,accurate,precise and reliable analytical procedure for clinical monitoring of plasma risperidone.Keywords:risperidone；plasma concentration；lamotrigine;LCESIMS/MS

7、利培酮(risperidone)是一種選擇性的單胺能拮抗劑，對5HT2受體、D2受體、1及2受體和H1受體親和力高，臨床上廣泛用于治療精神分裂癥。其檢測方法文獻報道采用高效液相色譜法1-3和LCMS檢測法4-6。為便于進行血藥濃度監(jiān)測和藥動學(xué)研究，本文參照文獻6建立一種以醋酸乙酯和二氯甲烷為混合萃取劑、拉莫三嗪為內(nèi)標的測定人血漿中利培酮濃度的反相高效液相串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧檢測法（LCESIMS/MS）。1 材料2 藥品與試劑 利培酮對照品(西安楊森制藥有限公司，批號：050705，質(zhì)量分數(shù)99.5%)，內(nèi)標物為拉莫三嗪（葛蘭素史克制藥有限公司，批號：051130，質(zhì)量分數(shù)99.5%）。甲醇（色譜純

8、，Agilent公司），水為超純水，甲酸銨（質(zhì)譜純，Agilent公司），其余試劑均為分析純。3 對照品溶液 精密稱取利培酮10.0 mg加甲醇溶解并定容至10 mL，于冰箱4 避光保存，臨用時用甲醇稀釋成所需的濃度。4 內(nèi)標溶液 精密稱取拉莫三嗪適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度為10 mgL-1的溶液，即得。2 方法和結(jié)果2.1 色譜條件 迪馬公司diamonsilTM C18反相色譜柱（4.6 mm150 mm，5 m），流動相為甲醇5 mmolL-1甲酸銨（體積比9010），流速1 mLmin-1，柱溫25 。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式，干燥氣流速10 Lmin-1，干燥氣

9、溫度350 ，霧化氣壓力344.75 Pa，毛細管電壓4 000 V，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM），利培酮檢測離子對為m/z 411191，四級桿停留時間200 ms，裂解電壓180 V，裂解能量28單位，信號放大400 EMV；內(nèi)標物拉莫三嗪檢測離子對為m/z 256145，四級桿停留時間200 ms，裂解電壓130 V,裂解能量40單位，信號放大400 EMV。利培酮和拉莫三嗪的保留時間分別為2.227 min和1.789 min。LCMS/MS圖譜見圖1。2.2 樣品處理 量取0.2 mL含藥血漿加至2.0 mL錐形離心管中，加入 500 gL-1的拉莫三嗪甲醇溶液50 L快速振蕩5 s，

10、加入0.1 molL-1的氫氧化鈉溶液50 L，振蕩5 s。加入1 mL醋酸乙酯二氯甲烷（體積比41），密塞，旋轉(zhuǎn)振蕩30 s，16 000 rmin-1離心5 min，吸取有機層轉(zhuǎn)入1.5 mL錐形離心管內(nèi)，37 真空干燥至干。進樣前加入0.2 mL甲醇溶解，快速振蕩10 s溶解殘渣，吸取2 L進樣。A.空白血漿；B.空白血漿+拉莫三嗪+利培酮(0.5 gL-1)；C.一病人服藥后血漿樣品；1.789 min拉莫三嗪；2.227 min利培酮圖1 利培酮LCMS/MS色譜圖（略）Fig.1 LCMS/MS chromatogram of risperidone 2.3 標準曲線的制備 取空白

11、血漿0.2 mL 8份，分別加入質(zhì)量濃度為0，2，4，10，20，40，100，200，400 gL-1的利培酮對照品溶液，振蕩5 s，使血漿藥物濃度相當于0，0.5，1，2.5，5，10，25，50，100 gL-1，然后按“2.2”項方法處理。經(jīng)LCMS/MS分析，以測得的利培酮峰面積與內(nèi)標峰面積之比（A）作縱坐標，以血漿利培酮濃度()為橫坐標，得到0.5100 gL-1范圍的血漿利培酮濃度標準曲線為：A=55.956 2-0.342 3，r=0.999，權(quán)重系數(shù)w=1/。當RS/N=11時,最低檢測濃度為0.05 gL-1。分別取5個不同來源空白血漿0.2 mL，分別加入2 gL-1的利

12、培酮甲醇溶液50 L，按照“2.2”項操作，測得結(jié)果為(0.560.017) gL-1，RSD為3.00%。2.4 回收率及精密度試驗 按“2.3”項方法分別配制高、中、低3種質(zhì)量濃度（50、25、1 gL-1）的利培酮血漿溶液各15份，分為3批，每批5份，并于每批的標準曲線同時進行，依“2.2”項處理后，取2 L進樣，計算質(zhì)控樣品的測得濃度，與配制濃度對照，求得本法的準確度和精密度。同法以空白血漿，除不加標準系列溶液和內(nèi)標外，按“2.3”項方法處理后，再加入相應(yīng)濃度的利培酮，殘留物以0.2 mL流動相溶解，離心后取2 L進樣，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。結(jié)果見表1。2.

13、5 血漿樣品的穩(wěn)定性試驗 按“2.3”項下方法分別配制高、中、低3種質(zhì)量濃度（50、25、1 gL-1）的3組血漿樣品,分別在室溫（放置6、12、24 h）、長期凍存（-20凍存1、2、3周）和凍融（凍融1、2、3次）條件下分別進行色譜測定，結(jié)果高、中、低3個濃度的RSD分別為2.05%3.40%、2.66%4.78%、1.87%4.65%。表1 回收率與日內(nèi)、日間精密度（略）Tab.1 Recovery rate and withinday and betweenday precision2.6 質(zhì)控樣品的監(jiān)控 按“2.3”項下方法分別配制高、中、低3種濃度（50、25、1 gL-1）血漿樣

14、品，置-20 凍存，備用，此即為質(zhì)控樣品。每天檢測血漿樣品前按照“2.3”項方法制作隨行標準曲線及檢測高、中、低3種濃度雙份質(zhì)控樣品，如果相對回收率均在85%115%（低濃度可在80%至120%之內(nèi)）內(nèi)時，即可認為儀器檢測正常，否則須檢查整個操作過程以及儀器原因。2.7 臨床檢測 104例精神分裂癥患者，男性84例，女性20例，年齡1881歲，平均（3914）歲，連續(xù)服藥14 d單次口服劑量（54）mgd-1，測得穩(wěn)態(tài)血藥濃度為（6.985.50）gL-1，有效病例血藥濃度為（8.705.90）gL-1。3 討論3.1 筆者選用ESI對利培酮分別進行離子掃描和碎片離子掃描，選擇的離子對（m/z

15、 411191）與文獻6報道相似。再對干燥氣流速、干燥氣溫度、霧化氣壓力、毛細管電壓，以及四級桿停留時間、裂解電壓和裂解能量等質(zhì)譜條件進行優(yōu)化。同法優(yōu)化內(nèi)標拉莫三嗪的質(zhì)譜條件。與其他分析方法相比，本文所建立的LCESIMS/MS法顯示了較強的抗干擾優(yōu)勢，由于采用了SRM掃描方法，病人聯(lián)用的其他藥物組分，如氯氮平、氯丙嗪、安坦、地西泮等，均不干擾待測物的測定。32 筆者分別試用乙醚、正己烷、醋酸乙酯、乙腈、二氯甲烷和醋酸乙酯二氯甲烷為提取劑，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)在醋酸乙酯二氯甲烷（體積比41)中的提取率最高，故采用此混合溶劑作為提取劑。33 經(jīng)過對替米沙坦、度洛西汀、拉莫三嗪等藥物的比較發(fā)現(xiàn)，利培酮與拉

16、莫三嗪提取條件相似，且出峰時間相近，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾，與拉莫三嗪聯(lián)用幾率小，故選擇拉莫三嗪為內(nèi)標物。有文獻報道用苯海拉明5、喹硫平6作內(nèi)標，臨床上苯海拉明、喹硫平與利培酮有合并用藥的病例，故改用合并用藥可能性較少的拉莫三嗪作內(nèi)標。檢測定量限為0.5 gL-1低于文獻3報道的4 gL-1。3.4 筆者曾用高效液相聯(lián)用離子阱質(zhì)譜儀檢測血漿中利培酮濃度，檢測一個標本需要血漿1 mL，血漿處理后濃縮10倍，檢測所需時間為5 min，本實驗檢測一個標本僅需0.2 mL，標本處理后無須濃縮，進樣量少（2 L），檢測時間3.2 min，操作簡單、快速，檢測結(jié)果準確、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為臨床常規(guī)利培酮的

17、血藥濃度監(jiān)測及其藥動學(xué)的研究?！緟⒖嘉墨I】 1 AVENOSO A,FACCIOLA G,SALEMI M,et al.Determination of risperidone and its major metabolite 9hydroxyrisperidone in human plasma by reversed-phase liquid chromatography with ultraviolet detectionJ.J Chromatogr B,2000,746(2):173-181.2 BALANT GORGIA AE,Gex FABRY M.Therapeutic drug

18、 monitoring of risperidone using a new,rapid HPLC method: reappraisal of interindividual variability factorsJ.Ther Drug Monit,1999,21(1):105-115.3 RAGGI MA，BUGAMELLI F，SABBIONI C，et al.HPLCDAD determination of plasma levels of the antipsychotic risperidone and its main metabolite for toxicological purposesJ.J Sep Sci，2005，28（3）:245-250.4 ZHANG G，TERRY AV J R，BARTLETT M G.Liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous dete