結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶基因表達在新生鼠缺氧性腦損傷中的作用

1、    結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶基因表達在 新生鼠缺氧性腦損傷中的作用        摘要目的探討結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS) mRNA表達在新生鼠缺氧性腦損傷發(fā)病中的作用。方法取新生SD大鼠25只隨機分組制作模型并行病理鑒定；采用RT-PCR測定腦缺氧1 h，4 h和對照組腦組織細胞內(nèi)cNOS mRNA表達的變化，輝度掃描獲取數(shù)值。結(jié)果鼠缺氧1 h后腦組織中cNOS mRNA表達顯著上升(P<0.01)，4 h組較1 h組下降(P<0.01)，但仍顯著高于

2、對照組(P<0.01)。結(jié)論腦缺氧早期cNOS mRNA表達增加，由其合成的NO對受損腦組織可能起保護作用。關(guān)鍵詞缺氧性腦損傷；一氧化氮合酶；新生鼠分類號R-332文獻標識碼A文章編號1008-8830(2000)01-0021-03 The Role of Intracellular cNOS mRNA Expression in Neonatal Rats with Hypoxic Brain DamageZHENG Da-Tong, LI Shu-Ting, WU Zhong-Kuang, et al.(Department of Prediatric, Second Affili

3、ated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210011)Abstract:Objective To elucidate the role of cNOS mRNA expression in the pathogenesis of hypoxic brain injury after neonatal hypoxia. MethodsRT-PCR was used to measure cNOS mRNA gene expression in brain cells obtained from a neonatal rat model

4、 of hypoxia (n=25). ResultsThe expression of cNOS mRNA in both 1 and 4 hour hypoxic groups was both increased compared with that in the control group (P<0.01), but it was decreased in the 4 hour group compared with the 1 hour group (P<0.01). ConclusionsNO synthesized by cNOS mRNA in the early

5、hypoxic phase might have some protective effect on hypoxic brain tissues.Key words:Hypoxic brain injury; Nitric oxide synthase; Neonatal rat新生兒缺氧性腦病(hypoxic encephalopathy)是圍產(chǎn)期新生兒窒息的主要病理變化，可導(dǎo)致永久性神經(jīng)功能損害, 是圍產(chǎn)期新生兒腦損傷的主要原因。近年來，人們注意到一氧化氮(nitric oxide, NO)在神經(jīng)系統(tǒng)的生理活動中起著重要作用，由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, N

6、OS)催化合成。NOS有3種同工酶，其中神經(jīng)型(nNOS)和內(nèi)皮細胞型(eNOS)同屬于結(jié)構(gòu)型NOS(constitutive NOS, cNOS)，第三種是誘生型NOS(iNOS)1。人們發(fā)現(xiàn)，病理性刺激可導(dǎo)致NO過度生成并起神經(jīng)毒性作用。研究顯示腦損傷時能產(chǎn)生大量的NO。Malinski2用微電極探針發(fā)現(xiàn)鼠腦缺血后NO迅速升高。Kader3在局灶腦缺血后數(shù)分鐘發(fā)現(xiàn)亞硝酸離子，cGMP及NOS活性增加。本課題擬在建立新生鼠缺氧性腦病模型的基礎(chǔ)上，采用半定量RT-PCR技術(shù)測定損傷腦組織內(nèi)cNOS mRNA表達變化，觀察其對腦損傷的影響。1材料與方法1.1材料4的方法將新生SD鼠置于8%O2+

7、92%N21.2實驗方法按Chomczynski5介紹的一步法抽提RNA,測定濃度及純度后逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，經(jīng)DNA擴增反應(yīng)，產(chǎn)物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Polaroid成像，照片光密度掃描，半定量計算cNOS的含量。1.3統(tǒng)計學分析采用方差分析。先進行方差的齊性檢驗，然后在各組份間用q檢驗進行多重比較。2結(jié)果2.1模型檢驗光鏡1 h組變化輕微，腦組織有輕度水腫，細胞體積輕度增大，毛細血管周圍間隙擴張不明顯。4 h組腦細胞明顯水腫，組織疏松，毛細血管周圍空隙明顯。電鏡可見線粒體結(jié)構(gòu)破壞。見1。1缺氧1 h、4 h病理照片F(xiàn)ig 1. Pathological photo of 1 h,

8、 4 h hypoxia2.2cNOS mRNA的表達大鼠1 h和4 h組的cNOS mRNA 表達均較對照組顯著上升(P<0.01)，4 h組較1 h組明顯下降(P<0.01)。見表1，2。2cNOS擴增電泳Fig 2. Electrophoresis of cNOS PCR product表1cNOS mRNA表達半定量值Table 1. Relative value of cNOS mRNA expression in each group組別n半定量值對照組110.74±0.031 h組70.91±0.02*4 h組70.87±0.02*與對照

9、組相比，P<0.013討論NO是一種重要的信使分子，它在血管、免疫尤其神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛的生物學作用。生理條件下，NO是不典型遞質(zhì)或細胞信使，在腦缺血或腦缺血再灌注損傷中具有神經(jīng)保護和神經(jīng)毒性兩種傾向,過量生成或在病理性刺激時能產(chǎn)生神經(jīng)毒性1，6,7。NOS以L-精氨酸(L-Arg)為底物，在NADPH，F(xiàn)MN，F(xiàn)AD及BH4等因子輔助下催化合成NO和L-瓜氨酸。NO性質(zhì)活潑半衰期極短。對NOS及其基因表達變化的研究是對NO進行深入探討的重要環(huán)節(jié)。cNOS以非活性形式存在于某些細胞中，可被相應(yīng)的激動劑迅速激活，激活后酶活力持續(xù)時間很短。cNOS的活力完全依賴鈣及鈣調(diào)蛋白的作用，引起NO短暫釋

10、放。cNOS每次激活合成少量NO，鈣離子濃度下降，cNOS失活；鈣濃度再次升高，cNOS也可被再度激活，生物效應(yīng)以細胞間信息傳遞為主1。NO對腦缺氧的影響是腦損傷研究的一個重點，本實驗組織學變化顯示缺氧1 h的病理改變輕微而4 h的病理改變極為顯著。相應(yīng)的缺氧后腦組織中cNOS mRNA在1 h，4 h時表達均較對照組增加(P<0.01)，但4 h組較1 h組明顯下降(P<0.01)?？梢娙毖踉缙谀X組織中cNOS mRNA表達迅速上升對缺氧腦組織可能起保護作用。這也與以往報道相似7。研究發(fā)現(xiàn)腦損傷早期腦組織中NO急劇上升8，9，由于從cNOS mRNA表達到其所至的cNOS發(fā)揮作用

11、尚有一段時間，故損傷早期(1020 min)腦組織中的NO生成是通過腦細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加達到一定濃度激活了胞內(nèi)靜態(tài)的cNOS，和通過磷酸酶使磷酸化的NOS脫磷酸而間接激活NOS。隨后cNOS基因表達大量增加，共同導(dǎo)致?lián)p傷后早期的NO大量生成。早期生成的NO由于其短暫的特性，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用的可能性較??；相反，它通過NOcGMP途徑使腦血管擴張，增加腦血流，抗血小板聚集，以及抑制多形核白細胞粘附7，9，10，從而起對抗缺氧腦損傷的保護作用9，11。另外，在神經(jīng)元培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，NO供體如果有利于NO+的生成則可能使NMDA受體巰基亞硝酸化，從而使該受體下調(diào)，減輕NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性6，

12、由此發(fā)揮神經(jīng)保護作用。隨著缺氧后腦組織受損，表達cNOS的神經(jīng)元減少，可使cNOS表達下降。這與晚期cNOS mRNA表達下降相符。(本文編輯：黃志強)作者簡介鄭大同，男，1965出生，學士，在職碩士，主治醫(yī)師。作者單位鄭大同（210011南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科）李述庭（210011南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科）吳中匡（210011南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科）高雁翎（200025上海第二醫(yī)科大學瑞金醫(yī)院兒科，上海瑞金二路197號）陳舜年（200025上海第二醫(yī)科大學瑞金醫(yī)院兒科，上海瑞金二路197號）參考文獻1張利群，劉敬忠.一氧化氮合成酶研究進展.國外醫(yī)學分子生物學分冊，1996,

13、18: 3438.2Malinski T, Bailey F, Zhang ZG, et al. Nitric oxide measured by a prophric microsensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlussion. J Cereb Blood Flow Metab, 1993, 13: 355358.3Kader A, et al. Nitric oxide production during focal cerebral ischemia. Stroke, 1993, 24: 4.4Ri

14、ce JE, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurology, 1981, 9: 131.5Chomczynski P, Nicoletta S. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyante-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987, 162:

15、 157159.6Lipton SA, et al. A redox based mechanism for the neuro-protective and neurodestructine effects of nitric oxide and elated nitroso-compounds. Nature, 1993; 364: 626629.7張?zhí)戾a，趙衛(wèi)國，田恒力.NO對兔急性局灶性腦缺血后早期腦水腫和缺血灶的保護作用.急癥醫(yī)學，1995, 4: 133135.8張登海.誘生型一氧化氧合成酶分子生物學進展.國外醫(yī)學分子生物學分冊，1995, 17: 55.9Zhang F, Wig

16、ht JG, Iadecola C. Nitric oxide donors increase blood flow and reduce brain damage in focal ischemia: evidence that nitric oxide is benefical in the early stages of cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 1994, 14: 217226.10Iadecola C, Xu X, Zhang FY, et al. Marked induction of Calcium independent nitric oxide synthase activity after focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow M