異基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡

1、異基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植治療紅斑狼瘡11例臨床分析基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30772014）；教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目（20050315001）；江蘇省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才基金作者單位：210008 南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科通信作者：孫凌云，Email: lingyunsun2001【摘要】 目的 探討異基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）移植治療難治性系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的療效及安全性。方法 血緣相關(guān)供者骨髓中分離培養(yǎng)MSC移植治療11例SLE患者，移植前予環(huán)磷酰胺（CTX）0.81.8g，分23次靜脈輸注，輸注后隔日予MSC移植，移植細(xì)胞數(shù)（1106/kg體重）。評(píng)價(jià)患者

2、移植前后的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查的改變。 結(jié)果 11例SLE患者病程115年，SLEDAI積分12.85.1。8例存在腎臟損害，表現(xiàn)為狼瘡性腎炎，24h尿蛋白定量2045935mg（517.53690mg），其中2例患者為腎功能不全（血肌肝分別為474和153umol/L，GFR 分別為65和45 ml/min），其中5例患者存在低蛋白血癥（17.733g/L）；1例患者合并重度血小板減少和股骨頭壞死；2例患者曾患神經(jīng)精神狼瘡。異基因MSC移植治療SLE后，所有患者無(wú)移植并發(fā)癥?；颊逽LEDAI積分降低為5.83.8（移植后1月，n=9，P0.01），C3升高（移植前 0.500.12g/L，移

3、植后1月0.750.10g/L，n=9）。ANA和ds-DNA抗體滴度降低。24h尿蛋白定量降低為981559mg（移植后1月，n=8），移植后2月（2039517mg vs. 1055689mg，n=5），移植后6月（2577883mg vs. 572117mg，n=4）。5例低蛋白血癥患者血清白蛋白上升，移植后1月（移植前28.06.0 g/L vs. 32.36.6g/L，n=5，p0.021），移植后2月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 30.08.3g/L，n=2，p0.01），移植后4月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 34.49.0g/L，n=2，p0.01）

4、，移植后8月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 36.48.6g/L，n=2，p0.01）。2例腎功能不全患者GFR輕讀上升，其中1例移植后1月肌肝降低為389umol/L。結(jié)論 異基因MSC移植治療難治性SLE有效安全，有利于狼瘡病情緩解。MSC取材方便，擴(kuò)增迅速，輸注安全，經(jīng)濟(jì)。異基因MSC移植治療SLE的長(zhǎng)期療效評(píng)估需進(jìn)一步隨訪?！娟P(guān)鍵詞】骨髓間質(zhì)干細(xì)胞； 移植； 紅斑狼瘡，系統(tǒng)性Clinical report on allogenic bone marrow derived mesenchymal stem cells transplantation for refractor

5、y systemic lupus erythematosusDepartment of Rheumatology & Immunology, the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Jiangsu 210008, China P.R.Corresponding author: SUN Ling-yun, Email: lingyunsun2001Objective: To explore the clinical efficacy and safety of allogenic bone

6、marrow derived mesenchymal stem cells transplantation (MSCT) in patients with severe and treatment-refractory systemic lupus erythematosus(SLE). Methods: Eleven patients with refractory SLE, nine female and two male aged 1641(mean 257.6 years), were enrolled in the study and gave consent to the stud

7、y which was approved by the Ethics Committee of the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School. The bone marrow of related healthy donors were aspirated and the mesenchymal stem cells(MSCs) were expanded in vitro. Each patients were given MSCs 1106/kg body weight introvenous

8、ly. Before MSCT, all patient were given cyclophosphamide(CTX) 4001800mg divided by two to three times. The clinical manifestations and laboratory tests were compared before and after MSCT. Results: The eleven patients were followed up for one to thirteen months after MSCT. All patients have not deve

9、loped transplantation related complications. The Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) score decreased from 12.85.1 to 5.83.8 one month after MSCT(n=9, p0.01). Urine protein concentration decreased from 1985.18892.49 mg/24h to 962.20525.99 mg/24h one month after MSCT (p0.01, n

10、=10). Five patients that were followed up for six months, the urine protein concentration decreased significantly (523.68147.55 mg/24h vs. 2477.68796.50mg/24h, n=5, p0.01). Five patients with hypoproteinemia, the serum albumin increased gradually. One month after MSCT (28.06.0 g/L vs. 32.36.6g/L, n=

11、5, p=0.021), two months after MSCT (23.3.08.0 g/L vs. 30.08.3g/L, n=2), four months after MSCT (23.3.08.0 g/L vs. 34.49.0g/L, n=2), eight months after MSCT (23.3.08.0 g/L vs. 36.48.6g/L, n=2). Complement C3 increased from 0.500.12 g/L to 0.750.10 g/L(n=9, p0.01) one month after MSCT. The anti-nuclea

12、r antibody (ANA) and anti-dsDNA antibody titer decreased after MSCT. In two patients with chronic renal failure, the serum creatinine fell down mildly. Conclusion: Treating refractory SLE with allogenic MSCT is effective and safe. However, further observation is required to evaluate long term effica

13、cy.Key words: bone marrow mesenchymal stem cells; transplantation; lupus erythematosus, systemic 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是多因素參與的特異性自身免疫病，通過(guò)大量自身抗體和免疫復(fù)合物造成組織損傷。迄今為止，盡管新型免疫抑制劑如霉酚酸酯、來(lái)氟米特和生物制劑對(duì)SLE有一定的療效，但糖皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒藥物環(huán)磷酰胺(CTX)仍是治療SLE最有效的方法，但仍有20%-30%患者無(wú)效。造血干細(xì)胞移植（HSCT）治療SLE是近年來(lái)開(kāi)展的又一療法，臨床取得一定效果，但也存在許多問(wèn)題，如自體HSCT高復(fù)發(fā)和異體HSC

14、T的預(yù)處理風(fēng)險(xiǎn)及移植物抗宿主?。℅VHD）等，難以作為常規(guī)治療。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞（HSCs）之外的另一類(lèi)干細(xì)胞，是骨髓微環(huán)境的重要組成部分。隨著對(duì)MSC認(rèn)識(shí)的不斷深入，還發(fā)現(xiàn)MSC具有低/無(wú)免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，可通過(guò)T、B淋巴細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）等免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用。目前研究表明SLE骨髓間MSCs存在缺陷，且參與疾病的發(fā)生1，因此我們嘗試用異基因MSC移植治療SLE并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步研究。我們?cè)谟卯惢蚬撬鐼SCs移植治療狼瘡鼠（MRL/lpr）有效的基礎(chǔ)上，已對(duì)11例重癥難治性系統(tǒng)性紅斑狼瘡采用異基因骨髓MSC移植治療，總結(jié)如下。1 資料和方法1

15、.1 病例資料11例SLE患者于2007年3月至2008年4月于我院行異基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植，均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院（ACR）1997年修訂的SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，其中女性9例，男性2例，平均年齡25歲（1641歲）。所有患者均為積極藥物治療仍反復(fù)發(fā)作者。11例SLE患者病程115年，狼瘡活動(dòng)積分（SLEDAI）11.75.1。其中10例存在腎臟損害，表現(xiàn)為狼瘡性腎炎，24h尿蛋白定量1989842mg（5183690mg），其中2例患者為腎功能不全（血肌肝分別為474和153umol/L，GFR 分別為65和45 ml/min），其中5例患者存在低蛋白血癥（17.733g/L）；1例患者合并重度血

16、小板減少和股骨頭壞死；2例患者曾患神經(jīng)精神狼瘡。具體臨床和實(shí)驗(yàn)室資料見(jiàn)表1。本研究遵循程序符合本單位負(fù)責(zé)人體試驗(yàn)委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到該委員會(huì)的批準(zhǔn)，取得所有患者的知情同意。1.2 方法1.2.1 異基因骨髓MSCs采集、分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)：移植前取相關(guān)供者骨髓3045ml，肝素抗凝，生理鹽水稀釋至2倍所取骨髓量，緩慢加入預(yù)先加有等體積的淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll，1.077）分離液面上，2000轉(zhuǎn)離心30分鐘，收集中間層細(xì)胞，洗滌后以5106細(xì)胞/ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶含5ml 低糖DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），置37、5 %CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

17、2448h后換液，去掉非貼壁細(xì)胞，以后每3d以低糖DMEM完全培養(yǎng)液換液1次。培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞90融合時(shí)，用0.25胰蛋白酶消化，按13的比例傳代，擴(kuò)增后的MSCs計(jì)數(shù)，加入5人體白蛋白溶液中靜脈回輸。低糖DMEM，胎牛血清和0.25胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。1.2.2 移植方案：移植前予環(huán)磷酰胺（CTX）0.81.8g，分23次靜脈輸注，輸注后隔日予MSC移植，移植細(xì)胞數(shù)（1106/kg體重）。移植前用0.25胰蛋白酶消化，按13的比例傳代，擴(kuò)增后的MSCs計(jì)數(shù)，加入5人體白蛋白溶液中靜脈回輸。移植前給予甲基強(qiáng)的松龍40mg預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)。1.2.3療效評(píng)價(jià)：移植后平均隨訪時(shí)間為6月（1

18、11個(gè)月），對(duì)移植前后患者臨床表現(xiàn)改善請(qǐng)況和實(shí)驗(yàn)室檢查如血清抗核抗體（ANA）、抗雙鏈DNA抗體（ds-DNA）、IgG滴度、補(bǔ)體C3、24小時(shí)尿蛋白定量、腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）、血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)進(jìn)行比較，以及移植相關(guān)并發(fā)癥等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)分析，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2 結(jié)果2.1 MSC移植后的療效和隨訪：移植后，患者SLEDAI積分降低為5.63.4（移植后1月，n=11，P0.01）（圖1）。24h尿蛋白定量降低為1118700mg（移植后1月，n=10，P=0.02

19、），移植后2月（2039517mg vs. 1055689mg，n=5），移植后6月（2577883mg vs. 572117mg，n=4）（圖2、3）。5例低蛋白血癥患者血清白蛋白上升，移植后1月（移植前28.06.0 g/L vs. 32.36.6g/L，n=5，p0.021），移植后2月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 30.08.3g/L），移植后4月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 34.49.0g/L），移植后8月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 36.48.6g/L）。11例患者中3例患者ds-DNA抗體陽(yáng)性，移植后1月無(wú)變化；1例患者移植后1月，A

20、NA滴度由1：2000降為1：500；1例患者移植后2月，ANA滴度由1：2000降為1：100，2例患者移植后1月，ANA滴度由1：1000降為1：500。移植后患者血清補(bǔ)體C3升高（移植前 0.500.12g/L，移植后1月0.750.10g/L，n=9）。2.2 MSC移植并發(fā)癥：4例患者在接受CTX后出現(xiàn)惡心、嘔吐。所有移植患者輸注異基因MSC時(shí)均無(wú)并發(fā)癥。2.3 MSC移植適應(yīng)癥：異基因骨髓MSC移植主要用于難治性SLE，常規(guī)激素、免疫抑制劑控制欠佳，如狼瘡性腎炎、肺動(dòng)脈高壓、重度血細(xì)胞減少，對(duì)終末期器官功能衰竭患者不合適。3 討論 本文首次報(bào)道異基因骨髓MSC體外分離、擴(kuò)增后移植成

21、功治療SLE。在我國(guó)SLE患病率約0.1，近年來(lái)對(duì)SLE在發(fā)病機(jī)制方面進(jìn)行了多方面的研究，T、B淋巴細(xì)胞以及骨髓干細(xì)胞的異常在疾病發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后起著非常重要的作用。對(duì)于治療則仍是單行激素或聯(lián)合CTX、霉酚酸脂（MMF）、硫酸羥基氯喹等免疫抑制劑，但仍有20左右的患者病情進(jìn)展難以控制。近年來(lái)，造血干細(xì)胞移植（HSCT）治療難治性SLE獲得了較好的效果，但是，自體HSCT存在高復(fù)發(fā)率，異體HSCT存在高死亡率，難以在臨床廣泛開(kāi)展。長(zhǎng)期應(yīng)用大劑量激素、免疫抑制劑治療造成的繼發(fā)感染、骨質(zhì)疏松、高血壓、糖尿病等并發(fā)癥將給患者帶來(lái)極大的危害和負(fù)擔(dān)。尋求一種能控制病情、安全、經(jīng)濟(jì)的治療方法將給患者帶來(lái)新的

22、希望，而MSC獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能和安全特性使之成為可能。MSC是存在于骨髓中的一類(lèi)干細(xì)胞，能分化為分泌多種細(xì)胞因子、黏附分子的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，近來(lái)多項(xiàng)研究表明MSC具有以下特點(diǎn)：來(lái)源廣泛、多向分化潛能、體外易擴(kuò)增傳代并保持穩(wěn)定的表型、無(wú)免疫原性、具有造血支持和免疫調(diào)節(jié)作用和誘導(dǎo)免疫耐受。體內(nèi)外研究均表明MSC通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-)、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-7、IL-10、干擾素(IFN-)、等來(lái)誘導(dǎo)免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)的作用、達(dá)到抑制活化T細(xì)胞增殖的作用2。由于MSC沒(méi)有MHC限制性，在異體MSC移植時(shí)無(wú)排斥反應(yīng)發(fā)生，而且MSC在分化成其它細(xì)胞類(lèi)型時(shí)仍保留其特性。

23、根據(jù)MSC多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)節(jié)的特性，臨床上已將其應(yīng)用于組織工程、大劑量化療后造血支持、治療移植物抗宿主病(GVHD)等3-5。近年來(lái)對(duì)腎損傷疾病的研究顯示MSC輸注可促進(jìn)腎損傷的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)，MSC可遷移至受損的腎臟并分化為腎小管上皮細(xì)胞，加快腎小管細(xì)胞增殖速度6。 早有學(xué)者提出SLE是“干細(xì)胞病”的觀點(diǎn)7，國(guó)內(nèi)外以及我們相關(guān)研究表明狼瘡動(dòng)物模型或SLE患者骨髓MSC存在缺陷。Papadaki等8研究表明SLE患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞存在缺陷，通過(guò)Fas介導(dǎo)CD34細(xì)胞凋亡致CD34細(xì)胞減少；Ikehara 9報(bào)道將正常鼠骨髓（含MSC和少量T細(xì)胞）直接注射入狼瘡鼠（MRL/lpr

24、）骨髓腔內(nèi)，能使狼瘡鼠存活2年以上并無(wú)臨床癥狀發(fā)生，也無(wú)GVHD發(fā)生。我們前期研究發(fā)現(xiàn)狼瘡MSC存在異常1,10，表現(xiàn)為：1）SLE患者骨髓MSC體外生長(zhǎng)較正常人緩慢，存在早衰，不能長(zhǎng)期傳代；2）SLE患者M(jìn)SCs分泌細(xì)胞因子如IL-6、IL-7減低；3）狼瘡鼠（NZBW/F1）MSCs使Th1/Th2平衡向Th2偏移，推測(cè)MSC的異?？赡茉赟LE的發(fā)病中起重要作用，SLE患者M(jìn)SC缺陷為原發(fā)性而非繼發(fā)性。我們將人MSC輸注給狼瘡鼠（MRL/lpr）的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)狼瘡鼠尿蛋白下降，病情活動(dòng)相關(guān)指標(biāo)得到了改善，腎臟病理變化明顯減輕, 且無(wú)排斥反應(yīng)發(fā)生11；因此，我們推測(cè)MSC移植治療SLE患者有

25、效，而且認(rèn)為SLE患者自體MSC移植不合適，應(yīng)選擇異體（異基因）MSC移植。 自2007年3月2008年4月，我們已對(duì)12例SLE患者行MSC移植。病例選擇，傾向于難治狼瘡性腎炎，這些患者大都具有大量蛋白尿，2例合并慢性腎功能不全，正規(guī)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療半年以上無(wú)效。結(jié)果顯示，MSC移植能顯著改善SLE病情，降低血中抗體滴度，改善狼瘡性腎炎。從圖？中可看出，患者24小時(shí)尿蛋白定量在移植后1個(gè)月時(shí)下降趨勢(shì)較明顯，之后有輕度回升，在隨訪6個(gè)月至1年時(shí)，尿蛋白均下降到較低水平。筆者認(rèn)為小劑量CTX在早期尿蛋白降低中起一定作用，而MSC在長(zhǎng)期療效中發(fā)揮重要作用。其中一例患者腎損較重，移植前血Cr

26、474 umol/L，移植后1個(gè)月，血Cr降低為389 umol/L，血紅蛋白也有顯著上升，但患者因呼吸道感染血Cr上升至556 umol/L，給予第2次移植后血Cr降至480umol/L，進(jìn)一步證實(shí)了MSC移植后的療效。我們對(duì)移植前后患者血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)異基因MSC移植可上調(diào)SLE 患者CD4+ Foxp3+ T細(xì)胞水平，推測(cè)可能是MSC移植治療SLE有效的機(jī)制之一。 國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)MSC治療SLE報(bào)道，雖國(guó)內(nèi)可見(jiàn)MSC聯(lián)合HSC移植治療SLE的相關(guān)報(bào)道12，而該作者是利用MSC造血支持作用來(lái)支持大劑量化療后的造血功能恢復(fù)，而筆者利用的是其獨(dú)特的免疫抑制特性達(dá)到治療目的。

27、總之，本初步研究表明異基因骨髓MSC取材方便，擴(kuò)增迅速，輸注安全，短期療效較好。下一步將進(jìn)一步觀察并繼續(xù)深入開(kāi)展此項(xiàng)研究后加以評(píng)估，以及選擇不同類(lèi)型的難治性SLE患者（如合并肺動(dòng)脈高壓），改變MSC輸注途徑，通過(guò)多次移植等來(lái)觀察MSC療效，為今后MSC治療SLE及其他免疫病奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1 Sun LY, Zhang HY, Feng XB, et al. Abnormality of bone marrow-derived stem cell in patients with systemic lupus erythematosus Lupus, 2007,16:121-128.2 Ag

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