免疫組織化學(xué)原理及應(yīng)用2012級

1、 孫勤暖l組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)、生物化學(xué)、組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)、生物化學(xué)、免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)l組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)與組織化學(xué)區(qū)別：組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)與組織化學(xué)區(qū)別：l 1、組織、細(xì)胞學(xué)是研究形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能、組織、細(xì)胞學(xué)是研究形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的關(guān)系l 2、組織化學(xué)是研究組織細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成、組織化學(xué)是研究組織細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分及其含量或酶的存在及其活性分及其含量或酶的存在及其活性l l組織化學(xué)概念組織化學(xué)概念: = 細(xì)胞化學(xué)細(xì)胞化學(xué)l 是運用物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物是運用物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等原理，對組織與細(xì)胞化學(xué)成分或酶活性學(xué)等原理，對組織與細(xì)胞化學(xué)成分或酶活性進行定性、定位

2、和定量的研究的科學(xué)。進行定性、定位和定量的研究的科學(xué)。l傳統(tǒng)組織化學(xué)概念：傳統(tǒng)組織化學(xué)概念：l 是運用物理、化學(xué)是運用物理、化學(xué)l 免疫學(xué)、電鏡技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)免疫學(xué)、電鏡技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展免疫組織化學(xué)、免疫電鏡組織化學(xué)、原位展免疫組織化學(xué)、免疫電鏡組織化學(xué)、原位雜交技術(shù)等雜交技術(shù)等l廣義組織化學(xué)包括：廣義組織化學(xué)包括：l 傳統(tǒng)組織化學(xué)、傳統(tǒng)組織化學(xué)、l 免疫組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、l 電鏡組織化學(xué)、電鏡組織化學(xué)、l 免疫電鏡組織化學(xué)、免疫電鏡組織化學(xué)、l 原位雜交組織化學(xué)等原位雜交組織化學(xué)等l生物化學(xué)與組織化學(xué)區(qū)別：生物化學(xué)與組織化學(xué)區(qū)別：l生物化學(xué)：生物化學(xué)：l 1、運用化

3、學(xué)原理分析細(xì)胞的組成成分以及這些、運用化學(xué)原理分析細(xì)胞的組成成分以及這些成分在生命過程中的化學(xué)反應(yīng)。成分在生命過程中的化學(xué)反應(yīng)。l 2、生物化學(xué)將組織細(xì)胞制成勻漿研究（結(jié)構(gòu)被、生物化學(xué)將組織細(xì)胞制成勻漿研究（結(jié)構(gòu)被破壞）破壞） l 3、生物化學(xué)的化學(xué)反應(yīng)在試管內(nèi)或容器內(nèi)、生物化學(xué)的化學(xué)反應(yīng)在試管內(nèi)或容器內(nèi)l 4、生物化學(xué)的化學(xué)反應(yīng)結(jié)果觀察不用顯微鏡、生物化學(xué)的化學(xué)反應(yīng)結(jié)果觀察不用顯微鏡l 5、產(chǎn)物需要分離、提純、鑒定。、產(chǎn)物需要分離、提純、鑒定。l組織化學(xué)：組織化學(xué)：l 運用化學(xué)反應(yīng)原理在組織細(xì)胞內(nèi)對組織細(xì)胞運用化學(xué)反應(yīng)原理在組織細(xì)胞內(nèi)對組織細(xì)胞化學(xué)成分進行定性、定位和定量的研究。產(chǎn)物多化學(xué)成

4、分進行定性、定位和定量的研究。產(chǎn)物多需要顯色劑顯示。如：利用酶的特性需要顯色劑顯示。如：利用酶的特性l一、免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理：一、免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理： 免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用抗原免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用抗原與抗體能特異性結(jié)合的基本特點，與抗體能特異性結(jié)合的基本特點，通過顯示劑的顯示通過顯示劑的顯示,確定某些抗原或確定某些抗原或抗體的有無或其存在的位置，來研抗體的有無或其存在的位置，來研究某事物的特性。究某事物的特性。二、組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)的區(qū)別二、組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)的區(qū)別l 組織化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)技術(shù)： （HE 特殊染色）特殊染色）l 通過應(yīng)用某些能與組織、細(xì)胞化學(xué)

5、成通過應(yīng)用某些能與組織、細(xì)胞化學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑，定位的顯示組織、分特異性結(jié)合的顯色試劑，定位的顯示組織、細(xì)胞的特殊化學(xué)成分的一門技術(shù)。細(xì)胞的特殊化學(xué)成分的一門技術(shù)。l 優(yōu)點：既保存原有的形態(tài)改變又顯示特殊優(yōu)點：既保存原有的形態(tài)改變又顯示特殊化學(xué)成分達到形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合?；瘜W(xué)成分達到形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合。l l （不敏感、特異性差）（不敏感、特異性差）二、組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)的區(qū)別二、組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)的區(qū)別l l免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)：l 將抗原、抗體反應(yīng)的特異性與組織化學(xué)將抗原、抗體反應(yīng)的特異性與組織化學(xué)反應(yīng)的可見性結(jié)合在一起，形成了反應(yīng)的可見性結(jié)合

6、在一起，形成了免疫免疫組織組織化學(xué)技術(shù)?；瘜W(xué)技術(shù)。l 優(yōu)點：優(yōu)點：l 1、形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合（微量）、形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合（微量）l 2、檢測的成分更加廣泛、敏感、特異性、檢測的成分更加廣泛、敏感、特異性更強更強l三、三、免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展l免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 抗體酶標(biāo)法抗體酶標(biāo)法 l多克隆抗體技術(shù)多克隆抗體技術(shù) 單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)l ABC法、法、S-P法等法等 原位雜交及原位原位雜交及原位PCR等免疫組化法。等免疫組化法。l四、四、免疫組織化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點免疫組織化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點l1、特異性強、特異性強l2、敏感性高、敏感性高l3、定位準(zhǔn)確、定位

7、準(zhǔn)確l4、形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合、形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合l 五、五、 免疫組織化學(xué)方法免疫組織化學(xué)方法l 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)lImmunohistochemistry Immunocytochemistry1、特異性的抗原和特異性的抗體（結(jié)合）、特異性的抗原和特異性的抗體（結(jié)合）2、顯色系統(tǒng)、顯色系統(tǒng)顯示劑：酶顯示劑：酶,金屬原子金屬原子, 熒光分子熒光分子 同位素分子同位素分子酶底物：酶底物：DAB(3,3-二胺基聯(lián)苯胺二胺基聯(lián)苯胺) AEC(3-氨基氨基-9-乙基卡巴唑乙基卡巴唑) 堅牢藍，堅牢紅堅牢藍，堅牢紅.（一）直接法（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）酶標(biāo)法（一步法） 將酶（將酶（

8、HRP）標(biāo)記在特異抗體上，）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷方法簡捷, 需要標(biāo)記所有抗體需要標(biāo)記所有抗體 Ag Ab-HRP. 底物底物-顯色劑顯色顯色劑顯色（一）直接法（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）酶標(biāo)法（一步法） 將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷方法簡捷, 需要標(biāo)記所有抗體需要標(biāo)記所有抗體.AgAb-HRP（一）直接法（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）酶標(biāo)法（一步法） 將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷方法簡捷, 需要標(biāo)記所有抗體需要標(biāo)記所有抗體.AgAb-HRP AgAb-HRP（一）直接法（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）酶標(biāo)法（一步

9、法） 將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷方法簡捷, 需要標(biāo)記所有抗體需要標(biāo)記所有抗體.AgAb-HRP 底物底物-顯色劑顯色顯色劑顯色 AgAb-HRP（一）直接法（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）酶標(biāo)法（一步法） 將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷方法簡捷, 需要標(biāo)記所有抗體需要標(biāo)記所有抗體.AgAb-HRP 底物底物-顯色劑顯色顯色劑顯色 AgAb-HRP底物底物-顯色劑顯色劑顯色顯色 需要標(biāo)記所有抗體需要標(biāo)記所有抗體（二）間接法（二）間接法:二步法二步法 將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在第二抗體上，）標(biāo)記在第二抗體上，. Ag Ab1

10、 Ab2-HRP 底物底物-顯色劑顯色顯色劑顯色 二步法二步法, 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣; 不需標(biāo)記一不需標(biāo)記一抗抗,只需標(biāo)記幾個種屬的二抗即可只需標(biāo)記幾個種屬的二抗即可（二）間接法（二）間接法:二步法二步法 將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在第二抗體上，）標(biāo)記在第二抗體上，.Ag Ab1 Ag-Ab1 （二）間接法（二）間接法:二步法二步法 將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在第二抗體上，）標(biāo)記在第二抗體上，.Ag Ab1 Ab2-HRP Ag-Ab1 -Ab2-HRP （二）間接法（二）間接法:二步法二步法 將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在第二抗體上，）標(biāo)記在第二抗體上，.Ag Ab1 Ab2-HRP 底物底物-顯

11、色劑顯色顯色劑顯色 Ag-Ab1 -Ab2-HRP -底物底物-顯色劑顯色劑顯色顯色 二步法二步法, 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣; 不需標(biāo)記一抗不需標(biāo)記一抗,只只需標(biāo)記幾個種屬的二抗即可需標(biāo)記幾個種屬的二抗即可l Envision Systeml 是將二抗是將二抗 和和 HRP 通過一個多聚葡聚通過一個多聚葡聚l糖骨架連接成一個多聚體，多聚體中沒有糖骨架連接成一個多聚體，多聚體中沒有生物素參與，所以它不受內(nèi)源性生物素的生物素參與，所以它不受內(nèi)源性生物素的影響，使背景染色降低。影響，使背景染色降低。l特點：敏感、省時、方便、背景低特點：敏感、省時、方便、背景低（三）三步法（三）三步法:將酶（將酶（HR

12、P）標(biāo)記在復(fù)合物上）標(biāo)記在復(fù)合物上 1、PAP法法 （三）三步法（三）三步法:將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在復(fù)合物上）標(biāo)記在復(fù)合物上 1、PAP法法 2、ABC法法 （三）三步法（三）三步法:將酶（將酶（HRP）標(biāo)記在復(fù)合物上）標(biāo)記在復(fù)合物上 1、PAP法法 2、ABC法法 3、S-P法法鏈霉菌抗生物素蛋白鏈霉菌抗生物素蛋白抗原一抗二抗生物素酶組織組織生物素生物素卵白素卵白素鏈霉菌抗生鏈霉菌抗生物素蛋白物素蛋白4、 四步法、五步法四步法、五步法 5、多重標(biāo)記多重標(biāo)記: 在同一組織或細(xì)胞上顯示兩種以上在同一組織或細(xì)胞上顯示兩種以上抗原?？乖?。 SP法法 ABC法法 48倍倍 SP法法 PAP法法 2

13、550倍倍 l一、取材：一、取材：l二、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、二、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、l 切片、切片、l 撈片撈片、烤片、脫蠟、水化、烤片、脫蠟、水化l三、玻片處理：防脫片膠三、玻片處理：防脫片膠l APES Poly-L-Lysinl三、防脫片處理步驟三、防脫片處理步驟l（一）載玻片和蓋玻片的處理（一）載玻片和蓋玻片的處理l 將載玻片或培養(yǎng)用的小蓋片浸泡在重將載玻片或培養(yǎng)用的小蓋片浸泡在重鉻酸鉀濃硫酸清潔液中鉻酸鉀濃硫酸清潔液中24小時，然后流水小時，然后流水充分沖洗，再用蒸餾水沖洗充分沖洗，再用蒸餾水沖洗3遍以上，而后遍以上，而后置置95%乙醇中乙醇中12小時。取出擦干或

14、烤干，小時。取出擦干或烤干，貯放于玻片盒內(nèi)備用。貯放于玻片盒內(nèi)備用。l 蓋玻片很薄，以上處理程序必須縮短蓋玻片很薄，以上處理程序必須縮短時間，清潔液浸泡只需時間，清潔液浸泡只需2小時，流水沖洗注小時，流水沖洗注意勿損傷玻片。意勿損傷玻片。l（二）黏附劑的使用（二）黏附劑的使用l1、多聚左旋賴氮酸（、多聚左旋賴氮酸（poly-l-lysine） l 首先配制首先配制0.1%多聚左旋賴氮酸濃縮液（配多聚左旋賴氮酸濃縮液（配方見附錄一），室溫下（方見附錄一），室溫下（1826）可保存）可保存1年。年。使用時，將試劑使用時，將試劑10倍稀釋成工作液，濃度為倍稀釋成工作液，濃度為0.01%，28冰箱保存

15、，有效期冰箱保存，有效期3個月。個月。l 使用方法是將充分洗凈和預(yù)先干燥的玻片浸使用方法是將充分洗凈和預(yù)先干燥的玻片浸泡于稀釋后的多聚左旋賴氨酸深液數(shù)十秒或提拉泡于稀釋后的多聚左旋賴氨酸深液數(shù)十秒或提拉十次，瀝干，于室溫下晾干十次，瀝干，于室溫下晾干1224小時或在小時或在45以下烤箱內(nèi)烘干。處理后的玻片避光干燥可長期以下烤箱內(nèi)烘干。處理后的玻片避光干燥可長期保存。保存。l2、3-氨丙基氨丙基-乙氧基甲硅烷（乙氧基甲硅烷（3-amino propyltriethoxy silane, APES） l APES必須現(xiàn)用現(xiàn)配。用此方法黏合的玻片應(yīng)必須現(xiàn)用現(xiàn)配。用此方法黏合的玻片應(yīng)垂直烤片而不能水平

16、烤片，否則，組織片中易出垂直烤片而不能水平烤片，否則，組織片中易出現(xiàn)氣泡。現(xiàn)氣泡。l APES的使用方法：用丙酮的使用方法：用丙酮50倍稀釋（倍稀釋（APES 1份、丙酮份、丙酮49份混合），將洗凈的玻片放入稀釋好份混合），將洗凈的玻片放入稀釋好的的APES中，停留中，停留2030秒，取出稍停，再入純丙秒，取出稍停，再入純丙酮或蒸餾水中涮去未結(jié)合的酮或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾，置通風(fēng)櫥中晾干即可。注意用干即可。注意用APES防脫片處理的載玻片撈片時防脫片處理的載玻片撈片時組織應(yīng)一步到位，并盡量減少氣泡存在，以免影組織應(yīng)一步到位，并盡量減少氣泡存在，以免影響染色結(jié)果。響染色結(jié)果

17、。l 注意不要將注意不要將APES與其他防脫片劑混合使用。與其他防脫片劑混合使用。l 多聚左旋賴氨酸為目前免疫組織化學(xué)多聚左旋賴氨酸為目前免疫組織化學(xué)染色中最常用的防脫片劑，適合于需要酶染色中最常用的防脫片劑，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。l 如效果不佳，可用雙重處理（如效果不佳，可用雙重處理（APES和和poly-l-lysine）的切片。）的切片。l 在以上兩種方法均無效的情況下，可在以上兩種方法均無效的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前放在用如下方法：切片在脫蠟前放在APES 1：50丙酮溶液中浸泡丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干后即可進行分鐘

18、，晾干后即可進行下一步驟。下一步驟。l 對對HE染色的切片，可在載玻片上涂染色的切片，可在載玻片上涂抹薄層蛋白甘油。抹薄層蛋白甘油。l一、取材：一、取材：l二、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、二、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、l 撈片撈片、烤片、脫蠟、水化、烤片、脫蠟、水化l三、玻片處理：防脫片膠三、玻片處理：防脫片膠l APES Poly-L-Lysinl四、抗原修復(fù)四、抗原修復(fù)l化學(xué)法：胰蛋白酶、胃胰蛋白酶、鏈霉蛋白化學(xué)法：胰蛋白酶、胃胰蛋白酶、鏈霉蛋白l 酶、尿素等酶、尿素等l物理法：單純加熱、高壓加熱、微波加熱物理法：單純加熱、高壓加熱、微波加熱l 10分鐘分鐘 90120秒

19、秒 10分鐘分鐘 組 織Ab固定液PH值 3.05.07.08.010抗原修復(fù)液PH值6.0皮膚AE1/AE3-胃粘膜EMA+子宮肌瘤SMA+乳腺癌ER+7.0皮膚AE1/AE3-胃粘膜EMA+子宮肌瘤SMA+乳腺癌ER+8.0皮膚AE1/AE3+胃粘膜EMA+子宮肌瘤SMA+乳腺癌ER+EDTA 8.0皮膚AE1/AE3+胃粘膜EMA+子宮肌瘤SMA+乳腺癌ER+l 免疫組化染色步驟：免疫組化染色步驟：l（一）（一）S-P法染色步驟法染色步驟:l1、石蠟切片脫蠟和水化后，用、石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（PH=7.4)l 沖洗三次沖洗三次,每次三分鐘（每次三分鐘（33）。）。l2、根據(jù)每一

20、種抗體的要求，對組織進行相應(yīng)、根據(jù)每一種抗體的要求，對組織進行相應(yīng)l 的修復(fù)。的修復(fù)。l3、每張切片滴加一滴或、每張切片滴加一滴或50l 3%H2O2l （試劑（試劑 A） ，室溫下孵育室溫下孵育10分鐘，以阻斷分鐘，以阻斷l(xiāng) 內(nèi)源性過氧化物酶。內(nèi)源性過氧化物酶。l4、 PBS沖洗（沖洗（33 ）l5、甩取、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或液，每張切片滴加一滴或50ll 的非免疫動物血清（試劑的非免疫動物血清（試劑 B），室溫下孵），室溫下孵l 育育10分鐘。分鐘。l6、甩取血清，每張切片滴加一滴或、甩取血清，每張切片滴加一滴或50l第一第一l 抗體，室溫下孵育抗體，室溫下孵育60分鐘或分鐘或

21、4C過夜。過夜。l7、PBS沖洗（沖洗（35 ）l8、甩取、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或液，每張切片滴加一滴或50ll 的第二抗體（試劑的第二抗體（試劑 C） ，室溫下孵育、，室溫下孵育、l 10分鐘分鐘l9、 PBS沖洗（沖洗（33 ）l10、甩取、甩取PBS液，每張切片滴加一滴液，每張切片滴加一滴50ll 的鏈霉菌抗生物素的鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液過氧化物酶溶液l （試劑（試劑 D） ，室溫下孵育，室溫下孵育10分鐘。分鐘。l11、 PBS沖洗（沖洗（33 ）l12、甩取、甩取PBS液，每張切片滴加液，每張切片滴加2滴滴100ll 的的DAB或或AEC顯色液，顯微鏡下觀察顯色液，

22、顯微鏡下觀察l 3-10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。 l13、自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，、自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%HCLl 分化分化0.1%氨水或氨水或PBS沖洗返藍。沖洗返藍。l 14、如果用、如果用DAB顯色，則切片通過梯度酒顯色，則切片通過梯度酒l 精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固；精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固；l如果用如果用AEC顯色，則切片不能用酒精脫顯色，則切片不能用酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。水，而直接用水性封片劑封片。l 如果組織內(nèi)源性生物素含量高或由于如果組織內(nèi)源性生物素含量高或由于熱修復(fù)造成內(nèi)源性生物暴露，可在加熱修復(fù)造成內(nèi)源性生

23、物暴露，可在加3%H2O2之前，用內(nèi)源性生物素阻斷劑之前，用內(nèi)源性生物素阻斷劑l加以阻斷之后繼續(xù)免疫組化染色。加以阻斷之后繼續(xù)免疫組化染色。（二）（二）Envision法染色步驟法染色步驟:l1、石蠟切片脫蠟和水化后，用、石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（PH=7.4)l 沖洗三次沖洗三次,每次三分鐘（每次三分鐘（33 ）。）。l2、根據(jù)每一種抗體的要求，對組織進行相應(yīng)、根據(jù)每一種抗體的要求，對組織進行相應(yīng)l 的修復(fù)。的修復(fù)。l3、每張切片滴加一滴或、每張切片滴加一滴或50l 3%H2O2 室溫室溫l 下孵育下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。l4、 PBS沖洗

24、（沖洗（33 ）l5、甩取甩取PBS液，每張切片滴加一滴或液，每張切片滴加一滴或50ll 第一抗體，室溫下孵育第一抗體，室溫下孵育60分鐘或分鐘或4C過夜。過夜。 l6、 PBS沖洗（沖洗（35 ）l7、甩取、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或液，每張切片滴加一滴或50l聚聚l 合物增強劑（試劑合物增強劑（試劑 A） ，室溫下孵育室溫下孵育20分分l 鐘。鐘。l8、 PBS沖洗（沖洗（33 ）l9、甩取、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或液，每張切片滴加一滴或50l酶酶l 標(biāo)抗鼠標(biāo)抗鼠兔聚合物，兔聚合物， （試劑（試劑 B）室溫下孵）室溫下孵l 育育30分鐘。分鐘。 l10、PBS沖洗（沖洗（33

25、 ）l11、甩取、甩取PBS液，每張切片滴加液，每張切片滴加2滴滴100ll 的的DAB或或AEC色液，顯微鏡下觀察色液，顯微鏡下觀察l 3-10分鐘陽性顯色為棕色或紅色。分鐘陽性顯色為棕色或紅色。l12、自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，、自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%HCLl 分化分化0.1%氨水或氨水或PBS沖洗返藍。沖洗返藍。l 13、如果用、如果用DAB顯色，則切片通過梯度酒顯色，則切片通過梯度酒l 精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固；精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固；l 如果用如果用AEC顯色，則切片不能用酒顯色，則切片不能用酒l 精脫水，而直接用水性封片劑封片。精脫水，而直接用水性封片劑封

26、片。l 免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用 1、提高病理診斷的準(zhǔn)確性，確定腫瘤來、提高病理診斷的準(zhǔn)確性，確定腫瘤來源及類型。源及類型。 通過檢測細(xì)胞骨架抗原（如通過檢測細(xì)胞骨架抗原（如CK, Vimetin, Desmin, GFAP等）等）;細(xì)胞功能產(chǎn)細(xì)胞功能產(chǎn)物抗原（如激素，免疫球蛋白，物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE, CgA等）等）;細(xì)胞表型標(biāo)記物，屬細(xì)胞膜抗原（如細(xì)胞表型標(biāo)記物，屬細(xì)胞膜抗原（如LCA, EMA)及各種淋巴細(xì)胞表型）和胚胎及各種淋巴細(xì)胞表型）和胚胎期抗原（如期抗原（如CEA, AFP).確定腫瘤來源確定腫瘤來源 l胰腺:l腺泡細(xì)胞癌：CK8+、CK

27、18+l導(dǎo)管分化癌：CK7+、CK19+l肝臟腫瘤Hep-par-1AFPCK8CK18CK7CK19CK高CK低CA19-9CK20HCC+/_+-/+ -/+ICC+-/+/+-/+MAC胃腸道轉(zhuǎn)移性腺癌 +/_+ +l甲狀腺及濾泡旁細(xì)胞l 甲狀腺濾泡上皮發(fā)生癌 髓樣癌l 1、Tg + l 2、TTF-1 + +l 3、 Syn +l 4、 Cg-A + l 5、Calcitonin +l 6、CEA 少+ 多+l 乳頭狀癌 正常l CK高 + l Galectin-3/HBME-1 + l CK19 + +l Vimitin + l S-100 + l P53 + l MC + l CD

28、56 +l甲狀旁腺l PTH + （甲狀旁腺激素）l Syn+、 Cg-A+、 CK8+、CK18+、CK19+l Ki-675注意復(fù)查l 類癌、不典型類癌、小細(xì)胞癌lTTF-1 +/- +lKi-67 4050 60 80lCD57 + + +lCD56 + + +l SYN + + + lCgA + + +lNSE + + +l l男性生殖系統(tǒng)男性生殖系統(tǒng)l前列腺疾病前列腺疾病l一、前列腺的標(biāo)記物一、前列腺的標(biāo)記物l 1、前列腺特異性抗原（、前列腺特異性抗原（PSA） （漿（漿+ ）l正常：在雄激素的調(diào)節(jié)下腺泡上皮、導(dǎo)管上皮分泌正常：在雄激素的調(diào)節(jié)下腺泡上皮、導(dǎo)管上皮分泌l 是前列腺來源的

29、腫瘤的敏感、特異的標(biāo)記物，但不能是前列腺來源的腫瘤的敏感、特異的標(biāo)記物，但不能區(qū)分良惡性區(qū)分良惡性l （1）前列腺腺泡上皮、導(dǎo)管上皮：頂端胞質(zhì)）前列腺腺泡上皮、導(dǎo)管上皮：頂端胞質(zhì)+ l （2）良性增生上皮：頂端胞質(zhì)）良性增生上皮：頂端胞質(zhì)+ l （3）前列腺癌（除外分化最差的）均陽性）前列腺癌（除外分化最差的）均陽性l 分化越高，陽性越強分化越高，陽性越強l （4）偶爾前列腺以以外組織局灶弱）偶爾前列腺以以外組織局灶弱+（多為尿路的腺上（多為尿路的腺上皮及其癌；唾液腺、乳腺癌等）尿路上皮皮及其癌；唾液腺、乳腺癌等）尿路上皮l2、高分子量角蛋白、高分子量角蛋白34 12 （漿（漿+ ）l CK5

30、/6 （漿（漿+ ）l P63 （核（核+ ） l能區(qū)分良惡性能區(qū)分良惡性: 增生增生良性良性 PIN：基底細(xì)胞（漿：基底細(xì)胞（漿+ ）l 癌：癌：l能幫助區(qū)分良惡性能幫助區(qū)分良惡性l -甲基酰基輔酶消旋酶（甲基?；o酶消旋酶（P504s） （漿（漿+ ）l 癌：敏感性、特異性表達約癌：敏感性、特異性表達約80100l 正常（偶爾腔面正常（偶爾腔面+）萎縮型腺體萎縮型腺體結(jié)節(jié)性增生（結(jié)節(jié)性增生（ 12% +） 非典型性腺瘤性增生（非典型性腺瘤性增生（AAH）（）（ 17% +） 高級高級別別PIN （ 90% +）l 前列腺間質(zhì)的平滑肌、尿路上皮癌、腎細(xì)胞癌、及結(jié)前列腺間質(zhì)的平滑肌、尿路上皮癌

31、、腎細(xì)胞癌、及結(jié)腸癌也可腸癌也可+ IGCNU 精原細(xì)胞精原細(xì)胞瘤瘤胚胎性癌胚胎性癌卵黃囊瘤卵黃囊瘤混合型生殖混合型生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞腫瘤間質(zhì)細(xì)胞瘤間質(zhì)細(xì)胞瘤支持細(xì)胞瘤支持細(xì)胞瘤PLAP+彌彌+AFP+彌彌+ HCG+HPL 可可+inhibin合體合體+彌彌+彌彌CD117+彌彌CD99Vimentin+CD30+彌彌 MelanA神經(jīng)內(nèi)分泌神經(jīng)內(nèi)分泌+CK廣廣+8+18+高高廣廣+彌彌19 +彌彌+/_+E M A CEA/合體合體+/合體合體+/合體合體+/合體合體+ /合體合體+ l3、子宮內(nèi)膜間質(zhì)腫瘤、子宮內(nèi)膜間質(zhì)腫瘤 平滑肌腫瘤平滑肌腫瘤 l SMA + + l SMSA + +l

32、Desmin - +l H-caldesmin - +特異特異l CD10 + -l4、 平滑肌瘤平滑肌瘤 平滑肌肉瘤平滑肌肉瘤lER/PR + +lBcl-2 + +lP53 + +lMIB-1 + +l1、 胎盤結(jié)節(jié) 、 滋養(yǎng)葉細(xì)胞腫瘤l Ki-67 - /少量+ 14%+/-7%l2、 蛻膜組織、滋養(yǎng)葉細(xì)胞lMEL-CAM - 中間滋養(yǎng)+lPLAP - 中間滋養(yǎng)+lCK - +lVIM + -lHCG - +lCD10 + -l3、 女生女生 結(jié)腸結(jié)腸 肝細(xì)胞癌肝細(xì)胞癌 肺小細(xì)胞癌肺小細(xì)胞癌 腎癌腎癌 lCK7 + - - - -CK20 - + - - -l 4、間皮 lMC + CR

33、+ CK5/6+ll起源于起源于Cajal細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞，表達細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞，表達KIT酪氨酸激酶受體酪氨酸激酶受體（CD117）,似平滑肌樣腫瘤的胃腸道間葉性腫瘤。似平滑肌樣腫瘤的胃腸道間葉性腫瘤。l形態(tài)多樣：形態(tài)多樣：l平滑肌分化：平滑肌分化：l 梭形細(xì)胞，膠原豐富，核旁空泡梭形細(xì)胞，膠原豐富，核旁空泡-似平滑肌瘤；似平滑肌瘤；l神經(jīng)分化：核灶性柵欄狀排列神經(jīng)分化：核灶性柵欄狀排列-似神經(jīng)鞘瘤；似神經(jīng)鞘瘤；l 細(xì)胞增大，多角形，上皮樣細(xì)胞增大，多角形，上皮樣-似上皮樣平滑肌似上皮樣平滑肌l 瘤或肉瘤。瘤或肉瘤。l非平滑肌和神經(jīng)非平滑肌和神經(jīng)l免疫組化：免疫組化： lCD117膜、胞質(zhì)或核旁

34、陽性，膜、胞質(zhì)或核旁陽性，DOG-1+，CD34陽性（陽性（70-80%） ，SMA陽性（陽性（30-40%）,Desmin陽性陽性,S-100 陽性陽性,NF可陽性可陽性,胃腸道間質(zhì)瘤胃腸道間質(zhì)瘤A 潰瘍位于病變潰瘍位于病變的上端的上端B 切面顯示向管切面顯示向管壁擴展。壁擴展。 間質(zhì)瘤間質(zhì)瘤A 柵欄狀核似神經(jīng)鞘瘤柵欄狀核似神經(jīng)鞘瘤B 梭形細(xì)胞有明顯細(xì)胞梭形細(xì)胞有明顯細(xì)胞漿空泡漿空泡C 上皮樣型上皮樣型惡性胃腸道間質(zhì)瘤惡性胃腸道間質(zhì)瘤A 腫瘤細(xì)胞圍繞血腫瘤細(xì)胞圍繞血管形成血管旁細(xì)胞管形成血管旁細(xì)胞套，外周為壞死套，外周為壞死B 可見數(shù)個核分裂?？梢姅?shù)個核分裂。胃腸間質(zhì)瘤胃腸間質(zhì)瘤A 瘤細(xì)胞間

35、見嗜伊瘤細(xì)胞間見嗜伊紅色膠原纖維團塊紅色膠原纖維團塊B CD34強陽性強陽性胃腸間質(zhì)瘤胃腸間質(zhì)瘤A 上皮樣型上皮樣型B Vimentin陽性陽性l多數(shù)情況下，激酶基因突變是主要的致癌事件多數(shù)情況下，激酶基因突變是主要的致癌事件1,2KIT：80-85%1PDGFRA：72野生型（無法檢測到的突變）：野生型（無法檢測到的突變）：10-15%1 SDH-deficient GISTl 突變導(dǎo)致激活的酪氨酸激酶受體持續(xù)的異常表達突變導(dǎo)致激活的酪氨酸激酶受體持續(xù)的異常表達(KIT或或PDGFRA)3 Gain of function mutationPDGFRA，血小板源性生長因子受體，血小板源性生長

36、因子受體 ；PDGFRA，血小板源性生長因子受體，血小板源性生長因子受體 基因基因1. Corless CL et al. J Clin Oncol. 2004;22:3813-3825.2. Heinrich MC et al. Science. 2003;299:708-710.3. Trent JC et al. Curr Opin Oncol. 2006;18:386-395.KITExon 11Most common site of mutationExon 92nd most common site of mutationExons 13 & 17RarePDGFRAExo

37、ns 12 & 14RareExon 183rd common site of mutation“Wild-type”Molecular etiology unclearFamilial GISTGermline KIT or PDGFRA mutation Carney-StratakisGermline mutations in SDH（A, B, C, D)PediatricKIT & PDGFRA mutations are rareCarneys triadNo KIT or PDGFRA mutationsNF-1-relatedNo KIT or PDGFRA m

38、utations胃腸道間葉來源的腫瘤胃腸道間葉來源的腫瘤CD117 CD117 免疫組化檢測免疫組化檢測GISTGIST是是desmindesmin檢測陽性檢測陽性平滑肌瘤平滑肌瘤是是否否S-100S-100檢測陽性檢測陽性神經(jīng)鞘瘤神經(jīng)鞘瘤是是DOG1 DOG1 檢測檢測GISTGIST是是否否野生型野生型GISTGIST其他腫瘤其他腫瘤KIT KIT 基因檢測基因檢測GISTGISTPDGFRPDGFR基因檢測基因檢測否否GISTGIST是是是是是是否否GISTGIST診斷流程診斷流程-GSIT -GSIT 中國共識中國共識中國GIST診斷治療專家共識2008l2、胃腸道間質(zhì)瘤l CD117

39、+（重要）、 DOG-1 （重要）、 CD34 +l Desmin+/、SMA/MSA+/l S-100 +/ 、NF +/l P63+、P53+、Ki-67+預(yù)后差l3、 Barrett食管l占GIST的5%7.5%l臨床上常以綜合征的形式表現(xiàn) （如Carney三聯(lián)征或Carney-Stratakis 綜合征）l好發(fā)于胃，上皮樣GIST，多結(jié)節(jié)性 淋巴管瘤栓，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移l免疫組化: 可表達CD117和DOG1，不表達SDHBlc-kit或PDGFRA基因突變檢測顯示為野生型l核分裂象不能評估危險度，發(fā)生轉(zhuǎn)移的間隙期較長，故需長期隨訪l+ in 70% GISTs: 47% in small

40、intestine; 96% in rectum; 100% in esophoguslCD34 is not specific for GISTslCD34+: 孤立性纖維性腫瘤（孤立性纖維性腫瘤（90%）, 炎炎癥性纖維性息肉、去分化脂肪肉瘤、皮癥性纖維性息肉、去分化脂肪肉瘤、皮膚隆突性纖維肉瘤膚隆突性纖維肉瘤 （90%）、某些神經(jīng)腫瘤、卡波西肉瘤、）、某些神經(jīng)腫瘤、卡波西肉瘤、多數(shù)血多數(shù)血 管肉瘤、許多上皮樣肉瘤管肉瘤、許多上皮樣肉瘤 免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用 1、提高病理診斷的準(zhǔn)確性，確定腫瘤來源及類、提高病理診斷的準(zhǔn)確性，確定腫瘤來源及類 型。型。 通過檢

41、測細(xì)胞骨架抗原（如通過檢測細(xì)胞骨架抗原（如CK, Vimetin, Desmin, GFAP等）等）;細(xì)胞功能產(chǎn)物抗原（如激素，細(xì)胞功能產(chǎn)物抗原（如激素，免疫球蛋白，免疫球蛋白，NSE, CgA等）等）;細(xì)胞表型標(biāo)記物，細(xì)胞表型標(biāo)記物，屬細(xì)胞膜抗原（如屬細(xì)胞膜抗原（如LCA, EMA)及各種淋巴細(xì)胞表及各種淋巴細(xì)胞表型）和胚胎期抗原（如型）和胚胎期抗原（如CEA, AFP).確定腫瘤來源確定腫瘤來源 2、某些激素受體及生長因子的檢測可判斷預(yù)后。、某些激素受體及生長因子的檢測可判斷預(yù)后。 如：如：PR、ER 、 免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用 3、癌基因蛋白的研究，研究腫瘤

42、的發(fā)生、發(fā)展、癌基因蛋白的研究，研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展 過程，如各種癌基因、抑癌基因及其相關(guān)過程，如各種癌基因、抑癌基因及其相關(guān)因素。 P53: 惡變惡變 Bcl-2：淋巴結(jié)生發(fā)中心反應(yīng)性和淋巴瘤的區(qū)別：淋巴結(jié)生發(fā)中心反應(yīng)性和淋巴瘤的區(qū)別 Cer-b-B-2： 乳腺導(dǎo)管內(nèi)上皮的重度非典型增生和乳腺導(dǎo)管內(nèi)上皮的重度非典型增生和 乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌的區(qū)別乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌的區(qū)別 4、評價腫瘤增殖活性，對腫瘤分化、復(fù)發(fā)、評價腫瘤增殖活性，對腫瘤分化、復(fù)發(fā) 提供參考。如提供參考。如ki-67, PCNA等。等。 5、檢測腫瘤組織的轉(zhuǎn)移潛能，如、檢測腫瘤組織的轉(zhuǎn)移潛能，如nm23-H, CD44V6, MMP等。等。

43、6、協(xié)助判定腫瘤的分期、協(xié)助判定腫瘤的分期 LN和和型可顯示有無浸潤型可顯示有無浸潤7、提高微小癌灶的發(fā)現(xiàn)率、提高微小癌灶的發(fā)現(xiàn)率8、指導(dǎo)腫瘤的治療、指導(dǎo)腫瘤的治療 PR、ER、Cer-b-B-2和許多耐藥基因的檢測和許多耐藥基因的檢測9、免疫性疾病的輔助診斷、免疫性疾病的輔助診斷10、病原生物的檢查、病原生物的檢查 如：如：HPV、EB、HP等等 l 免疫組化染色的注意事項免疫組化染色的注意事項：l（一）抗體的保存和配制（一）抗體的保存和配制l1、保存：、保存：l 濃縮抗體：濃縮抗體： -20-40C 約約12年年l 即用型抗體；即用型抗體；4C 約約1年年l2、抗體的配制：、抗體的配制：l

44、 濃縮抗體必須找抗體的最佳稀釋度濃縮抗體必須找抗體的最佳稀釋度l 即用型抗體直接使用即用型抗體直接使用l（二）正確設(shè)計對照（二）正確設(shè)計對照l 陰性對照（陰性對照（PBS或非免疫血清）、陽或非免疫血清）、陽性對照（購置的或自己收集的）、自身對照性對照（購置的或自己收集的）、自身對照、l抑制對照和吸收對照。抑制對照和吸收對照。l 抑制對照和吸收對照一般不用。抑制對照和吸收對照一般不用。l（三）出現(xiàn)假陽性的幾種常見原因（三）出現(xiàn)假陽性的幾種常見原因l1、抗體稀釋度不夠，濃度太高。、抗體稀釋度不夠，濃度太高。l2、抗體與多種抗原有交叉反應(yīng)。、抗體與多種抗原有交叉反應(yīng)。l3、抗體與組織中某些成分非特異

45、性結(jié)合，、抗體與組織中某些成分非特異性結(jié)合，l 出現(xiàn)異常表達，如：出現(xiàn)異常表達，如：S-100在鱗狀上皮表達。在鱗狀上皮表達。l4、內(nèi)源性酶的顯色、內(nèi)源性酶的顯色l5、腫瘤與病變組織中有其他組織殘留、腫瘤與病變組織中有其他組織殘留l （尤其是腫瘤中有正常組織殘留）（尤其是腫瘤中有正常組織殘留）l6、抗原的彌散或被瘤細(xì)胞吞噬而使抗原、抗原的彌散或被瘤細(xì)胞吞噬而使抗原l 在不該出現(xiàn)的部位出現(xiàn)。在不該出現(xiàn)的部位出現(xiàn)。l7、異位抗原的表達，（有人認(rèn)為是交叉、異位抗原的表達，（有人認(rèn)為是交叉l 免疫反應(yīng)）免疫反應(yīng)）l8、內(nèi)源性生物素的影響。、內(nèi)源性生物素的影響。表2：生物素在正常組織中的分布情況組織生物

46、素組織生物素組織生物素舌鱗狀上皮-喉黏膜腺管+/1卵巢間質(zhì)-舌橫紋肌-支氣管上皮+/3卵巢顆粒細(xì)胞+/2食道鱗狀上皮-支氣管腺體+/2乳腺小葉、導(dǎo)管+/3胃上皮-肺泡-乳頭鱗狀上皮-胃腺體+/3腎臟近曲管+/3腦膠質(zhì)-十二指腸平滑肌-腎臟遠曲管+/3神經(jīng)元+/312指腸上皮腺體+/3腎小球-神經(jīng)纖維-小腸上皮+/2腎集合管+/3甲狀腺腺泡+/2小腸上皮、腺體+/2腎盂移行上皮+/3甲狀腺C細(xì)胞+/3闌尾上皮、腺體+/3膀胱+/2甲旁腺嗜酸細(xì)胞+/3結(jié)腸上皮、腺體+/3前列腺+/3腎上腺皮質(zhì)+/3直腸上皮、腺體+/3尿道上皮+/3腎上腺髓質(zhì)-肛門鱗狀上皮-睪丸曲細(xì)精管+/3胃內(nèi)分泌細(xì)胞+/3腮腺

47、導(dǎo)管+/3附睪支持細(xì)胞+/2睪丸間質(zhì)細(xì)胞+/3腮腺腺泡-輸精管上皮+/2胰島-頜下腺導(dǎo)管+/3宮頸鱗狀上皮-淋巴結(jié)-頜下腺腺泡-宮頸柱狀上皮-扁桃體-胰腺腺泡-宮頸腺上皮+/2脾-胰腺導(dǎo)管+/3增殖期內(nèi)膜腺體+/2漿細(xì)胞+/3肝細(xì)胞+/3分泌期內(nèi)膜腺體+/3皮膚鱗狀上皮底層+/3膽管+/2蛻膜腺體+/2皮脂腺+/3膽囊+/3蛻膜細(xì)胞+/3脂肪細(xì)胞+/3鼻黏膜上皮+/2胎盤絨毛+/2平滑肌-鼻黏膜腺體+/2臍帶-橫紋肌-會厭黏膜-輸卵管+/1心肌+/3 血管-注：- 陰性；+/1 弱陽性點狀分布；+/2 中度陽性片狀分布；+/3 強陽性彌漫分布。HE未修復(fù)未修復(fù)修復(fù)修復(fù)修復(fù)修復(fù)+封閉封閉修復(fù)修復(fù)

48、+DAB標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)CK生物素生物素生物素生物素標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)CK生物素生物素+CK胃內(nèi)分泌細(xì)胞胃內(nèi)分泌細(xì)胞皮脂腺皮脂腺垂體腺瘤垂體腺瘤腺淋巴瘤腺淋巴瘤大鼠腎臟大鼠腎臟大鼠肝臟大鼠肝臟大鼠胰腺大鼠胰腺（1）冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素。）冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素。（2）經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉。）經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉。（3）加熱抗原修復(fù)可造成內(nèi)源性生物素暴露。）加熱抗原修復(fù)可造成內(nèi)源性生物素暴露。（4）內(nèi)源性生物素暴露的強度各不相同，從弱陽性（）內(nèi)源性生物素暴露的強度各不相同，從弱陽性（+） 到強陽性（到強陽性（+）。）。（5）內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布）內(nèi)源性

49、生物素在組織中的分布形式，既有散在分布 也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中。也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中。（6）內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺）內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺 上皮組織，亦存在部分非上皮組織。上皮組織，亦存在部分非上皮組織。（7）內(nèi)源性生物素不僅存在人體組織，也存在大鼠組織。）內(nèi)源性生物素不僅存在人體組織，也存在大鼠組織。（8）內(nèi)源性生物素暴露的強弱與修復(fù)液有關(guān)，其強度增）內(nèi)源性生物素暴露的強弱與修復(fù)液有關(guān)，其強度增 加依次為：檸檬酸、加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA。（9）熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉。）熱抗

50、原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉。 為了避免免疫組化中內(nèi)源性生物素的干擾，凡采用冰為了避免免疫組化中內(nèi)源性生物素的干擾，凡采用冰凍切片或石蠟切片加熱抗原修復(fù)用非生物素檢測系統(tǒng)：凍切片或石蠟切片加熱抗原修復(fù)用非生物素檢測系統(tǒng)：1、進行內(nèi)源性生物素封閉，并成為常規(guī)?？刹捎玫扒寤?、進行內(nèi)源性生物素封閉，并成為常規(guī)?？刹捎玫扒寤?卵白素作為封閉劑。卵白素作為封閉劑。2、或采用非生物素檢測系統(tǒng)，如、或采用非生物素檢測系統(tǒng)，如EnVision等。等。3、應(yīng)堅持使用陰性對照。、應(yīng)堅持使用陰性對照。l（四）出現(xiàn)假陰性的幾常見種原因（四）出現(xiàn)假陰性的幾常見種原因l1、抗體和檢測試劑盒配對不合理（現(xiàn)在一、抗

51、體和檢測試劑盒配對不合理（現(xiàn)在一l 般用通用型可避免試劑盒配對不合理）般用通用型可避免試劑盒配對不合理）l2、抗體的濃度太低、抗體的濃度太低l3、孵育的時間太短（根據(jù)要求做）、孵育的時間太短（根據(jù)要求做）l4、固定和溫度、固定和溫度l 有的抗體不適合用于福爾馬林固定的組有的抗體不適合用于福爾馬林固定的組織，僅適合用于冰凍切片；固定、包埋的溫織，僅適合用于冰凍切片；固定、包埋的溫度過高，抗原丟失（度過高，抗原丟失（62C）l5、染色步驟不正確、染色步驟不正確l6、染色過程中切片過分干燥、染色過程中切片過分干燥l（五）出現(xiàn)背景著色的幾種常見原因（五）出現(xiàn)背景著色的幾種常見原因l1、內(nèi)源性的過氧化物

52、酶沒有阻斷、內(nèi)源性的過氧化物酶沒有阻斷l(xiāng)2、正常動物血清使用不合理（如二抗為、正常動物血清使用不合理（如二抗為羊抗鼠的羊抗鼠的 IgG ,因該用羊的血清因該用羊的血清)。l3、脫蠟不夠徹底、脫蠟不夠徹底l4、組織粘貼劑使用不當(dāng)或太濃、組織粘貼劑使用不當(dāng)或太濃l5、PBS沖洗不夠沖洗不夠l6、抗體稀釋不合理，濃度太高。、抗體稀釋不合理，濃度太高。l7、底物顯色時間太長、底物顯色時間太長l（六）顯示劑的合理使用和增強方法（六）顯示劑的合理使用和增強方法l1、顯示劑：目前最常用的、顯示劑：目前最常用的l DAB 和和 AEC 僅用于僅用于HRP系統(tǒng)系統(tǒng)l AP-Red 和和 Fast-Blue 僅用

53、于僅用于AP系統(tǒng)系統(tǒng)l2、增強劑：主要是在、增強劑：主要是在DAB顯色加一些金顯色加一些金l 屬離子。如：鎳、銅、鈷等屬離子。如：鎳、銅、鈷等l（七）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（七）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)l1、陽性細(xì)胞定位是否明確（膜、漿、核）、陽性細(xì)胞定位是否明確（膜、漿、核）l2、間質(zhì)是否清晰、間質(zhì)是否清晰l3、有無背景著色、有無背景著色 l4、根據(jù)不同的情況判定陽性的標(biāo)準(zhǔn)、根據(jù)不同的情況判定陽性的標(biāo)準(zhǔn)l （有的陽性細(xì)胞數(shù)在（有的陽性細(xì)胞數(shù)在5%以上才定為陽性）以上才定為陽性）l5、注意抗原的聯(lián)合表達、注意抗原的聯(lián)合表達l如：分化差的癌可表達間葉的成分如：分化差的癌可表達間葉的成分l（七）免疫組織化學(xué)染色中常見脫

54、片原因（七）免疫組織化學(xué)染色中常見脫片原因l1、組織固定、脫水、透明不充分。、組織固定、脫水、透明不充分。l2、組織切片過厚。、組織切片過厚。l3、組織切片有折疊。、組織切片有折疊。l4、過度的熱抗原修復(fù)（高壓、微波、水煮）、過度的熱抗原修復(fù)（高壓、微波、水煮）處理或抗原修復(fù)液的處理或抗原修復(fù)液的pH偏高。偏高。l5、操作過程中，沖洗方法不正確等。、操作過程中，沖洗方法不正確等。背景干凈背景干凈, 位置正確位置正確 Dako, c-kit, malignant mesotheliomaDako, c-kit, malignant mesotheliomaDako, c-kit, maligna

55、nt mesotheliomaDako, c-kit, malignant mesotheliomaDako, c-kit, GISTP16, anorectal SCCP16, anorectal SCCBreast lobular carcinoma in thyroid gland, TG取材取材 封片封片 觀察觀察 （共（共10分）分） l 一塊已知的食管鱗狀細(xì)胞癌組一塊已知的食管鱗狀細(xì)胞癌組l 織，周圍帶有少量的正常的食管組織，周圍帶有少量的正常的食管組l 織，讓你用免疫組化織，讓你用免疫組化Envision法、法、l 用第一抗體為鼠抗人的單克隆抗體用第一抗體為鼠抗人的單克隆抗體 l

56、 CKAE1/AE3以檢測該食管鱗狀細(xì)胞以檢測該食管鱗狀細(xì)胞l 癌的組織情況癌的組織情況,你如何做出一張你如何做出一張l 合格的免疫組化切片合格的免疫組化切片? l l 要求：l1、實驗?zāi)康?：l2、實驗方法：l3、使用的實驗設(shè)備和藥品：l4、實驗步驟：l5、實驗結(jié)果：l二、免疫組織化學(xué)染色切片l （10分）l l 謝 謝取材取材 封片封片 觀察觀察 （共（共15分）分） l 一塊已知的肺鱗狀細(xì)胞癌組一塊已知的肺鱗狀細(xì)胞癌組l 織，周圍帶有少量的正常的肺組織，周圍帶有少量的正常的肺組l 織，讓你用免疫組化織，讓你用免疫組化Envision法、法、l 用第一抗體為鼠抗人的單克隆抗體用第一抗體為鼠

57、抗人的單克隆抗體 l CKAE1/AE3以檢測該肺鱗狀細(xì)胞以檢測該肺鱗狀細(xì)胞l 癌的組織情況癌的組織情況,你如何做出一張你如何做出一張l 合格的免疫組化切片合格的免疫組化切片? l l 要求：l1、實驗?zāi)康?：l2、實驗方法：l3、使用的實驗設(shè)備和藥品：l4、實驗步驟：l5、實驗結(jié)果：l二、免疫組織化學(xué)染色切片l （10分）l l 取材取材固定固定脫水脫水透明透明浸蠟浸蠟包埋修塊包埋修塊切片切片防脫防脫片處理片處理撈片撈片烤片烤片進行各種進行各種染色染色脫水脫水透明透明封片封片鏡下鏡下觀察觀察l 一、組織標(biāo)本取材：一、組織標(biāo)本取材：1、要求：、要求： 盡可能保持生活狀態(tài)下形態(tài)結(jié)構(gòu)的完盡可能保持

58、生活狀態(tài)下形態(tài)結(jié)構(gòu)的完 整性（材料盡可能新鮮）整性（材料盡可能新鮮） 盡量保持化學(xué)成分和酶的活性盡量保持化學(xué)成分和酶的活性 保持組織細(xì)胞的抗原不受損保持組織細(xì)胞的抗原不受損2、注意事項、注意事項 材料及時送檢（及時固定材料及時送檢（及時固定,510倍的固定倍的固定 液），盡快取材液），盡快取材 （及時固定或及時冷凍（及時固定或及時冷凍 切片或切片或-80保持備用）保持備用） （盡可能新鮮）（盡可能新鮮） 防止人為因素影響。如：避免擠壓，刀刃防止人為因素影響。如：避免擠壓，刀刃 要鋒利，不可反復(fù)切拉組織要鋒利，不可反復(fù)切拉組織 組織塊大小適中：過大過組織塊大小適中：過大過厚厚固定不良固定不良 一

59、般：一般：1.51.50.20.3cm3 最大最大: 2.52.50.20.3cm3免疫組化免疫組化: 110.2cm3 電鏡電鏡: 0.3 0.30.5cm3 注意切面注意切面: 目標(biāo)組織細(xì)胞一定在目標(biāo)切面上目標(biāo)組織細(xì)胞一定在目標(biāo)切面上 注意特殊情況：注意特殊情況： 縫線、鈣化、血液、粘液、糞便等需要先處理縫線、鈣化、血液、粘液、糞便等需要先處理 取材部位取材部位: 主要病變、交接區(qū)、遠離病變區(qū)主要病變、交接區(qū)、遠離病變區(qū)正常正常 動物的取材：麻醉動物的取材：麻醉處死處死取材取材 乙醚吸入麻醉法：乙醚吸入麻醉法：l 大白鼠、豚鼠大白鼠、豚鼠l戊巴比妥鈉和烏拉坦：戊巴比妥鈉和烏拉坦：l 3戊巴

60、比妥鈉戊巴比妥鈉 或或20烏拉坦烏拉坦l 腹腔或靜脈注射腹腔或靜脈注射12mll空氣栓塞法空氣栓塞法l 盡快切斷主動脈放血后在取材盡快切斷主動脈放血后在取材l二、細(xì)胞標(biāo)本取材：二、細(xì)胞標(biāo)本取材：l（一）培養(yǎng)的細(xì)胞（一）培養(yǎng)的細(xì)胞l 1、貼壁生長的細(xì)胞、貼壁生長的細(xì)胞l 在接種細(xì)胞前，把涂有黏附劑的小蓋在接種細(xì)胞前，把涂有黏附劑的小蓋玻片放入培養(yǎng)板中，接種后細(xì)胞的玻片放入培養(yǎng)板中，接種后細(xì)胞的 自然爬自然爬到小蓋玻片上生長，取材時，將小蓋玻片到小蓋玻片上生長，取材時，將小蓋玻片用預(yù)熱的用預(yù)熱的PBS液輕輕沖洗，瀝干后即可放入液輕輕沖洗，瀝干后即可放入固定液內(nèi)。固定液內(nèi)。l2、懸浮生長的細(xì)胞、懸浮生長的細(xì)胞 l 制備濃