動物細胞培養(yǎng)常用方法

1、一. 細胞增殖周期（cell Proliferatinal cycle）概念細胞周期是描述細胞增殖和分化交替發(fā)生變化的概念。而細胞增殖周期主要 是從細胞增殖角度賦予細胞活動的概念，兩者不應混為一談。細胞增殖周期是指 細胞從一次分裂結束開始生長，到下一次分裂結束所經歷的過程。根據(jù)細胞增殖 周期不同時期的生化特點，劃分為四個連續(xù)的時期，即G期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G期（DNA合成后期），M期（有絲分裂期）。如以G期為起點， 那么細胞增殖周期的各時期應循著 G-S-GkM的順序進行，G、S、G三期合稱為 細胞間期，此期完成細胞生長過程。M期完成遺傳物質的分配。因此，細胞增殖周期=

2、間期（G期+S期+G期）+分裂期（M期）。二. 培養(yǎng)細胞生命期（life span of culture cells）很多細胞特別是正常細胞，在體外的生存不是無限的，而是具有一個生命期。 索維培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。培養(yǎng)細胞的生命期與細胞的種類、性狀和原供體的年齡、健康等情況有關。人胚二倍體成纖維 細胞，在不凍存和反復傳代條件下，科傳3050代，相當于150300個細胞增殖 周期，能維持1年左右的生存時間，最后衰老凋亡。如供體為成體或衰老個體， 則生存時間較短；其他細胞如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十 幾代。只有當細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性

3、轉化時，細胞的生存期才 可能發(fā)生改變。正常細胞培養(yǎng)時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞生命的全過程中，大致都經歷以下三個階段：原代培養(yǎng)期、傳代期、衰退期。三. 培養(yǎng)細胞一代生存期細胞系連續(xù)細抱丟 :20 JIH數(shù)M細14接砲種敖12 10第次 傳 代初代轉化#/傳代間隔老化.1(X/;二傳代期死亡4681012圖27培養(yǎng)胞的生命期培養(yǎng)細胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當細胞增殖達到一定密度后，則需要 分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代 （Passage或Subculture ）。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定 的影響。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液

4、的性質、接種細胞的數(shù)量和細胞增殖的速度1416等有關。接種細胞數(shù)量大，細胞基數(shù)大。相同增殖速度條件下，細胞數(shù)量增加與 飽和速度相對要快（實際上細胞接種數(shù)量大時細胞增殖速度比稀少時要快）；連續(xù)細胞系和腫瘤細胞系比初代培養(yǎng)細胞增值快；培養(yǎng)液中血清含量多時細胞增 殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。停滯期、衰退期。所謂細胞“一代”一詞，僅指從細胞接種到分離培養(yǎng)時的一段時間，這已成 為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞時代或倍增非同意含義。 如某一細胞系 為第20代細胞，即指該細胞系已傳代 20次。在細胞一代中，細胞能倍增 36 次。細胞傳一代后，一般要經過以下六個階段：游離期、貼壁期、潛伏期、指數(shù)

5、 增長期、細抱數(shù)罐大極限點堀胞增殖率極唱點期：?41,圖2-5培養(yǎng)細I胞一代生長過程4X12四. 無菌操作要求（一）實驗前培養(yǎng)室和超凈臺的消毒。在工作臺面消毒時，切勿將培養(yǎng)細胞和 培養(yǎng)用液用紫外線照射；工作臺面上的用品不要過多或重疊放置， 否則會遮擋射 線，降低消毒效果；一些操作用具，如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用 75%酉精擦拭后置臺內同時紫外線照射消毒。（二）無菌操作工作區(qū)域應保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或 吸管頭等可以暫時放置，其他實驗用品用完后應及時移出，以利氣體流通。試劑 瓶口和外壁要用75%酒精擦拭后才能帶人無菌操作臺內。超凈臺上的物品布局要合理，污物廢液缸、酒

6、精棉球缸在右側位，酒精燈在中央區(qū)，試劑瓶在左側位。 實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。（三）洗手和著裝：嚴格按照外科手術要求消毒著裝，雙手用肥皂洗凈后，浸 泡于消毒液中，并用75%的酒精擦拭。（四）操作中，小心取出無菌實驗用品，避免造成污染。盡量減少手與器材的 接觸面，學會手指操作。手指不能觸及器材使用端及容器瓶口，如觸及，需要更 換或燒灼后再使用。組織、細胞及培養(yǎng)板在未做處理和使用前， 不要過早暴露于 空氣中。（五）一切操作，如打開或封閉瓶口，安裝吸管、注射器等，都要在酒精燈火焰前方進行。瓶口、吸管、注射器等使用前要經過火焰燒灼后使用。但要注意， 金屬器械不能在火

7、焰中長時間燒灼， 以防退火c另外，膠塞、橡皮乳頭及塑料制 品等細胞培養(yǎng)用品過火焰時也不能時間太長，以免燒焦產生有毒氣體，危害細胞。（六）試劑瓶順風斜放在支架上，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液瓶不要過早打開。容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45角取用，盡量避免垂直放置以防止下落細菌的污染。吸取液體前，瓶口和吸管應行火焰消毒，吸取液體時避免瓶口 和吸管碰撞。吸管不能混用，吸過培養(yǎng)液的吸管不能再燒灼，因殘留在吸管內的 培養(yǎng)液成分如蛋白質等燒焦后會產生有害物質，吸管再用時會將其帶到培養(yǎng)基中。不要在打開的容器正上方操作。瓶口液滴不能倒回瓶內，液滴用于酒精棉球擦拭， 瓶口再經火焰消毒。（七）不同的細胞同時操作時

8、，要專管專用，并要勤換吸管，防止擴大污染和 細胞交叉污染。（八）操作者動作要準確敏捷，盡量避免空氣流動。不要面向操作臺講話或咳 嗽，避免唾沫將微生物帶人超凈臺內，污染空氣。同時應注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心，并選擇適當?shù)燃壍臒o菌操作臺 （至 少兩級）。操作過程中小心有毒性試劑，例如DMSC及TPA等。實驗者離開超凈臺 時，立即用肘關節(jié)關閉側窗口，避免無茵室內細菌隨空氣流人凈化操作區(qū)。五. 高壓蒸汽滅菌裝置（一）使用方法使水面與三角擱架相1. 首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水， 平為宜。以免妨礙蒸汽流通而以免冷凝水淋濕包口的2. 放回滅菌桶，并裝入待滅

9、菌物品。注意不要裝得太擠， 影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸， 紙而透入棉塞。3. 加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方 式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4. 通電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。5. 到達滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的 壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未 降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降而

10、發(fā)生意外事故。（二）注意事項1. 消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止意外事件發(fā)生。消毒完畢后從壓力蒸汽消毒器中取出的消毒好的物品（不包括液體），應立即放到60C 70C烤箱內烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容 易被微生物污染。但如果消毒物中有液體時，一定要待消毒器冷卻后方可打開消 毒器的蓋，不能先打開閥門放氣，否則液體會溢出。2. 不同壓力蒸汽所達到的溫度不同， 不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。平衡鹽溶液及其他需要滅菌的液體：121C, 10磅（68.95kPa），20min；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：121C，15磅（103.42kPa）

11、、20min。六. 使用血清的注意事項血清的質量、種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血 清支持細胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的牛長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞生長的物質。因此，在購買大量血清之前，必須對血清支持細 胞生長能力進行檢測，包括接種率、生長曲線、維持細胞特性、無生物污染性等 方面，然后再大量購買質量好的同一批號的血清，并注意以下幾點：（一）需要長期保存的血清必須儲存于-20 C或-70 C低溫冰箱中，同時應避免反復凍融。4C冰箱中保存時間切勿超過1個月。由于血清結冰時體積會增加約 10%,因此，血清在凍入低溫冰箱前必須預留一定的體積空間，否則易發(fā)生污

12、染或玻璃瓶凍裂。（二）一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物， 則可將血清加入培養(yǎng)液內一起過濾，切勿直接過濾血清。（三）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 C或-70 C低溫冰箱中的血清放人 4C冰箱中溶解1d,然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷 輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直 接將血清從-20 C或-70 C直接放人37C解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成 蛋白質凝集而出現(xiàn)沉淀。（四）熱滅活是指56C, 30min加熱已完全解凍的血清。加熱過程中需規(guī)律搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補體成分滅活。除非必須

13、，一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會產生其他不明效應。 究竟滅活與否，以有利于實驗為主。切勿將血清在37 C放置太久，否則血清會變得渾濁，黏度增大，同時血清中的有效成分會被破壞而影響血清質量。（五）血清中的絮狀物主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中的纖維蛋白 造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量。可 3000r/min，離心5min去除， 也可不用處理。（六）采購血清時，最好先從供應商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保 留足夠使用6個月至1年的量，直至用到另一批經過預先試驗的樣品代替。七. 基本培養(yǎng)基的應用基本培養(yǎng)基只能維持細胞的生存，想要使細胞生長和增殖

14、，還需補充部分天 然培養(yǎng)基和一些補充成分，效果才更好。主要是牛血清、谷氨酰胺等。此外，為 防止污染，還經常加一定的抗菌素。補加了上述物質的培養(yǎng)基叫完全培養(yǎng)基。 按 其血清量的多少又分為生長液和維持液。表5-2憲全培兼捕組威JW11 *niLImJ.斉 11)011 JmLIL tiiL由于培養(yǎng)液是細胞賴以生存的環(huán)境，制備過程要操作嚴格，避免混入雜質。使用的成分應精心選擇，必須用質量最優(yōu)的試劑，容器要仔細清洗和消毒。八.合成培養(yǎng)基的保存（一）液體培養(yǎng)基的保存：液體培養(yǎng)基應于4C冰箱避光保存，實驗前放入37C 預熱。液體培養(yǎng)基中的 L谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果細 胞生長不良，可以

15、再添加適量 L谷氨酰胺。液體培養(yǎng)基經冷凍后再經溶化時， 其溶液的PH值會發(fā)生改變，溶液往往變堿，某些成分溶解也會對細胞生長不利。6故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放 個月至一年。(二) 干粉培養(yǎng)基的保存：4C冰箱避光保存，有效期36個月。九.平衡鹽溶液(Bala need Salt Solution, BSS平衡鹽溶液是細胞培養(yǎng)中常用的基本液體。 它主要是由無機鹽、葡萄糖組成， 其作用是維持細胞滲透壓平衡，保持 pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于合成 培養(yǎng)基的基礎液、取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配置其他試劑等，最簡單 的BSS是Ringer。平衡鹽溶液的種類

16、很多，常用的幾種見表。各種平衡鹽溶液 的主要區(qū)別在于氯化鈉的濃度、離子的濃度及緩沖系統(tǒng)不同，可根據(jù)需要選用適 當?shù)膫€衡鹽溶液。最常用的 BSS是 D-Hank s、Hank s、Earle液。D-Hank s 和Hank s的一個主要區(qū)別是前者不含有 CsT、Mg，因此D-Hank s常用于配 制胰酶溶液。Hank s和Earle液的主要區(qū)別是緩沖能力個同，Earle液含會高 濃度的NaHCQ(2.2g/L )，緩沖能力較強，適合于 5%C0的培養(yǎng)條件，在空氣水 平的CC2中，溶液會變堿，Ha nk s液僅含有0.35g/L NaHCQ,緩沖能力較弱， 不能用于5%C0的環(huán)境，若放入CQ培養(yǎng)箱

17、，溶液將迅速變酸.使用時應注意。 平衡鹽溶液中一般加有少量的酚紅作為溶液酸堿度的指示劑，以便于觀察培養(yǎng)液pH的變化。溶液中性時為桃紅色，偏酸時呈黃色，偏堿時則為紫紅色。配制平衡鹽溶液應使用雙蒸水。如果配方中含有Cf、Mg：應省首先溶解這 些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。表5-3常用 6 平I-K-k-也15)hWJK.fX)MO)kCln 42o.?nn ?on 4040n心川,II litU.JCIii.inIM)0 2n1LS6OXI?O.!411.(10L421,06-.40 20oexi0 211(1.()6冷 NLXh1(Kf2.211111.551IM001 i)f

18、)1 0 02(HL0.02十.消化液進行原代培養(yǎng)時常常需要用消化液將組織塊消化解離形成單細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要用消化液將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰蛋白酶(Trypsin)溶液和二乙烯四乙酸二鈉(EDTA)溶液，有時也用膠原酶(collagenase) 溶液。(一) 胰蛋白酶溶液胰蛋由酶是從動物胰臟分離的一種水解酶，其主要功能為使細胞間的蛋白質水解和細胞分散。胰蛋白酶的活性可用消化酪蛋白的能力表示，常用的有1: 125 和1: 250,即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。胰蛋白酶分散細胞的能力與細胞種類及細胞特性有關，適用于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、 肝、

19、腎等組織。對傳代培養(yǎng)細胞效果也很好。但對于纖維性組織和較硬的癌組織 效果差。不同種類的細胞以及不同數(shù)量的細胞采用胰蛋白酶消化的時間也不相同。 另外，胰蛋白酶濃度大、作用溫度高、時間長時，對細胞分離能力也大，但超過 一定的限度會損傷細胞。新配置的胰蛋白酶可使細胞分散速度增快。細胞培養(yǎng)用胰蛋白酶溶液一般配制成0.25%0.125%勺濃度，配制時要用不含 CeT、Mg及血 清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hanks），因為CaT、Mg是細胞膜的重要組成成分， 它們能促使細胞凝集，有阻礙消化的作用；血清會對胰蛋白酶產生抑制作用。 因 此，也常用含血清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化作用。胰酶作用及溶解的最佳 P

20、H是89,配制胰酶溶液應將液體調至 pH 8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾 后可以再調至PH 7. 5,也可不調。（二） EDTA容液EDTA是一種化學螯合劑，能整合 CeT和Mg+，溶液毒性小，使用方便，也常 用來解離細胞。它的作用機制是，一些細胞尤其是上皮細胞在生長過程中需CeT和Mg，參與細胞的連接，維持組織的完整性，而EDTA從細胞生存環(huán)境中奪取CaT和Mg+，并與這些離子形成螯合物，從而使細胞分離。因此，對于一些貼壁 特別牢固的細胞，可以用EDTA和胰酶的混合液（1:1）進行消化，提高消化率。注意：使用EDTA處理細胞后，一定要用Hank s液沖洗干凈，一是由于殘 留的EDTA可損傷

21、線粒體，它與核蛋白中的CeT和Mg+結合，破壞核蛋白結構，且 細胞長期處于無CeT的環(huán)境中，K+濃度降低，細胞呼吸減弱，從而影響細胞生長。 二是由于EDTA乍用不受血清抑制。另外，膠原酶的消化作用依賴于 CeT,因此， EDTA不可與膠原酶聯(lián)用。十一.抗菌素溶液常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭氏陽性菌有效， 鏈霉素豐主要對革蘭氏陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數(shù)細菌污染。 配制時用10mL三蒸水溶解1.0 X 106卩g/瓶的硫酸鏈霉素，取8mL硫酸鏈霉素液 溶解8.0 X I05IU/瓶的青霉素粉，即成青、鏈霉素各 1.0 X 105IU/mL的母液。 使用時，

22、100mL培養(yǎng)基內加母液0.1mL，這樣培養(yǎng)基內青、鏈霉素的最終濃度為 各 100IU/mL。有時為防止支原體和霉菌污染，要用到卡那霉素液、制霉菌素或兩性霉素B。 卡那霉素的配法：將一瓶卡那霉素（5.0 X 104卩g/瓶）溶于5mLHank s液中，即 成1.0 X104卩g/mL母液。使用時每100mL培養(yǎng)基內加0.5mL母液，最終使用濃 度為50卩g/mL。制霉菌素不能溶于水，故只能配成 5000IU/mL懸液。使用時每 100mL培養(yǎng)基內加0.5mL母液，最終使用濃度為 25IU/mL。在實際工作中，選擇哪一種抗生素、劑量多少、何時加入等，與污染源、抗 菌素的抗菌范圍、抗菌素的穩(wěn)定性等

23、有密切關系，應靈活運用。需要特別注意的 是，抗菌素液配制對要無菌操作、小量分裝、-20 C凍存。十二.細胞計數(shù)原代細胞制備時.培養(yǎng)的細胞要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行 細胞計數(shù)。計數(shù)結果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)是細胞培養(yǎng)中一項基本技術， 是了解培養(yǎng)細胞生長狀態(tài)以及測定培養(yǎng)基、血清、藥物等物質生物學作用的重要 手段。細胞計數(shù)主要利用血球計數(shù)板來完成。 血球計數(shù)板的每一大方格長為1mm 寬為1mm高為0-1mm體積為0.1mm,可容納的溶液是0.1卩L，每ImL溶液中 所含細胞數(shù)即是視野中每一大方格數(shù)出的細胞數(shù)的4壬匸U-IVC 菲nrn Ingkir10000 倍。1鬥SG-2血捕

24、計截板橫式圈（一）準備計數(shù)板：用酒精清潔計數(shù)板和蓋玻片，然后用吸水紙輕輕擦干；（二）準備細胞懸液：用0.25%夷蛋白酶消化單層細胞或收集懸浮培養(yǎng)細胞， 制成單個細胞懸液。要求細胞密度不低于 104個/mL,若細胞數(shù)很少，應將懸液 離心（1000r/min ， 5min），重懸浮于DME培養(yǎng)基中；（三）加樣：將蓋玻片蓋在計數(shù)板兩槽中間。用微量移液器輕輕吹打細胞懸液， 吸取少量細胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片一側邊沿加細胞懸液， 加樣量不要溢出蓋 玻片，也不要過少或帶氣泡。否則要將計數(shù)扳和蓋玻片擦干凈重新加樣。（四）計數(shù)：在顯微鏡下，用10X物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)。細 胞壓中線時，只計左側和

25、上方者，不計右側和下方者。十三.細胞傳代培養(yǎng)（一）細胞在培養(yǎng)過程中隨著數(shù)量的增長，尤其細胞生長十分旺盛時，代謝產 物堆積，CQ增多，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分枯竭，一方面長滿培養(yǎng)空間，另一方面細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度逐漸減慢甚至停止，更換培養(yǎng)基也 不能使細胞繼續(xù)生長，這種情況下，為使細胞能繼續(xù)生長，都需要將其分成小的 部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內，再進行培養(yǎng)，這個過程被稱為傳代培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法，同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實 驗的必經過程。細胞長滿80%90或剛剛全部匯合是細胞傳代的理想時期，過早 細胞產量不足，過晚細胞健康狀態(tài)不佳。（二）將分裝好的細胞培養(yǎng)物置37C、5%C0培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，必要時可于 23d 后換1次生長液，類上皮細胞在57d后可長成單層細胞，成纖維細胞則以 34d 或57d為宜。單層細胞已鋪滿瓶皿底面時，如繼續(xù)培養(yǎng)，則易老化，甚至脫落； 感染病毒等可影響特異性細胞病變效應的判斷，因此成片細胞不能當天使用對應 換成維持液（不含或僅含2%以下血清的培養(yǎng)液），以后每隔57d換維持液1次， 一般可維持13周。（三）這種長成單層的細胞可進行傳代培養(yǎng)。細胞傳代時，首先棄去培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液，加入5mL左