細胞凍存復蘇傳代轉(zhuǎn)染

1、細胞培養(yǎng)系列方法實驗前準備】(1)實驗前準備好高壓的離心管、凍存管、1ml/100ul槍頭、PBS容液。( 2)清潔超凈工作臺面，照紫外 30 分鐘；同時根據(jù)需要將培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶PBS液、雙抗置于室溫下復溫。細胞的凍存與復蘇實驗用品】1)2)材料：培養(yǎng)的貼壁細胞( 70%-80%融合)、于液氮中凍存的細胞試劑：PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DME培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲亞砜(DMS)雙抗 設備：培養(yǎng)瓶、巴氏吸管、15ml離心管、1.5ml凍存管、盛酒精的噴壺、 酒精燈、水浴鍋、 CO2 培養(yǎng)箱、離心機、液氮灌、倒置顯微鏡、超凈工作 臺。試劑配制：(1)完全培養(yǎng)基含90%DME培養(yǎng)液加1

2、0%勺胎牛血清加1%勺雙抗。(2) 凍存液含80%勺DME培養(yǎng)基加10%勺胎牛血清加10%勺DMSO用吸管混勻，置于4C冰箱中備用。細胞勺凍存(1)依照傳代勺方法用 0.25%胰蛋白酶液對處于對數(shù)生長期勺單層細胞進行消化。(2) 收集消化細胞于離心管中， 800-1000r/min 離心 5min。(3) 棄上清液，加入適量凍存液，用吸管吹打細胞制懸，調(diào)整細胞密度為675*10 -1*10 個/ml。(4) 每個凍存管分裝細胞懸液 1.5ml ，旋緊凍存管勺蓋，并用封口膜密封。(5) 在凍存管上標明細胞勺名稱、凍存時間、凍存人名等。(6) 將凍存管置于如下條件下逐步加以凍存：4C ,0.5h

3、T-20 C,仆-80 C,過夜7轉(zhuǎn)入液氮灌中。細胞勺復蘇(1)準備水浴鍋，調(diào)溫度至38C。打開離心機。(2)用止血鉗從液氮灌中取出細胞凍存管1只，迅速將其置入38C水浴鍋中,不斷搖動使凍存的細胞懸液盡快融化。3)用酒精棉球擦拭凍存管，放入超凈工作臺中。4)將已融化的細胞懸液用吸管移入離心管中，加 10倍體積的DME培養(yǎng)基,吹打混勻。1500r/min 離心4min,棄上清液。7)加入培養(yǎng)液吹打沉淀的細胞,使其懸浮,對細胞進行計數(shù)。按5*105個/ml的細胞濃度，將細胞接種在培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h 后取出培養(yǎng)瓶，觀察細胞生長狀況。注意事項】8)1)對數(shù)期的細胞增值能力強, 凍存后生

4、存率較高, 因此,在進行細胞凍存時,應盡量選擇處于此期的細胞加以凍存。為了保證復蘇后細胞的存活率, 復蘇接種時, 細胞的濃度不能太低, 最好控制在5*106-1*10 7個/ml，這樣才能保證復蘇成功。3)凍存管的瓶蓋應封蓋嚴密,以免復蘇時細胞外溢。4)同時,一次復蘇的凍存管數(shù)量不要太多,否則會引起水復蘇時，從液氮取出凍存管到水浴中融化的過程要快， 否則會導致冰晶的 形成，傷害細胞。浴鍋中傳熱不佳,為防止液氮凍傷,延緩凍存的細胞懸液融化的時間。注意戴上防護手套。實驗結(jié)果及分析】經(jīng)復蘇剛接種的細胞是懸浮于培養(yǎng)基中的。 復蘇成功的細胞24h左右可貼壁,48h 后即可開始生長、增殖。復蘇不成功的細胞

5、，將繼續(xù)懸浮于培養(yǎng)液中，不能 貼壁。細胞的傳代培養(yǎng)實驗用品】材料：原代培養(yǎng)的肝細胞、原代培養(yǎng)的外周血淋巴細胞 試劑：PBS液、DME培養(yǎng)基(含10%小牛血清)、0.25%胰蛋白酶消化液 設備： 25ml 培養(yǎng)瓶、吸管、離心管、酒精棉球、酒精燈、離心機、倒置 顯微鏡、超凈工作臺、C02培養(yǎng)箱實驗方案】1. 貼壁細胞的傳代培養(yǎng)1)用吸管吸出原代培養(yǎng)的肝細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液。2)向瓶內(nèi)加入適量的PBS液，輕輕搖動后倒掉。每25ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml,消化液的量以覆蓋整個細胞培養(yǎng)面為宜，置于37C的培養(yǎng)箱環(huán)境中。輕輕搖動培養(yǎng)瓶,在倒置顯微鏡下對培養(yǎng)細胞進行觀察，當細胞胞質(zhì)回縮、

6、細胞間隙增大時，迅速將消化液吸出。4)加入PBS液于培養(yǎng)瓶中，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，然后用吸管將溶液吸出, 加入含血清的培養(yǎng)液終止消化。5)用吸管吸取培養(yǎng)液，反復輕輕吹打瓶壁，制備細胞懸液。吹打的部位 應均勻，可按從上到下、從左到右的順序進行，保證瓶底各個部位的細胞均能被吹到。此外，吹打時不能用力過猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細胞。6)將吹打后的細胞置于倒置顯微鏡下觀察，當發(fā)現(xiàn)原貼壁的細胞均已懸浮于培養(yǎng)液中，成片的細胞已分散成小的細胞團或單細胞，即可終止吹打。7)收集細胞懸液于離心管中，1000r/min，離心5-8min，去除上清。 細胞計數(shù)，按照 1*105-1*10 6個細胞的密度接種細胞于新

7、培養(yǎng)瓶中。2. 懸浮細胞的傳代1) 將原代培養(yǎng)的外周血淋巴細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管中。(2) 800-1000r/min 離心 5min,去除上清液。3) 加新的培養(yǎng)液到離心管中，吸管吹打、制懸。根據(jù)細胞的數(shù)量多少，將細胞懸液按 1:2 或1:3 的比例分別接種于新的培養(yǎng)瓶中。注意事項】1) 消化過程中需根據(jù)培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化來嚴格控制消化時間。 當胞質(zhì)回縮、細胞間的連接變松散等情況出現(xiàn)時， 應終止消化。 因上皮樣細胞彼此間連 接較為緊密， 其消化時的時間通常比成纖維細胞長。 此外，首次傳代的細胞與已建系的細胞相比，也需要更多的消化時間。2) 首次傳代的細胞因需適應新的環(huán)境， 可適當增加

8、其接種量， 以促進生存與增殖。3） 在對細胞進行吹打時，不能用力過猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細胞。4） 傳代培養(yǎng)的過程通常較長， 細胞被污染的可能增加， 因此，必須嚴格進行無菌操作。實驗結(jié)果及分析】用倒置顯微鏡觀察可見接種 24h 后，大多數(shù)肝細胞已貼附于培養(yǎng)瓶底部， 有少數(shù)細胞懸浮于培養(yǎng)基中。48h以后，細胞開始增殖、細胞的數(shù)量增多，在接種 的肝細胞或肝細胞團周圍可見新生細胞長出， 這些細胞內(nèi)含物少而較為透明， 胞體輪廓通常較淺。 96h 以后，培養(yǎng)細胞數(shù)量明顯增多，并逐漸匯合，細胞輪廓清 晰、可見。細胞轉(zhuǎn)染實驗用品】細胞、6孔板、血清、培養(yǎng)基 DMEMOPTI-MEMGSK-3/wt 的

9、質(zhì)粒、Lipofectamine2000、GSK-3/wt的質(zhì)粒、鏈霉素/青霉素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS （磷酸鹽緩沖1. 細胞的準備實驗前一天，將細胞接種入6孔板中，每孔中培養(yǎng)基的體積為1ml，細胞環(huán)境控制在37C、5%COe養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞達到90%度時，準備轉(zhuǎn)染，在 轉(zhuǎn)染前一晚換新鮮的有血清培養(yǎng)基，使細胞狀態(tài)良好。2.轉(zhuǎn)染GSK-3/wt的質(zhì)粒準備無血清培養(yǎng)基DMEM 0PTI-MEM轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 。（2） 轉(zhuǎn)染前一小時棄去培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，換預先預熱的無血清培養(yǎng)基。 根據(jù)Lip-2000轉(zhuǎn)染說明書算出所需要的Lip-2000的體積，

10、根據(jù)各轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的 濃度算出各自所需體積見表 2。表2所用質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的量esselSurfaceAreaP erWell(cm2)RelativesurfaceArea(vs.24well)VolumeofPlat ingMediumDNA(ug)a ndDilutio nVolume(ul)Lip ofectami ne2000(ul)An dDilutio nVolume(ul)1052ml4.0ugi n250ul10uli n250ul(4) 將質(zhì)粒加入0PTI-MEM輕輕混勻。 將Lipofectamine2000加入OPTI-MEI后輕輕混勻后，并計時孵育5分鐘。將質(zhì)粒加入Lip

11、ofectamine2000中，輕輕混勻后，計時孵育20分鐘。(7) 20分鐘后緩慢將Lipofectamine2000-質(zhì)?；旌衔锛尤肱囵B(yǎng)孔中。(8)37 C、5%CO&養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時。(9)提取細胞蛋白。注意事項(1)(4)傳代細胞的準備細胞在轉(zhuǎn)染前 24h傳代，待細胞密度達90%度時即可進行轉(zhuǎn)染。如果轉(zhuǎn)染前細胞生長不足12h,細胞就不能很好地吸附在培養(yǎng)皿上，與脂類接觸時易于脫落。用Lipofectin轉(zhuǎn)染時，不要用聚丙烯試管，因為Lipofectin中的陽離子脂類會與聚丙烯發(fā)生非特異結(jié)合，而影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。在添加DNA脂質(zhì)體混合液前，用無血清培養(yǎng)液充分洗滌轉(zhuǎn)染細胞很重要,因為血清會強力抑制轉(zhuǎn)染；有些胞外基質(zhì)復合物，如硫酸蛋白聚糖，也可抑制轉(zhuǎn)染。GFP表達的影響因素主要與轉(zhuǎn)染時的溫度、PH值和觀察時間有關。同一表達載體轉(zhuǎn)染同一種細胞后，分別在 33C和37C條件下培養(yǎng)，則33C條件 下培養(yǎng)者可觀察到較強的熒光，而37 C條件下培養(yǎng)者熒光較弱