醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科畢業(yè)論文范例-供參考

1、 畢 業(yè) 論 文題 目：乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證 姓 名： 張珊 學(xué) 號(hào)： 系 別： 年 級(jí)： 專 業(yè)： 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn) 指導(dǎo)教師： 二 一 一 年 十二 月目 錄中文文獻(xiàn)英文摘要前 言。1. 材料與方法。1.1 試劑盒1.2 儀器1.3 方法1.3.2鋪板方案1.3.3加樣步驟2. 結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍2.2 準(zhǔn)確度（回收率）的驗(yàn)證22.3 精密度的驗(yàn)證2.3.1 板內(nèi)精密度的驗(yàn)證2.3.2 板間精密度的驗(yàn)證2.4 檢測(cè)限（LOD）計(jì)算53. 討論53.1 乙肝表面抗原定量分析的意義53.2 常用定量分析方法63.3 方法概述63.4 方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容63.5 結(jié)果分析

2、及應(yīng)用評(píng)價(jià)7參考文獻(xiàn)7 乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證摘 要目的：對(duì)福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以判斷是否能用于臨床樣本分析。方法：ELISA法定量分析，應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8ng/ml做2倍稀釋的6個(gè)濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個(gè)濃度梯度5復(fù)孔做準(zhǔn)確度，精密度和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.997，準(zhǔn)確度97.07%，1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)15%的要求，檢測(cè)限LOD為0.172ng/ml，低濃度樣品（1.5ng/ml）的

3、檢測(cè)在準(zhǔn)確性和精密度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測(cè)。結(jié)論：該HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒不能用于臨床標(biāo)本的分析。關(guān)鍵詞 乙肝表面抗原 ELISA 定量分析 方法學(xué)驗(yàn)證The reification of the HBsAg ELISA quantitative methodologyAbstractObject: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biological engineering company to make sure whether it ca be used to th

4、e analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted six concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately

5、precise and detection .Results: standard curve ,R2=0.997, the accuracy of RSD of 1.5ng/m is 16.78%，the RSD that cannot meet the demand of ng/ml basic level is less than 15% in common. The LOD is 0.172ng/ml, the testing of Low concentration samples （1.5ng/ml）are lower than high concentration samples

6、in both accuracy and precision , which as a result make it unsuitable for low concentration sample testing. Conclusion: the ELISA quantitative analysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical Sample.Key wordsHBsAg Quantitative analysis Verification Methodology. I前 言乙肝病毒感染是我國(guó)最常見的感染性疾

7、病之一，而乙型肝炎血清標(biāo)志物是檢測(cè)乙肝病毒感染最主要的病原標(biāo)志。隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，抗原抗體檢測(cè)靈敏度明顯提高，使低水平乙肝病毒得以檢出，對(duì)臨床診斷及流行病學(xué)有重要意義1。ELISA法具有較高靈敏度、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可進(jìn)行定量和半定量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，可以在酶免疫分析儀上做批量檢測(cè)。目前臨床上多傾向于做定量分析，若想知道檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠，實(shí)驗(yàn)室則必須對(duì)所用試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)對(duì)福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確度，精密度和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)告如下。1. 材料與方法1.1 試劑盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍(lán)圖生物工程

8、有限公司出品。1.2 儀器酶標(biāo)儀：Bio-Rad 680 ；洗板機(jī)：Bio-Rad 1575；超純水系統(tǒng)：Millipore Elix ；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；振蕩器（蘇州管械，KJ-201A）；移液器；Tip頭；EP管。1.3 方法1.3.1溶液配置 1PBS緩沖液的配置： 稱取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。標(biāo)準(zhǔn)品的配置：原始標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8 ng/ml。取6個(gè)2mlEP管，分別標(biāo)記為S1-S6。50ul/wel

9、l, 共1孔需50ul，每孔配置60ul備用，按照下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。編號(hào)終濃度（ ng/ml）預(yù)加1PBS取剩余（ul）標(biāo)記（ul）S180標(biāo)準(zhǔn)品120S2460S16060S3260S26060S4160S36060S50.560S46060S60.2560S56060 質(zhì)控品的配置：50ul/well, 共5復(fù)孔需250ul，配置300ul備用，取3個(gè)2mlEP管，分別標(biāo)記為C1，C2，C3，按照下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。編號(hào)終濃度（ ng/ml）預(yù)加1PBS取剩余（ul）標(biāo)記（ul）C16150標(biāo)準(zhǔn)品450C23300C1300300C31.5300C23003001.3.2鋪板方案 取

10、出試劑盒中已包被酶標(biāo)板，取出板條，按照下表鋪板方案進(jìn)行鋪板在相應(yīng)孔中依次加入系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白對(duì)照，每孔50ul。空白對(duì)照加入1PBS緩沖液。12345AS1C1C2C3PBSBS2C1C2C3PBSCS3C1C2C3DS4C1C2PBSES5C1C3PBSFS6C2C3PBS1.3.3加樣步驟加入酶標(biāo)抗體，50 ul/well，震蕩。37電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min，取出后洗板4次， 加入A、B液, 50 ul/ well，37電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15 min。加入終止液，50 ul/ well。酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，蓋上蓋子，在電腦上打開Microplate Manager 5.2軟件，選

11、擇450nm波長(zhǎng)（參照波長(zhǎng)630nm），設(shè)置LAYOUT和報(bào)告模式，測(cè)定各孔吸收值。2. 結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度對(duì)應(yīng)的實(shí)測(cè)OD值HBsAg(ng/ml)84210.50.25OD 1.661.000.620.390.310.27以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系，結(jié)果顯示R2=0.9973，顯示具有良好的相關(guān)性2.2 準(zhǔn)確度（回收率）的驗(yàn)證 質(zhì)控品理論稀釋濃度對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)濃度值HBsAg(ng/ml)測(cè)定值1234566.244.565.736.096.4033.363.293.553.283.481.51.241.271.171.

12、171.20質(zhì)控品做了3個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度做了5個(gè)復(fù)孔，下表是對(duì)每個(gè)濃度梯度進(jìn)行準(zhǔn)確度（回收率）的驗(yàn)證。HBsAg(ng/ml)測(cè)定值（ng/ml）回收率（%）平均回收率RR（%）3個(gè)濃度的平均回收率66.24103.9397.5897.07%4.5675.925.7395.576.09101.456.40106.6033.36112.13113.073.29109.573.55118.403.28109.403.48115.831.51.2482.4780.561.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93 結(jié)果顯示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收

13、率為97.58%，113.07%，滿足限度要求在85%-115%的范圍內(nèi)，而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率為80.56%，滿足方法定量限在80%-120%的范圍內(nèi)。3個(gè)濃度梯度的平均回收率為97.7%，顯示準(zhǔn)確性好。2.3精密度的驗(yàn)證2.3.1 板內(nèi)精密度的驗(yàn)證HBsAg(ng/ml)測(cè)定值RSD(%)1234566.244.565.736.096.405.800.7412.7333.363.293.553.283.483.390.123.501.51.241.271.171.171.201.210.043.69上表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，也就是變異系數(shù)CV值，HBs

14、Ag 6ng/ml的5個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精密度不高，但是也符合ng/ml級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn)。而3ng/ml,和1.5ng/ml的變異系數(shù)CV為3.5%，3.7%，符合顯示孔間重復(fù)性好，符合ng/ml級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求，精密度高。2.3.2 板間精密度的驗(yàn)證 從同一實(shí)驗(yàn)室中獲取2組同樣的數(shù)據(jù)，做板間精密度的驗(yàn)證。首先對(duì)同一實(shí)驗(yàn)條件下不同實(shí)驗(yàn)人員所獲得的數(shù)據(jù)是否可用于板間分析做驗(yàn)證。HBsAg(ng/ml)84210.50.25第二組OD值1.981.4

15、20.860.580.400.31第三組OD值 1.310.770.360.170.090.03以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系。以上標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2 =0.967，第三組數(shù)據(jù)R2 =0.991。第二組數(shù)據(jù)由于有一些孔與標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離較大，但考慮到隨機(jī)抽樣與均數(shù)存在一定誤差，還是可以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。下表對(duì)3組數(shù)據(jù)做板間分析。HBsAg(ng/ml)測(cè)定值RSD(%)1234566.236.105.994.555.785.395.736.086.346.086.646.496.396.845.966.040.55 9.1033.363.

16、362.593.282.932.713.553.532.813.283.072.493.472.992.523.060.3712.061.51.241.461.191.271.51.241.171.731.251.161.711.211.191.761.111.340.2316.78從表中3個(gè)組的數(shù)據(jù)比較可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分別為9.10%，12.06%，滿足對(duì)ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)15%的要求，精密度高。而HBsAg 1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)LOD，此標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點(diǎn)為0.25，大于LOD（0.1

17、72），故此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好。3. 討論3.1 乙肝表面抗原定量分析的意義乙肝表面抗原是乙肝兩對(duì)半的其中一項(xiàng)，乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)對(duì)乙肝疾病的診斷，病情監(jiān)測(cè)，療效觀察起到了一定的作用。但隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床及患者的要求，特別是在療效觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的不足。隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對(duì)半定量測(cè)定成為可行，大大彌補(bǔ)了乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)的不足。而且乙肝兩對(duì)半定量檢測(cè)可與HBV DNA熒光測(cè)定相互補(bǔ)充，綜合評(píng)價(jià)患者病情與藥物療效，為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者提供了正確判斷病情的依據(jù)【2】。這在目前的臨床治療中應(yīng)用十分廣泛。3.2 常用

18、定量分析方法此次實(shí)驗(yàn)只是對(duì)一種試劑盒的可用性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證， 而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又稱解離增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析，是近十年發(fā)展起來的一種微量分析方法。此技術(shù)集酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，且測(cè)定范圍更寬，試劑盒貨架壽命長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)便和非放射性等特點(diǎn)，成為最有潛力的一種標(biāo)記免疫分析方法【3】。全自動(dòng)酶免分析儀目前也廣泛應(yīng)有，自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的操作手段使實(shí)驗(yàn)達(dá)到了全過程控制和全過程標(biāo)準(zhǔn)化分析，大大提高了實(shí)驗(yàn)的精密度【4】，使檢測(cè)結(jié)果更趨穩(wěn)定，從而保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.3 方法概述目前普遍使用的HBsAg試劑盡管在制備時(shí)采用

19、了高親和力的單克隆抗體，并且使包被抗體、酶標(biāo)抗體的結(jié)合位點(diǎn)盡可能的遠(yuǎn)。以避免競(jìng)爭(zhēng)抑制，最大程度地解決鉤狀效應(yīng)（HOOK）的問題【5】。本次實(shí)驗(yàn)是對(duì)實(shí)驗(yàn)室的一種試劑盒，即福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以判斷是否能用于臨床樣本分析。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。往預(yù)先包被HBsAg捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)品，HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺和樣品中得HBsaAg呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度OD值

20、，計(jì)算樣品濃度。應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6個(gè)濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個(gè)濃度梯度5復(fù)孔做質(zhì)控，進(jìn)行準(zhǔn)確度，精密度和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證。選擇最低濃度為0.25ng/ml的原因是因?yàn)?，絕大多數(shù)HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量在5ng/ml 600ug/ml之間，高者可達(dá)2000ugml以上【6】，滿足了現(xiàn)階段文獻(xiàn)報(bào)道的最低濃度值。3.4 方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容 方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容一般包括標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確度，精密度和檢測(cè)限。標(biāo)準(zhǔn)曲線亦稱校正曲線，系指生物樣品中所測(cè)定的樣品濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，通常用回歸分析方法所得的回歸方程

21、來評(píng)件，此實(shí)驗(yàn)所用了6個(gè)濃度點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法準(zhǔn)確度指待測(cè)濃度與真實(shí)濃度的接近值了，一般用相對(duì)回收率表示，限度要求在85%115%的范圍內(nèi)。精密度則表示分析方法的可重復(fù)性，是對(duì)同一樣品每次測(cè)定結(jié)果的一致性，用標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，可做板內(nèi)和板間的驗(yàn)證，對(duì)于ug/ml級(jí)水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)10%, ng/ml級(jí)水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)15%。檢測(cè)限則表示分析低濃度樣品的能力，通常又稱為靈敏度。3.5 結(jié)果分析及應(yīng)用評(píng)價(jià)第一組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9973，顯示具有良好的相關(guān)性，HBsAg 濃度為6ng/ml和3ng/ml 的回收率分別為為97.58%，符合113.07%，符合限度要求

22、在85%115%的范圍內(nèi)。但是HBsAg 濃度為.5ng/ml的回收率為80.56%，顯示此試劑盒對(duì)于低濃度樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確度差。在精密度方面，6，3，1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別為12.73% ，3.69% ，3.50%，而HBsAg 6ng/ml的5個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精密度不高，但是也符合ng/ml級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn)不屬于試劑盒的問題，故可以認(rèn)為此試劑盒對(duì)于批內(nèi)高、低濃度樣品的檢測(cè)精密度還是可以的。在做3個(gè)組數(shù)據(jù)的批間的精密度分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)6，3，1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別9