視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間通訊功能激光損傷的防護(hù)

1、    視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間通訊功能激光損傷的防護(hù)        【摘要】目的觀察在激光照射下,不同濃度的地塞米松及維拉帕米(verapamil)對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）細(xì)胞間通訊功能的保護(hù)作用。方法取10只豬眼球分離其RPE細(xì)胞行體外細(xì)胞培養(yǎng),在激光照射前2h，采用不同濃度的地塞米松及維拉帕米分別孵育其第4代傳代細(xì)胞,然后測(cè)定激光照射后光凝斑周圍細(xì)胞間通訊功能。結(jié)果125mg/L的地塞米松及20mg/L的維拉帕米均能在

2、激光照射的情況下保護(hù)RPE細(xì)胞間通訊功能,而較高濃度的藥物保護(hù)作用更大。結(jié)論地塞米松和維拉帕米均能在離體條件下保護(hù)激光損傷后的RPE細(xì)胞間通訊功能,且其保護(hù)作用與用藥濃度有關(guān)。【關(guān)鍵詞】色素上皮，眼激光Protect intercellular communication of pigment epithelium after laser photocoagulationHE Shouzhi, WANG Fengxiang, GU Zheng, et al. Department of Ophthalmology, PLA General Hospital, Beijing 100853【Ab

3、stract】ObjectiveTo observe the protective effect on the intercellular communication of retinal pigment epithelial (RPE) cells of dexamethasone (Dex) and verapamil (Ver) at different concentrations after laser photocoagulation. MethodTen pig eyes were used to culture pig pigment epithelium cells. Use

4、 different concentrations of Dex and Ver to incubate cultured RPE cells 2 hours before laser coagulation, and then measure the intercellular communication function of confluent cells surrounding the coagulation spots after photocoagulation. Result125 mg/L Dex and 20 mg/L Ver could protect the interc

5、ellular communication of RPE cells under laser photocoagulation. The high concentration of drugs had better result. ConclusionBoth Dex and Ver can preserve the intercellular communication in vitro. The protective capacity is related to the concentration of drug.【Key words】Pigment epithelium of eyeLa

6、sers現(xiàn)代激光武器、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、工業(yè)及實(shí)驗(yàn)室中對(duì)激光的廣泛使用,使得眼激光損傷的危險(xiǎn)因素明顯上升。在臨床上激光引起的視網(wǎng)膜損傷并不罕見,同時(shí),激光武器對(duì)眼的損傷在海灣戰(zhàn)爭(zhēng)中也曾有報(bào)道1。文獻(xiàn)報(bào)告,激光可對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞造成損傷2，3。為此，我們觀察在激光照射下，不同濃度的地塞米松及鈣離子阻滯劑-維拉帕米(verapamil)對(duì)RPE細(xì)胞間通訊功能的保護(hù)作用,并探討其保護(hù)機(jī)制。材料和方法一、材料1.動(dòng)物：10只豬眼球，取自宰殺后的北京黑豬(北京清河第三肉聯(lián)廠),均于死后23h內(nèi)取材。修剪除眼球壁外周的軟組織,用少量肥皂水刷洗,并

7、用Hank液反復(fù)沖洗后，浸泡于含有200g/ml慶大霉素的Hank液中備用。2.主要儀器和試劑：(1)儀器：ACAS ULTIMA型激光掃描共聚焦顯微成像儀(美國Meridien公司)。氬激光發(fā)射儀NOVUS-2000型(美國Coherent公司)。（2）試劑:5,6-碳氧熒光素醋酸鹽(5,6-carboxyflorescein diacetate,CFDA)(美國Molecular Probes公司),以1mg/ml的濃度置于-20下保存。培養(yǎng)液由RPMI1640粉劑（美國Gibocoi laboratories)配制,內(nèi)含慶大霉素80U/ml,卡那霉素1.0mg/ml,10%小牛血清pH值

8、7.07.4。胰蛋白酶(上海東風(fēng)試劑廠)用Hank液配成0.25%的溶液。地塞米松(江蘇揚(yáng)州制藥廠)。維拉帕米(北京制藥廠)。含鈣、鎂的Hank液,pH值7.4。二、方法1.細(xì)胞培養(yǎng):參照文獻(xiàn)4的方法,在無菌條件下自鋸齒緣后剖開眼球,棄去前節(jié),將后節(jié)眼球置于自制眼球托上,除去玻璃體及視網(wǎng)膜感覺部,后節(jié)眼杯用Hank液輕輕漂洗,0.25%胰蛋白酶消化1520min,分離RPE細(xì)胞,經(jīng)離心、漂洗后接種于RPMI1640培養(yǎng)液中,于37體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中培養(yǎng),原代RPE細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)后，按13傳代培養(yǎng),將第4代傳代細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,約2×104個(gè)細(xì)胞/孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h后

9、細(xì)胞貼壁生長呈單層融合狀態(tài)時(shí)備用。地塞米松組：光凝前2h在不同的培養(yǎng)孔中分別加入125、250及500mg/L的地塞米松；維拉帕米組：分別加入20、40及80mg/L的維拉帕米；空白對(duì)照組加Hank液。2.激光照射損傷:參照文獻(xiàn)5的方法,用裂隙燈發(fā)射系統(tǒng)argon藍(lán)綠激光對(duì)RPE細(xì)胞進(jìn)行照射,96孔板下放置黑紙作為背景,激光參數(shù):輸出功率900mW,光斑直徑200m,激光照射時(shí)間0.2s,每孔做20個(gè)光凝斑。3.CFDA負(fù)載:貯備1mg/ml的CFDA，染色時(shí)用其稀釋液。將96孔培養(yǎng)板中光凝后的RPE細(xì)胞用Hank液清洗2次,加入終濃度為30mol/L的CFDA50l。在37體積分?jǐn)?shù)為5%的C

10、O2孵箱中孵育15min,用Hank液清洗多余的CFDA,加培養(yǎng)液50l,上機(jī)。4.熒光光淬滅及恢復(fù)速率的觀察:在激光掃描共聚焦顯微鏡下選定激光光凝斑周圍的細(xì)胞作為觀察范圍,在此范圍內(nèi)選擇周圍與2個(gè)細(xì)胞緊密相連的單個(gè)細(xì)胞作為觀察對(duì)象,另選一簇細(xì)胞不作淬滅處理，而作為背景校正,對(duì)所選定的單個(gè)細(xì)胞以高強(qiáng)度脈沖激光行熒光分子光淬滅,然后通過低強(qiáng)度激光掃描探測(cè)周圍細(xì)胞非淬滅分子向淬滅細(xì)胞擴(kuò)散速率。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)2min,計(jì)算機(jī)自動(dòng)采集數(shù)據(jù)后計(jì)算熒光恢復(fù)速率平均百分率,并自動(dòng)以背景校正熒光作為參考進(jìn)行計(jì)算。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法：本文數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)F檢驗(yàn)。結(jié)果一、地塞米松對(duì)RPE細(xì)胞通訊功能的保護(hù)不

11、同濃度地塞米松組的細(xì)胞通訊功能與對(duì)照組比較，差異有顯著性(F=62.81,P=0.0001),其中125mg/L組與250mg/L及500mg/L組比較，差異有顯著性(P<0.01),而后兩組間比較，差異無顯著性(P>0.05)(表1)。表1激光照射后各組豬眼體外RPE細(xì)胞間通訊功能的比較組別細(xì)胞數(shù)熒光恢復(fù)率(±s，%/min)對(duì)照組131.382±0.569地塞米松組125mg/L142.315±0.528*250mg/L124.013±0.785*500mg/L124.267±0.577*維拉帕米組20mg/L142.238&#

12、177;0.537*40mg/L143.617±0.812*80mg/L133.824±0.928*與對(duì)照組比較，P=0.0001與本組第一個(gè)比較，P<0.001 二、維拉帕米對(duì)RPE細(xì)胞通訊功能的保護(hù)不同濃度維拉帕米各組間細(xì)胞的通訊功能與對(duì)照組比較，差異有顯著性(F=33.62,P=0.0001),其20mg/L組與40mg/L及80mg/L組比較，差異有顯著性(P<0.01),后兩組間比較，差異無顯著性(P>0.05)(表1)。討論激光所致視網(wǎng)膜損傷包括視網(wǎng)膜光感細(xì)胞、RPE細(xì)胞、müller細(xì)胞,脈絡(luò)膜血管等,其中RPE細(xì)胞對(duì)短波激光的能量

13、吸收較多,損傷發(fā)生得較早6。本研究證實(shí)，不同能量的激光可損傷光凝斑周圍的RPE細(xì)胞間的通訊功能7,本研究在此基礎(chǔ)上觀察了不同濃度的糖皮質(zhì)激素-地塞米松及鈣通道阻滯劑-維拉帕米對(duì)激光照射所致RPE細(xì)胞間通訊功能損傷的保護(hù)作用。一、激光照射后地塞米松對(duì)RPE細(xì)胞間通訊功能的保護(hù)作用許多研究表明,糖皮質(zhì)激素及鈣離子阻滯劑均能對(duì)視網(wǎng)膜光損傷起保護(hù)作用。激素制劑用于治療激光眼底損傷,可以充分發(fā)揮其改善全身狀況、調(diào)節(jié)體內(nèi)應(yīng)變機(jī)制、緩解病情及對(duì)癥治療的作用。在糖皮質(zhì)激素中,地塞米松療效最好,副作用最小8,普遍認(rèn)為其作用機(jī)制可能與減輕炎癥反應(yīng),穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),從而減少自由基的產(chǎn)生和破壞作用9有關(guān)。同時(shí)地塞米松

14、能阻止視網(wǎng)膜下新生血管的形成10。糖皮質(zhì)激素可加快血-視網(wǎng)膜屏障的形成,減輕熒光滲漏和視網(wǎng)膜水腫,提高光感細(xì)胞存活率,加快外界膜的形成和脈絡(luò)膜血管的開放,增加血流,減少視網(wǎng)膜組織的局部缺血,保存RPE細(xì)胞,減輕損傷,從而限制由RPE細(xì)胞損傷帶來的對(duì)視網(wǎng)膜光感細(xì)胞的繼發(fā)性損傷。而最重要的是糖皮質(zhì)激素可阻止脂質(zhì)過氧化,減少自由基的形成,保護(hù)膜結(jié)構(gòu),保護(hù)膜的穩(wěn)定性功能1。本研究發(fā)現(xiàn)，125mg/L的地塞米松對(duì)RPE細(xì)胞間通訊功能有一定的保護(hù)作用,并與濃度有關(guān),但不是線性關(guān)系。250mg/L與500mg/L兩組間差異無顯著性,說明其濃度達(dá)到一定的范圍后,對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用趨于穩(wěn)定。通過本實(shí)驗(yàn)可以了解地塞

15、米松對(duì)RPE細(xì)胞通訊功能的保護(hù)。因此，我們認(rèn)為地塞米松對(duì)細(xì)胞通訊功能的保護(hù)主要與其阻止脂質(zhì)過氧化、保護(hù)膜的穩(wěn)定性功能密切相關(guān)。二、激光照射后維拉帕米對(duì)RPE細(xì)胞間通訊功能的保護(hù)作用鈣阻滯劑是一類能阻斷細(xì)胞膜鈣通道,減少細(xì)胞外液鈣內(nèi)流的藥物,最初用于心血管系統(tǒng),近年來因鈣離子廣泛的生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，而使其應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。Edward等11報(bào)道，光損傷的視網(wǎng)膜變性可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高有關(guān),鈣離子阻滯劑可阻止細(xì)胞內(nèi)的鈣離子升高,而光損傷的視網(wǎng)膜變性可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高有關(guān),故鈣阻滯劑可緩解視網(wǎng)膜的變性,同時(shí)鈣離子阻滯劑可改善血流、防止視網(wǎng)膜缺血性改變。光照條件下,RPE細(xì)胞中的鈣離子升高,而鈣

16、離子阻滯劑能抑制其升高,保護(hù)RPE細(xì)胞免受侵害的同時(shí)保護(hù)光感細(xì)胞-色素上皮復(fù)合體。我們?cè)l(fā)現(xiàn)，激光照射后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞間通訊功能降低。本研究結(jié)果表明，鈣離子阻滯劑-維拉帕米能保護(hù)細(xì)胞間通訊,保護(hù)的程度與用藥的濃度有關(guān)。20mg/L維拉帕米就有明顯的保護(hù)作用,40及80mg/L濃度的藥物保護(hù)作用更明顯,但后兩者之間無明顯差別。由此可見，RPE細(xì)胞在激光損傷的情況下,其細(xì)胞間通訊功能的保持與維拉帕米用藥的濃度有一定的關(guān)系,但也不是線性關(guān)系,當(dāng)用藥達(dá)到一定的濃度后其保護(hù)作用即達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。分析其保護(hù)機(jī)制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高有關(guān)。綜上所述，地塞米松及維拉帕米均能保護(hù)細(xì)胞間的通訊功能,使

17、相連的PRE細(xì)胞群體在激光照射后保持功能的整體性,在此基礎(chǔ)上減少由RPE細(xì)胞膜功能損傷帶來的光感細(xì)胞繼發(fā)性損傷,也能在促使RPE細(xì)胞修復(fù)、盡快恢復(fù)血-視網(wǎng)膜屏障的同時(shí),抑制RPE細(xì)胞的過度增殖,減少視網(wǎng)膜下新生血管的形成,從而減少激光損傷帶來的繼發(fā)性病變。本課題受全軍“九五”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助(基金編號(hào)96M143)作者單位：何守志、王鳳翔(100853北京,中國人民解放軍總醫(yī)院眼科)；顧崢、黃靖香(病理科)；李楠(儀器中心)參考文獻(xiàn)1Lam TT,Takahashi K,Fu J,et al.Methylprednisolone therapy in laser injury of the

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