不同細胞周期肝癌細胞的粘附特性研究

1、    不同細胞周期肝癌細胞的粘附特性研究        摘要目的 研究大鼠肝實質(zhì)細胞癌細胞(HTC)與不同濃度膠原蛋白裱襯的人工基底膜的粘附特性和G1、S期HTC細胞與一定濃度膠原蛋白裱襯的人工基底膜的粘附特性。 方法 同步化G1和S期細胞以胸腺嘧啶核苷和秋水仙堿順序阻斷法及胸腺嘧啶核苷雙阻斷法分別獲得，細胞與人工基底膜的粘附特性采用微管吸吮技術測定。 結(jié)果 以胸腺嘧啶核苷和秋水仙堿順序阻斷法及胸腺嘧啶核苷雙阻斷法可分別獲得72.10%的G1期和98.94%的S期HTC細胞

2、，HTC細胞與膠原蛋白裱襯的人工基底膜的粘附力跟膠原蛋白的濃度成正相關關系，各組之間差異有顯著性；G1期HTC細胞的粘附力比S期顯著要大。 結(jié)論 腫瘤早期基底膜含量的增加可能有利于腫瘤細胞的趨化運動和粘附；G1期腫瘤細胞的粘附力比S期顯著要大，提示其細胞表面粘附分子受體分布的周期性差異以及G1期腫瘤細胞更易于粘附并穿透基底膜的可能。關鍵詞肝腫瘤 癌，肝細胞 粘附 細胞周期 微管吸吮Investigation on the adhesive properties of different cycle hepatoma cellsYU Weiqun, SONG Guanbin, LONG Mian

3、, et al.Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400044AbstractObjective To study the adhesive forces of HTC cells on different concentration of artificial basement membrane (collagen coated)and synchronous G1&S phase HTC cells on a certain concentration of artificial basement mem

4、brane. Methods The adhesive forces of HTC cells were investigated by micropipette aspiration technique. The synchronous G1 and S phase cells were achieved through thymine-2-desoryriboside and cochicine sequential blockage method and double thymine-2-desoryriboside blockage method respectively. Resul

5、ts HTC cells with 72.10% of G1 phase and 98.94% of S phase were achieved through thymine-2-desoryriboside and cochicine sequential blockage method and double thymine-2-desoryriboside blockage method respectively. The adhesive force of HTC cells on artificial basement membrane was in direct proportio

6、n to the concentration of collagen . G1 phase HTC cells had higher adhesive forces than S phase cells. Conclusion These studies suggested that the increase of basement membrane might be conducive to the chemotactic motion and adhesion of tumor cells; G1 phase cells were more capable of adhering to a

7、nd getting through basement membrane than S phase cells, and reflected the differences of receptors between G1 phase cells and S phase cells.Key wordsLiver neoplasms Carcinoma, hepatocellular Adhesion Cell cycle Micropipette aspiration對于腫瘤細胞與基底膜粘附的研究，較為常用的方法是計算細胞粘附百分比、細胞脫落率等，該方法提示的只是一種細胞的群體效應，也不能予以很

8、好的定量，并且腫瘤細胞常處于粘附與去粘附的活躍狀態(tài)。對于分細胞周期細胞粘附特性的研究則報道不多。我們擬用微管吸吮技術（Micropipette aspiration technique）對腫瘤細胞與基底膜的粘附特性進行一些探索。材料與方法一、材料大鼠肝實質(zhì)細胞癌細胞（HTC）由重慶醫(yī)科大學臨床生化教研室贈送，在本實驗室以RPMI1640+20%小牛血清（Gibco公司產(chǎn)品）傳代培養(yǎng)。主要考察不同濃度（1g/ml，2g/ml，5g/ml）鼠膠原蛋白（Sigma公司產(chǎn)品）裱襯人工基底膜表面細胞粘附性的差別和不同周期細胞（G1、S）在一定濃度（5g/ml）膠原蛋白裱襯人工基底膜表面粘附特性。二、方法

9、(一)同步化細胞制備及同步率檢測：1.G1期細胞同步化采取以胸腺嘧啶核苷和秋水仙堿順序阻斷后釋放的方法，其簡要步驟如下：取處于對數(shù)生長期的細胞加入胸腺嘧啶核苷至其終濃度為2mmol/L，37，5%CO2潮濕空氣中培養(yǎng)15小時，棄去培養(yǎng)液，以Hanks液清洗細胞后加入新鮮培養(yǎng)液及秋水仙堿至其終濃度為1g/ml，同上培養(yǎng)12小時，橫向輕輕搖動培養(yǎng)瓶收集M期細胞，于離心管中800r/min離心3分鐘，棄上清，然后加入新鮮培養(yǎng)液及血清常規(guī)培養(yǎng)，3小時后以0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶消化收集，其中部分細胞用于同步率檢測，部分細胞用于粘附性實驗。2.S期細胞同步化采取以胸腺嘧啶核苷雙阻斷法，簡要

10、步驟如下：取處于對數(shù)生長期的細胞加入胸腺嘧啶核苷至其終濃度為2mmol/L，培養(yǎng)15小時，棄去培養(yǎng)液，以Hanks液洗滌細胞后加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)10小時，再次加入胸腺嘧啶核苷至其終濃度為2mmol/L，培養(yǎng)15小時，棄去培養(yǎng)液，以Hanks液清洗細胞后加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)2小時后以0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶消化收集，其中部分細胞用于同步率檢測，部分細胞用于粘附性實驗。3.同步率檢測：將收集樣本以PBS清洗，碘化丙啶（PI）染色30分鐘，流式細胞儀檢測，進行細胞周期分析。(二)Chamber底面裱襯：取消毒好的Chamber一個，吸取400l 2g/ml的多聚賴氨酸（PDL，Sigma

11、公司產(chǎn)品）溶液均勻鋪滿整個Chamber底面，37水浴40分鐘，然后從Chamber邊緣吸去溶液，輕輕加入PBS液400l洗去未吸附之多聚賴氨酸共兩次，接著加入膠原蛋白溶液400l，均勻鋪滿整個Chamber底面，37水浴40分鐘后吸去溶液，重復上述清洗過程后備用。(三)粘附性測定技術：采用微管吸吮技術對細胞的粘附特性進行實驗測試，簡要方法如下：(1)制備約1×105個/ml的單細胞懸液，懸液中含10%小牛血清；(2)將顯微操作系統(tǒng)、實驗記錄系統(tǒng)及壓力控制系統(tǒng)等（參見吳澤志等1的方法）調(diào)試好備用；(3)吸取400500l細胞懸液加入裱襯好的Chamber中，置于顯微鏡37恒溫載物臺溫

12、育20分鐘；(4)在顯微操作視野下將微管（初壓為零）輕輕靠近細胞，然后給以一定負壓吸住細胞并勻速輕輕右拉，倘該負壓不足以拉脫細胞，則調(diào)高負壓后重試，直到剛好拉脫（臨界粘附力值）為止，并同時進行實驗記錄。(四)實驗數(shù)據(jù)處理1.實驗所測細胞粘附力(F)計算公式為：F=R2.P.Cos，其中R為微管內(nèi)半徑（在像處理系統(tǒng)上測出，本實驗微管內(nèi)半徑在2.53.5m之間），P為吸吮負壓，為微管與平面夾角，約10°左右，這樣Cos=Cos10°0.9851，因此數(shù)據(jù)處理時直接以1計算，則F=R2.P。2.實驗所測細胞各組粘附力值進行兩樣本均值的t檢驗。結(jié) 果一、細胞周期同步化用流式細胞儀測

13、定同步化于G1期和S期的HTC細胞，其同步率分別為72.10%和98.94%，并能穩(wěn)定維持這一水平。二、HTC細胞在不同濃度膠原蛋白裱襯人工基底膜表面的粘附力值，見表1。表1 HTC細胞在不同濃度人工基底膜裱襯表面的粘附力膠原F(10-10N)1mg/l(n=73)107.78±65.442mg/l(n=91)182.60±107.88*5mg/l(n=87)298.91±144.13+* 與Collagen 1g/ml比較，P<0.001；+ 與Collagen 2mg/ml比較，P<0.001；n為所測細胞個數(shù)，下同。 三、G1期（n77）和S期（

14、n100）細胞在5g/ml膠原蛋白裱襯人工基底膜表面的粘附力值分別為（275.86±232.80）×10-10和（161.16±120.40）×10-10N，差異有顯著性（P<0.001）。討 論腫瘤細胞與基底膜的作用，一般認為是：首先腫瘤細胞粘附于基底膜成份膠原蛋白和層粘連蛋白等，然后釋放水解酶破壞基底膜，最后是游走穿過基底膜。在此過程中，整合蛋白分子及其基底膜的配體起著調(diào)節(jié)粘附與去粘附的重要作用。HTC細胞與膠原蛋白裱襯的人工基底膜的粘附力與膠原蛋白濃度密切有關，各濃度組之間差異有顯著性，與王憲航等2的報道一致。王芳等3發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的生長，基底

15、膜膠原蛋白和層粘蛋白等的含量均增加，但隨著腫瘤的轉(zhuǎn)移又出現(xiàn)基底膜減少甚至缺損的現(xiàn)象。所以，其不同的濃度可能反映了腫瘤細胞與其不同的相互作用，其濃度的增加在腫瘤細胞穿透基底膜前可能起著重要作用，使腫瘤細胞產(chǎn)生趨化性，并定向活躍運動，同時提供較強的粘附力和粘著位點。G1期HTC細胞的粘附力顯著比S期的要大，并且標準差也特別大。一般來說轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞纖維粘連蛋白受體表達下降而層粘連蛋白受體增加。Liotta等4認為侵襲性的人乳腺癌細胞膜具有比良性乳腺損傷的細胞膜大50倍的層粘連蛋白結(jié)合能力。纖維粘連蛋白在改善腫瘤細胞的鋪展及促進S/G2期DNA的合成和增殖方面發(fā)揮較大作用，而層粘連蛋白則對腫瘤細胞的

16、粘附及運動游走所起作用更大3，Terranora等5認為腫瘤轉(zhuǎn)移主要通過層粘連蛋白對膠原蛋白具有強的粘附力，而從細胞周期角度講，M期細胞表達的纖維粘連蛋白受體是最少的，因此G1期和S期粘附力的差異可能就反映了其表面粘附分子受體，尤其是纖維粘連蛋白和層粘連蛋白受體分布的周期性差異。另外，層粘連蛋白與纖維蛋白溶酶具有很強的親和性，二者結(jié)合后可使纖維蛋白溶酶原活化成纖維蛋白酶水解層粘連蛋白和纖維粘連蛋白，及活化前膠原酶，從而降解基底膜，G1期細胞的高粘附力值及大標準差的現(xiàn)象，也可能與此有關，從而使G1期細胞表現(xiàn)出粘附與去粘附的活躍狀態(tài)，反映出在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，G1期細胞比S期細胞可能更易于粘附并穿透基底膜。基金項目:本課題受國家自然科學基金資助(基金編號39500037)作者單位:俞為群宋關斌龍勉吳澤志王遠亮蔡紹皙重慶大學生物工程學院參考文獻1吳澤志，邵開峰，宋關斌，等. 肝癌細胞在型膠原裱襯表面的粘附特性. 中華醫(yī)學雜志，1999, 79: 1-4.2王憲航，龍勉，王曉軍，等. 肝癌細胞與膠原蛋白裱襯表面粘附特性. 生物物理學報，1996, 12: 686-690.3王芳，高進. 惡性腫瘤體內(nèi)外生長和發(fā)展過程與細胞外基質(zhì)相關性的研究. 中華腫瘤雜志，1998, 20: 112-115.4Liotta LA, Rao CN, Barsky