克霉唑藥膜微生物限度檢查方法的驗證試驗研究

1、克霉唑藥膜微生物限度檢查方法的驗證試驗研究【關(guān)鍵詞】 克霉唑； 薄膜過濾法； 抑菌活性克霉唑（Clotrimazole）藥膜作為陰道局部外用制劑，中國藥典2005（CP2005）年版二部對受微生物污染的微生物限度有明確要求，對具有抗菌活性的藥品進(jìn)行微生物限度檢查，首先應(yīng)排除抗菌活性，經(jīng)驗證試驗來確認(rèn)其抑菌活性是否去除而不影響檢驗結(jié)果，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。2007年11月2008年2月為建立克霉唑藥膜微生物限度檢查方法，參考中國藥典，以試驗菌的回收測定為主要方法，測定克霉唑膜制劑在微生物限度檢查條件下對細(xì)菌、霉菌、酵母菌的代表菌的抑菌活性，并進(jìn)行方法選擇試驗1，2；對篩選出的敏感菌選擇用離心沉

2、淀與薄膜過濾法聯(lián)用消除其抑菌活性，經(jīng)選擇試驗確定供試液濃度及沖洗條件，按篩選出的方法作3個批號計數(shù)方法的驗證，對方法進(jìn)行評價3；對控制菌檢查方法進(jìn)行了驗證試驗研究，建立克霉唑藥膜的微生物限度檢查方法。 1 實驗材料及儀器 1.1 儀器與樣品 -2000型智能集菌儀、多次使用集菌器、一次性薄膜過濾器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）、離心機(jī)（800型沉淀離心機(jī)，上海手術(shù)器械十廠）、高壓蒸汽滅菌器、電子天平、生物安全柜、生化培養(yǎng)箱等?？嗣惯蛩幠?（ 規(guī)格：4mg，貴州德軒堂制藥有限公司生產(chǎn)批號：051225、051226、051227）。 1.2 培養(yǎng)基、稀釋劑及試劑 營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、玫瑰紅鈉瓊

3、脂、改良馬丁培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲胺瓊脂、亞碲酸鹽肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂、0.9%氯化鈉溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（中國北京三科科技開發(fā)公司生產(chǎn)，按CP2005版規(guī)定配制及滅菌）1。 1.3 試驗用菌種 大腸埃希菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylocoddus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、白色念珠菌Candida aibicans、黑曲霉Aspergillus niger、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaCMCC（B）10104，菌種均來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保存中心，均為不超

4、過5代的菌株1。 2 方法 參照CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法中計數(shù)方法的驗證、控制菌檢查方法的驗證。 2.1 菌液制備方法 取經(jīng)（361）培養(yǎng)1618 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯新鮮培養(yǎng)液，加入0.9%氯化鈉溶液或營養(yǎng)肉湯，10倍遞增稀釋制成50100 cfu/ml菌液，計數(shù)備用。取經(jīng)26 培養(yǎng)2448 h的白色念珠菌的改良馬丁液體新鮮培養(yǎng)液，用0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋制成50100 cfu/ml菌液計數(shù)，備用。取經(jīng)26 培養(yǎng)57 d的黑曲霉改良馬丁斜面培養(yǎng)物，加適量0.9%氯化鈉溶液洗下孢子，取孢子懸液加入0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋制成50100 cf

5、u/ml孢子懸液計數(shù)，備用。 2.2 供試液制備方法 取樣品100 cm2，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，振搖，使充分分散均勻，即為110供試液； 取上述110供試液10 ml加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分別至50、100、200 ml，即為150、1100、1200供試液。 2.3 敏感菌的確定及細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法選擇試驗及驗證試驗方法 為確定克霉唑藥膜的敏感菌，選擇有效的去除抑菌活性的方法，用CP2005年版平皿稀釋法、低速離心沉淀處理供試液與平皿稀釋法聯(lián)用、低速離心沉淀處理供試液與薄膜過濾法聯(lián)用消除其抑菌活性1，2；對試驗菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿

6、菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉進(jìn)行活菌計數(shù)回收試驗，從各菌的回收結(jié)果確定敏感菌，選擇出回收率在70%以上的方法作為有效方法，各試驗菌作3個批號驗證試驗以對方法進(jìn)行評價。 2.3.1 平皿稀釋法1 每皿中分別加入110供試液1 ml、0.2 ml，每皿分別各加入試驗菌50100 cfu，立即傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基1520 ml，每種試驗菌平行制備2個皿，置規(guī)定溫度，培養(yǎng)、計數(shù)菌落數(shù)作為試驗組；不加入供試液，同法測定相應(yīng)加入的試驗菌數(shù)，作為菌液組；不加入試驗菌，同法測定110供試液1 ml、0.2 ml中的本底菌數(shù)作為空白組，計算回收率?；厥章剩?）=(試驗組平均菌落數(shù)-空白組平均菌落數(shù))菌液組

7、平均菌落數(shù)100%。 2.3.2 離心加薄膜過濾法聯(lián)用 取供試液10 ml于500 r/min離心45 min，管底離心沉淀物0.25 ml，取出全部上層液混勻，即為供試液，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（沖洗液室溫或加熱至4045 ）約90 ml中，混勻過濾沖洗，在最后一次沖洗夜中加入試驗菌。取膜貼于規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，作為試驗組，培養(yǎng)、計數(shù)菌落數(shù)1；在沖洗液中加入與試驗組等量試驗菌液，過濾，取膜貼于規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基作為菌液組；不加入試驗菌，同法測定供試液中的本底菌數(shù)，作為空白對照；計算回收率（同平皿稀釋法）。 2.3.3 沖洗方法條件選擇 采用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，

8、每個濾器60、8090 ml/次，沖洗量 300 ml、500 ml或800 ml，在最后一次沖洗液中加試驗菌液，沖洗液溫度為室溫、4045 ，按沖洗效果進(jìn)行選擇。 2.4 控制菌檢查驗證試驗 2.4.1 銅綠假單胞菌 取110供試液10 ml，按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法中銅綠假單胞菌規(guī)定的相應(yīng)方法進(jìn)行驗證。 2.4.2 金黃色葡萄球菌 取110供試液10 ml 500 r/min，離心5 min，取全部上清液加至裝有約80 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的濾器中按薄膜過濾法過濾，沖洗3次，100 ml/次，取膜加至相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基100 ml中，以下操作按CP200

9、5年版二部附錄微生物限度檢查法中金黃色葡萄球菌檢查的相應(yīng)方法進(jìn)行驗證。 3 結(jié)果 3.1 敏感菌確定及細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法選擇試驗 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌用平皿稀釋法110供試液，每皿1 ml，前3種細(xì)菌的回收率分別為97%、65%、89%，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌無回收，大腸埃希菌、黑曲霉回收率均達(dá)到70%以上；每皿0.2 ml金黃色葡萄球菌回收率為118%；枯草芽孢桿菌、白色念珠菌也無回收，因此確定為敏感菌。用低速離心沉淀處理供試液與薄膜過濾法聯(lián)用消除克霉唑抑菌活性，枯草芽孢桿菌500 r/ min離心5 min，薄膜過濾，沖洗300 ml，取供

10、試液10 ml（濃度110、1100、1200），回收率分別為0、52%、95%，1200可達(dá)70%以上；白色念珠菌500 r/ min離心4 min，薄膜過濾。結(jié)果見表1。表1 敏感菌確定及消除抑菌活性方法選擇試驗結(jié)果（回收率%） 3.2 驗證試驗結(jié)果 3.2.1 大腸埃希菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌驗證結(jié)果 前2種試驗菌采用平皿法，每皿加入110供試液1 ml；金黃色葡萄球菌用平皿稀釋法，每皿加入110供試液0.2 ml，作3個批號樣品回收試驗，結(jié)果見表2。 3.2.2 枯草芽孢桿菌、白色念珠菌驗證結(jié)果 根據(jù)方法選擇結(jié)果，枯草芽孢桿菌驗證方法采用離心沉淀處理供試液與薄膜過濾法聯(lián)用，取1200

11、供試液10 ml，500 r/min離心5 min，取全部上清液 表2 大腸埃希菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌驗證試驗結(jié)果(cfu) 注：空白組均為o cfu 加入約90 ml沖洗液中，過濾，60 ml/次沖洗5次，共300 ml，作3個批號樣品，結(jié)果見表3。 白色念珠菌驗證：根據(jù)選擇結(jié)果，離心沉淀處理供試液，用薄膜過濾，沖洗液溫度提高至4045 ，沖洗，上清液0.25 ml、0.2 ml沖洗500 ml，回收均能達(dá)70%以上。取110供試液10 ml，500 r/min,離心4 min，全部上清液混勻，取0.25 ml過濾，4045 沖洗液每次8090 ml沖洗6次，共 500 ml，3個批號樣

12、品分別作回收試驗，平行作2個 膜，結(jié)果見表3。 表3 枯草芽孢桿菌、白色念珠菌離心加薄膜濾法驗證試驗結(jié)果注：空白組均為o cfu 3.2.3 稀釋劑對照組 由于2種敏感菌計數(shù)方法采用離心、薄膜過濾、沖洗，為考察供試液中微生物受影響的程度，作稀釋劑對照組回收試驗。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液加入試驗菌，濃度為50100 cfu/10 ml；取10 ml與試驗組同法離心加薄膜過濾、沖洗，取膜貼于規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，測定菌數(shù)，為試驗組；不作離心加薄膜過濾、沖洗為菌液組，計算回收率，結(jié)果均能達(dá)到70%以上。 3.2.4 控制菌檢查驗證試驗 結(jié)果見表4。表4 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌驗證試驗結(jié)果

13、注：BL增菌液為100 ml；+：生長相應(yīng)典型菌落或陽性反應(yīng)； ：無菌生長或陰性反應(yīng) 4 討論 4.1 克霉唑為抗真菌藥，按CP2005年版規(guī)定的驗證菌株為試驗菌分別作回收，從本組結(jié)果看出，平皿稀釋法白色念珠菌、枯草芽孢桿菌均無回收，離心加薄膜過濾法110供試液無回收、150為8%，藥物對真菌白色念珠菌有很強(qiáng)抗菌活性，對細(xì)菌枯草芽孢桿菌也顯示較強(qiáng)抗菌作用，即克霉唑藥膜抗真菌的敏感菌為白色念珠菌敏感菌、細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。藥物對大腸埃希菌、黑曲霉（采用平皿法）均未顯示有抑菌活性，試驗中金黃色葡萄球菌采用平皿稀釋法回收率均大于70%，顯示有一定抑菌活性。 4.2 為消除藥物對敏感菌的抑菌活性，采用

14、離心加與薄膜過濾法對2種敏感菌進(jìn)行了方法條件的選擇。 白色念珠菌110、150供試液10 ml經(jīng)500 r/min離心4 min，膜法沖洗300 ml，回收率為0%、8%；取上清液1 ml室溫沖洗300 ml、500 ml、800 ml，均無回收。 沖洗液溫度對白色念珠菌回收的影響：由于克霉唑難溶于水，膜法過濾沖洗液溫度較低時，藥物及輔料溶解不充分截留于膜上藥物不能沖洗干凈，110供試液上清液0.25 ml試驗結(jié)果無回收；將沖洗液溫度加熱提高至4045 沖洗，取上清液0.25 ml、0.2 ml沖洗500 ml回收率均能達(dá)70%以上；結(jié)合表3對3個批號樣品的驗證試驗結(jié)果，該法能有效消除藥物對白

15、色念珠菌抗菌活性，回收率均能達(dá)70%以上，重現(xiàn)性好。 枯草芽孢桿菌110、1100、1200 3種供試液試驗結(jié)果：前2種回收均達(dá)不到70%；1200供試液可消除其抑菌活性，回收率達(dá)70%以上；結(jié)合表3對3個批號樣品的驗證試驗結(jié)果，該法能有效消除藥物對枯草芽孢桿菌抗菌活性，回收率均能達(dá)70%以上。 4.3 稀釋劑對照組結(jié)果：與試驗組同法，白色念珠菌、枯草芽孢桿菌在離心加薄膜過濾及沖洗條件下基本不受影響，回收率均能達(dá)到70%以上。 4.4 控制菌金黃色葡萄球菌檢查方法驗證：3個批號驗證試驗結(jié)果均能檢出金黃色葡萄球菌，陰性菌對照組結(jié)果顯示方法專屬性好（表4）；表4結(jié)果顯示銅綠假單胞菌檢查方法可按CP

16、2005年版二部附錄微生物限度檢查法規(guī)定的方法檢查。 4.5 根據(jù)試驗研究的結(jié)果，建立克霉唑藥膜微生物限度檢查方法 細(xì)菌計數(shù)：取 1200的供試液10 ml于500 r/min離心5 min，取全部上清液加至裝有約90 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，過濾，60 ml/次，沖洗5次，共300 ml；其它操作按CP2005年版二部微生物限度檢查法薄膜過濾法。霉菌、酵母菌計數(shù)：取 110的供試液10 ml于500 r/min離心4 min，取出全部上清液混勻作為供試液，取 0.25 ml加至裝有約100 ml 45 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，過濾，用45沖洗液沖洗6次，8090 ml/次，共500 ml，作4個膜（取樣量共1 ml）；其它操作按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法薄膜過濾法。 計數(shù)結(jié)果計算：=AK。 ：菌數(shù)（cfu/10 cm2）；A細(xì)：營養(yǎng)瓊脂平板膜上的菌落數(shù)或菌落平均數(shù) ；A霉菌、酵母菌：4個玫瑰紅鈉瓊脂平板膜上的菌落總數(shù) ；K：稀釋倍數(shù)，K細(xì)=20，K霉、酵=10。 控制菌檢查：銅綠假單胞菌，取110供試液10 ml，按CP2005年版二部微生物限度檢查法相應(yīng)方法檢查；金黃色葡萄球菌，取110供試液10 ml，500 r/min離心5 min,取全部上清液，加至裝有約90 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液