乳腺癌HER2 FISH檢測、判讀及報告

1、乳腺癌HER2 FISH檢測-檢測意義、建議及標(biāo)本準(zhǔn)備HER2與乳腺癌乳腺癌是女性惡性腫瘤中發(fā)病率最高的一種，正以每年3%4%的速度急劇上升，已成為女性的第一殺手。臨床上大約20-35%的浸潤性乳腺癌存在HER2基因的擴(kuò)增及蛋白的高表達(dá)。HER2基因 (又名HER2/neu，c-erbB-2)位于17q12，是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一，HER家族在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。HER2編碼相對分子量185KD的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性。HER2是重要的乳腺癌預(yù)后判斷因子，HER2陽性（過表達(dá)或擴(kuò)增）的乳腺癌，其臨床特點(diǎn)和生物學(xué)行為有特殊表現(xiàn)，治療模式也與其他類型的乳

2、腺癌有很大的區(qū)別。HER2檢測方法有免疫組化（IHC）和熒光原位雜交（FISH）等。2014年NCCN乳腺癌臨床實踐指南和乳腺癌HER2檢測指南2014版均強(qiáng)調(diào)：FISH是檢測HER2基因狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)。一檢測意義1. 判斷預(yù)后：HER2陽性的乳腺癌浸潤性強(qiáng)，無病生存期短，預(yù)后差。2. 指導(dǎo)治療：HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者對內(nèi)分泌治療藥物（如他莫昔芬）產(chǎn)生耐藥。HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者對CMF方案不敏感，宜采用大劑量蒽環(huán)類藥物和紫杉醇類藥物方案；HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者明顯受益于Herceptin（赫賽汀，2001年FDA批準(zhǔn)上市）等靶向藥物治療。二檢測建議IHC和FISH檢測HER2

3、的狀態(tài)一致性很高，但也存在著差異，數(shù)據(jù)統(tǒng)計如下表1和表2示，對于IHC 2+樣本必須要用FISH進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果； 0、1+或3+，根據(jù)條件，可再做FISH驗證。IHCFISH陽性率（%）陰性陽性01+2+3+89251432774562114156605.929.155.989.9表1：(2004) HER2 Amplification Ratios by Fluorescence In Situ Hybridization and Correlation with Immunohistochemistry in a Cohort of 6556 Breast Cancer Tissues.

4、Clinical Breast Cancer表2： 2007年衛(wèi)生部科教司牽頭組織全國73家三級以上醫(yī)院歷時2年完成“熒光原位雜交技術(shù)（FISH）用于乳腺癌患者Her-2檢測的臨床研究”課題，檢測標(biāo)本達(dá)3368例因此， 2014年NCCN乳腺癌臨床實踐指南和乳腺癌HER2檢測指南（2014版）均建議先進(jìn)行HER2蛋白的IHC檢測，IHC 2+樣本進(jìn)行ISH（FISH、DISH或CISH）檢測。2014年NCCN乳腺癌臨床實踐指南三樣本準(zhǔn)備：1標(biāo)本類型：(1)手術(shù)切除標(biāo)本；(2)粗針穿刺活檢標(biāo)本；(3)活檢標(biāo)本。2標(biāo)本固定：所有乳腺癌標(biāo)本離體后都應(yīng)盡快固定（1h內(nèi)固定）。固定時應(yīng)將標(biāo)本每隔510

5、 mm切開，并可在組織間嵌入紗布或濾紙等物。固定液量與所浸泡組織的比例應(yīng)足夠。固定時間以672h為宜。3固定液類型：4中性(磷酸緩沖)甲醛固定液。4組織切片：(1)切片厚度3-5um；(2)應(yīng)有HE染色切片作為對照。四臨床上哪些患者需要進(jìn)行HER2檢測1.所有乳腺原發(fā)性浸潤癌都應(yīng)進(jìn)行HER2檢測；2.只要能獲取腫瘤組織，對復(fù)發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶也應(yīng)該進(jìn)行HER2檢測；3.如HER2檢測結(jié)果為陰性，但疾病復(fù)發(fā)且生物學(xué)行為提示可能為HER2陽性腫瘤時，應(yīng)重復(fù)HER2檢測；4.如HER2檢測結(jié)果與組織病理學(xué)特征不相符時，如組織學(xué)分級為I級的浸潤性乳腺癌HER2 陽性，應(yīng)重復(fù)HER2檢測。組織學(xué)1級的類型腺癌

6、：浸潤性導(dǎo)管或小葉癌，ER和PR陽性小管癌（至少90%為純小管癌）粘液癌（至少90%為純粘液癌）篩狀癌（至少90%為純篩狀癌）腺樣囊性癌（至少90%為純腺樣囊性癌）且常為三陰性乳腺癌HER2 FISH檢測-判讀一信號觀察流程1.首先在HE/IHC切片上確認(rèn)腫瘤區(qū)域；2.在10×物鏡下，于FISH標(biāo)本上找到與HE染色切片上相同的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)；3.在40×物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在異質(zhì)性，要求至少找到2個浸潤癌區(qū)域，計數(shù)至少20個浸潤癌細(xì)胞。滿意的標(biāo)本應(yīng)是75%以上癌細(xì)胞核中有雜交信號；4.在100×物鏡下觀察癌細(xì)胞核的FISH結(jié)果進(jìn)行信號計數(shù)，注意上下調(diào)整焦距

7、，以免遺漏信號。二實驗失敗、不能判讀的情況1.因操作等原因，細(xì)胞核被損壞，邊界不完整；2.組織過度消化，細(xì)胞核邊界不完整，DAPI染色淺；3.組織消化不足，25%以上的細(xì)胞核無信號；4.自發(fā)熒光很強(qiáng)或細(xì)胞核分辨差，10%細(xì)胞核外有信號。三計數(shù)要求1.計數(shù)區(qū)域可結(jié)合蘇木精伊紅染色進(jìn)行腫瘤細(xì)胞標(biāo)識；2.選擇具較好核分界的區(qū)域，要求細(xì)胞核大小基本一致、邊界完整，DAPI染色均勻、核無重疊，綠色著絲粒信號清晰；3.隨機(jī)計數(shù)確定的腫瘤區(qū)域中2030個細(xì)胞核中的雙色信號，不要主觀選擇信號多的核計數(shù)； 4.不要計數(shù)僅顯示一種顏色信號的細(xì)胞核；5.避免計數(shù)分裂像的細(xì)胞核或被細(xì)胞核分裂及邊界不完整核；6.如果2

8、個同樣大小的橘紅信號之間距離不足一個常規(guī)橘紅信號大小，只計為一個信號；7.若紅、綠兩信號的比值>20或眾多信號連接成簇時可不計數(shù)，視為基因擴(kuò)增；8.若為臨界值，則需要再計數(shù)20個細(xì)胞核中的信號或由另外一個觀察者重新計數(shù)，如仍為臨界值，則應(yīng)在FISH檢測報告中注明，或換其它方法或其它蠟塊重新檢測；9.若HER2基因擴(kuò)增在不同癌細(xì)胞中存在異質(zhì)性時，應(yīng)在另一癌區(qū)域再計算2030個癌細(xì)胞核中的紅、綠信號值，報告其最大值，并加以注釋；10.判讀時可以將乳腺組織中的正常細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、正常乳腺上皮細(xì)胞)的HER2信號和CSP17信號作為內(nèi)對照。一些常見信號類型及計數(shù)方法摘

9、自 乳腺癌HER-2基因檢測試劑盒（FISH法）說明書Abbott Moleular Inc.四結(jié)果判讀在清晰的腫瘤區(qū)域，按以上計數(shù)要求在至少20個核內(nèi)計數(shù)GSP HER2（紅色）和CSP17（綠色）信號，分別記錄GSP HER2和CSP17的信號總數(shù)，再計算平均每個細(xì)胞HER2拷貝數(shù)、平均每個細(xì)胞CSP17拷貝數(shù)以及GSP HER2和CSP17比值。A若HER2/CSP17<2.0，且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0，HER2陰性；B若HER2/CSP17<2.0，且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<6.0，但4.0時，HER2結(jié)果不確定；C若HER2/CSP172.0，或H

10、ER2/CSP17<2.0而HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞6.0，HER2陽性。乳腺癌HER2檢測指南2014版乳腺癌HER2檢測指南2014版注： a：對于HER2/CSP17比值2.0，但平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0的病例是否應(yīng)該視為FISH陽性目前尚存爭議，建議對這部分病例在報告中加以備注，提示目前的爭議，建議臨床醫(yī)師參考免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果并與患者進(jìn)行必要的溝通；b：見于均質(zhì)、連續(xù)的浸潤細(xì)胞，且占浸潤癌的10以上五HER2 FISH判讀標(biāo)準(zhǔn)的變化乳腺癌HER2檢測指南2009版判讀標(biāo)準(zhǔn)：A若HER2/CSP17<1.8，HER2陰性；B若HER2/CSP171.8，且<

11、;2.2，HER2結(jié)果不確定；C若HER2/CSP172.2，HER2陽性。新舊判讀標(biāo)準(zhǔn)的比較：2014版新標(biāo)準(zhǔn)的截斷值為2.0，2009版老標(biāo)準(zhǔn)的截斷值為1.8和2.2；2014版新標(biāo)準(zhǔn)不只是HER2/CSP17的比值，需結(jié)合HER2基因的拷貝數(shù)進(jìn)行判讀；2009版則僅根據(jù)HER2/CSP17的比值進(jìn)行判讀，不考慮HER2基因拷貝數(shù)。新舊判讀標(biāo)準(zhǔn)銜接中可能出現(xiàn)的問題：2014版新標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)HER2檢測結(jié)果不確定的情況會比2009版標(biāo)準(zhǔn)更少；2014版新標(biāo)準(zhǔn)判讀陰陽性結(jié)合了HER2基因的拷貝數(shù)，有些2009版標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果為陰性的標(biāo)本，如果HER2基因拷貝數(shù)6.0，2014版新標(biāo)準(zhǔn)則判為陽性。乳腺

12、癌HER2檢測指南2009版與 乳腺癌HER2檢測指南2014版乳腺癌HER2 FISH檢測-報告及結(jié)果解釋一報告要求乳腺癌HER2檢測指南2014版要求檢測報告包括如下內(nèi)容：患者信息(包括姓名、性別、年齡、門診/住院號)、送檢醫(yī)師姓名、送檢日期、標(biāo)本信息(包括病理號和蠟塊號)、標(biāo)本部位和類型、探針信息、檢測方法、是否使用圖像分析、對照設(shè)置情況、樣本量是否適合評估、判讀結(jié)果(包括評估的細(xì)胞數(shù)量、平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞、平均CSP17拷貝數(shù)/細(xì)胞、平均HER2拷貝數(shù)/平均CSP17拷貝數(shù)的比值)、檢測結(jié)論(如陽性、不確定、陰性、無法判讀)。 這里強(qiáng)調(diào)兩個概念：17號染色體計數(shù)和HER2異質(zhì)性。

13、1. 17號染色體數(shù)目：FISH雙探針檢測系統(tǒng)中加入CSP17探針的目的是為了在檢測HER2基因的同時檢測17號染色體數(shù)目，從而區(qū)分17號染色體的非整倍體與HER2基因擴(kuò)增。近年來的研究顯示17號染色體多倍體與CSP17多信號點(diǎn)（著絲粒區(qū)多點(diǎn)）是不同的概念。17號染色體多倍體較罕見，而部分乳腺癌中17號染色體上存在HER2基因和著絲粒區(qū)的共同擴(kuò)增。越來越多的學(xué)者認(rèn)為，與GSP HER2/CSP17比值相比，HER2拷貝數(shù)對于HER2基因擴(kuò)增的判斷更為重要。因此在HER2 FISH檢測結(jié)果中除報告GSP HER2/CSP17比值外，還應(yīng)分別報告HER2拷貝數(shù)和CSP17的數(shù)值。2. HER2基因

14、的異質(zhì)性：浸潤性乳腺癌中HER2表達(dá)或擴(kuò)增可存在異質(zhì)性。雖然HER2基因異質(zhì)性的臨床意義目前仍不明確，但它可導(dǎo)致IHC與ISH檢測、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶、穿刺標(biāo)本與手術(shù)切除標(biāo)本的檢測結(jié)果不一致。在ISH計數(shù)之前，應(yīng)觀察整張切片或使用IHC確定可能存在HER2擴(kuò)增的區(qū)域。需要強(qiáng)調(diào)的是，即使存在異質(zhì)性，但只要擴(kuò)增細(xì)胞連續(xù)、均質(zhì)，且占浸潤癌10以上，就應(yīng)明確報告為ISH陽性。在報告中可補(bǔ)充報告不同細(xì)胞群(>10)的計數(shù)值(包括計數(shù)的細(xì)胞總數(shù)、HER2拷貝數(shù)、CSP17數(shù)值、GSP HER2/CSP17比值)，并報告擴(kuò)增細(xì)胞群占所有浸潤癌細(xì)胞的比例。二常見結(jié)果及解釋FISH陰性（HER2無擴(kuò)增），17

15、號二倍體。GSP HER2/CSP17（紅色/綠色）2.0。FISH臨界，17號多倍體（HER2基因伴隨多拷貝）。GSP HER2/CSP17（紅色/綠色）2.0，但平均每個細(xì)胞HER2拷貝數(shù)為4.9個，介于4.0-6.0之間。FISH陽性，17號多倍體。GSP HER2/CSP17（紅色/綠色）2.0，但平均每個細(xì)胞HER2拷貝數(shù)為6.8個，大于6.0。FISH陽性，17號染色體二倍體。GSP HER2/CSP17（紅色/綠色）2.0。FISH陽性，17號染色體多倍體。GSP HER2/CSP17（紅色/綠色）2.0。FISH陽性，17號染色體單倍體。GSP HER2/CSP17（紅色/綠色）2.0，平均每個細(xì)胞HER2拷貝數(shù)為2.0個，平均每個細(xì)胞CSP17拷貝數(shù)為1.0個。注：對于HER2/CSP17比值2.0，但平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0的病例是否應(yīng)該視為FISH陽性目前尚存爭議，建議對這部分病例在報告中加以備注，提示目前的爭議，建議臨床醫(yī)師參考免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果并與患者進(jìn)行必要的溝通三報告模板參考1.