反義寡核苷酸抑制survivin表達(dá)來(lái)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞株MCF

1、反義寡核苷酸抑制survivin表達(dá)來(lái)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞株MCF7和MDAMB231對(duì)多西他賽敏感性的研究(一)    【摘要】 目的： 探討利用反義寡核甘酸（ASODN）技術(shù)封閉乳腺癌細(xì)胞株survivin基因,觀察survivin基因表達(dá)下調(diào)能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)對(duì)多西他賽(docetaxel)藥物敏感性。方法： Survivin ASODN單獨(dú)及聯(lián)合多西他賽處理乳腺癌細(xì)胞株MCF7和MDAMB231,RTPCR檢測(cè)survivin mRNA的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western blotting檢測(cè)survivin蛋白表達(dá),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

2、,MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果： Survivin ASODN可下調(diào)人乳腺癌細(xì)胞株中survivin mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)；survivin ASODN 與多西他賽聯(lián)合用藥組相比對(duì)照組和多西他賽組可明顯抑制細(xì)胞株的生長(zhǎng)（P0.01)。結(jié)論： Survivin ASODN明顯抑制survivin基因在乳腺癌細(xì)胞株MCF7和MDAMB231中的轉(zhuǎn)錄及翻譯,明顯提高乳腺癌對(duì)多西他賽的敏感性。 【關(guān)鍵詞】 生存素； 反義寡核苷酸； 多西他賽； 乳腺癌細(xì)胞株生存素（survivin）作為凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成員之一,具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重作用1。 Survivin基因

3、在幾乎所有惡性腫瘤組織中出現(xiàn)高表達(dá),而在正常成人組織中不表達(dá)(胸腺、胎盤(pán)、子宮內(nèi)膜除外)2,survivin蛋白與日漸增多的乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)3,這種選擇性表達(dá)使之成為目前惡性腫瘤診斷和治療的研究熱點(diǎn)。多西他賽是目前治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌單藥有效率最高的藥物,盡管如此,多西他賽單藥的有效率也只在40%68%4,而且對(duì)復(fù)發(fā)和多處轉(zhuǎn)移的患者易出現(xiàn)化療耐藥。本研究旨在探討利用反義寡核苷酸（ASODN）封閉survivin基因的表達(dá)是否能增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性,為臨床提高乳腺癌化療敏感性提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料人乳腺癌MCF7和MDAMB231細(xì)胞株由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)

4、中心提供；LipofectamineTM2000購(gòu)于Invitrogen公司；G418購(gòu)自Sigma公司；總RNA提取試劑盒及GAPDH購(gòu)于TaKaRa公司；兔抗人多克隆抗體survivin購(gòu)于Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔多克隆抗體購(gòu)于北京中杉金橋；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司；多西他賽（Aventis Pharma Dagenham公司產(chǎn)品）溶解于二甲亞砜（DMSO,GIBCO公司產(chǎn)品）,4保存。1.2 方法1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.5軟件處理,數(shù)據(jù)以x-±s表示,兩因素分析使用兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析,P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2

5、結(jié) 果2.1 Survivin ASODN對(duì)survivin mRNA表達(dá)的抑制作用 對(duì)照組、Lipofectin組和無(wú)義寡核苷酸組survivin mRNA表達(dá)較強(qiáng),組間無(wú)明顯差別；100 nmol·l-1survivin ASODN組表達(dá)較弱,300 nmol·L-1和500 nmol·L-1濃度組均無(wú)表達(dá)（圖1）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)survivin mRNA表達(dá)減弱（圖2）。因此,survivin ASODN對(duì)survivin mRNA的抑制作用有濃度和時(shí)間依賴性。1.Marker； 2.對(duì)照組； 3.Lipofectin組； 4.NSODN 300 nmol&

6、#183;L-1組； 5.Survivin ASODN 100 nmol·L-1組； 6.Survivin ASODN 300 nmol·L-1組； 7.Survivin ASODN 500 nmol·L-1組； 8.Marker圖1 Survivin ASODN對(duì)MDAMB231細(xì)胞2.2 Survivin ASODN下調(diào)MDAMB231細(xì)胞內(nèi)survivin蛋白的表達(dá) MDAMB231細(xì)胞內(nèi) survivin蛋白陽(yáng)性結(jié)果呈胞漿染色棕黃色細(xì)顆粒狀（圖3A、B）；以PBS代替一抗的陰性對(duì)照細(xì)胞,細(xì)胞核呈深藍(lán)色,胞漿透明,無(wú)棕色顆粒(圖3D)。結(jié)果表明survivi

7、n蛋白的活性能被survivin ASODN抑制(圖3C)。A.對(duì)照; B.NSODN; C.Survivin ASODN; D.陰性對(duì)照2.3 Survivin ASODN下調(diào)MCF7細(xì)胞內(nèi)survivin蛋白的表達(dá) 由圖4可知survivin蛋白的表達(dá)能被survivin ASODN抑制，而NSODN組與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。2.4 Survivin ASODN單用或聯(lián)合多西他賽誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡 對(duì)照組、Lipofectin組中細(xì)胞凋亡均不明顯,與對(duì)照組相比,不同濃度ASODN組、多西他賽組及兩藥聯(lián)合組均可見(jiàn)到部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的特征性變化：細(xì)胞縮小,細(xì)胞皺縮,染色質(zhì)凝集,核固縮并斷裂成

8、數(shù)個(gè)大小不等的圓形顆粒,即凋亡小體。ASODN各組存在濃度依賴性,隨著ASODN濃度增加凋亡細(xì)胞數(shù)目增多,聯(lián)合組凋亡細(xì)胞數(shù)目增加得最明顯。2.5 Survivin ASODN增加MCF7細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性 ASODN與多西他賽聯(lián)合作用組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)80.50,顯著高于多西他賽或ASODN單用組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率63.24及51.79%（P0.01）,單獨(dú)應(yīng)用多西他賽與NSODN聯(lián)合多西他賽的細(xì)胞抑制率間無(wú)明顯差異（P0.05）（表1）。表 1 不同處理方法對(duì)MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較3 討 論Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族的新成員,其表達(dá)具有明顯的細(xì)胞周期依賴性,在G2/M期高

9、表達(dá)。Survivin蛋白能與細(xì)胞周期依賴激酶CDC2相互作用,在Thr34上被CDC2cyclinB1磷酸化,這種磷酸化被認(rèn)為與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)6。研究還表明，survivin蛋白在微管穩(wěn)定,紡錘體及中心體的形成過(guò)程中也起著重要作用,抑制survivin基因的表達(dá)可引起紡錘體缺陷并促進(jìn)凋亡7,此外它還參與了腫瘤血管形成。Survivin蛋白具有獨(dú)特的組織分布,在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中均有較強(qiáng)表達(dá),survivin基因的高表達(dá)可能使乳腺癌細(xì)胞更容易逃避G0/G1期和G2/M期的分子檢查機(jī)制而不發(fā)生凋亡,并與化療的耐藥也有關(guān)8,故封閉survivin基因的表達(dá)能達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及

10、提高化療藥敏感性,同時(shí)對(duì)機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生較大的影響。我國(guó)乳腺癌發(fā)病率近年來(lái)不斷增高,作為一種易血行轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤,目前化療在其綜合治療中占有重要的地位。多西他賽是一種比紫杉醇抗腫瘤活性還強(qiáng)的化療新藥,自美國(guó)食物藥品管理局 (Food and Drug Administration,FDA)1998年批準(zhǔn)上市后,它已漸成為包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤化療的一線用藥,期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,以多西他賽為基礎(chǔ)的輔助化療方案能提高早期乳腺癌的長(zhǎng)期生存率,并降低復(fù)發(fā)9,而對(duì)化療藥耐藥是延長(zhǎng)乳腺癌患者生存期及改善生活質(zhì)量的最大障礙之一,因此研究多西他賽耐藥發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)是非常有意義的。目前

11、多西他賽耐藥機(jī)制尚未徹底清楚,但其通過(guò)作用于微管而發(fā)生抗腫瘤作用與survivin抗凋亡作用具有相同的位點(diǎn)。應(yīng)用目前較為流行的RNAi技術(shù)來(lái)研究藥物敏感性的成本較高,在我國(guó)還屬于探索階段,因此我們選用了相對(duì)而言較為簡(jiǎn)單的反義寡核苷酸技術(shù)來(lái)探討對(duì)化療藥物敏感性的影響。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,我們所構(gòu)建的靶向survivin ASODN具有高度特異性,RTPCR、免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)survivin mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低甚至被完全阻斷。光鏡下及MTT結(jié)果顯示,下調(diào)survivin基因表達(dá)可以誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞一定程度的自發(fā)凋亡并可明顯提高對(duì)多西他賽的化療敏感性

12、,這也間接地提示survivin基因的過(guò)度表達(dá)可能參與了多西他賽的耐藥。總之,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)：survivin ASODN可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡；survivin基因是較理想的腫瘤治療靶分子,可有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及對(duì)化療藥物敏感性。我們相信,隨著分子腫瘤學(xué)研究的深入和新的分子靶向藥物的不斷涌現(xiàn),將會(huì)有更多的藥物進(jìn)入臨床,為治療乳腺癌帶來(lái)新的突破。【參考文獻(xiàn)】1ALTIERI D C.Validating survivin as a cancer therapeutic targetJ.Nat Rev Cancer，2003,3(1):46542YAMASHITA S，MA

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