關(guān)于銀納米顆粒增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性的研究

1、關(guān)于銀納米顆粒增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性的研究         11-03-25 10:28:00     編輯：studa20             作者：馬珺，孫新臣，徐睿智，趙迪，童金龍，葛小林【摘要】  目的：通過(guò)制備3組尺寸的銀納米顆粒來(lái)研究其增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤放射治療的效果。方法:采用檸檬酸鈉還原體系制備20、50和100 nm尺寸的銀顆粒，通過(guò)掃描

2、電鏡來(lái)表征;檢測(cè)3種尺寸的銀納米顆粒的細(xì)胞毒性以及確定保證細(xì)胞活性的安全劑量;通過(guò)MTT比色法和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組尺寸的銀納米顆粒對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射治療的效果;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)銀納米顆粒對(duì)細(xì)胞周期以及細(xì)胞放療后凋亡率的影響。結(jié)果:20 nm的銀顆粒能夠顯著增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性，50 nm的銀顆粒次之，而100 nm的銀顆粒無(wú)明顯效應(yīng)。結(jié)論:小粒徑的銀納米顆粒能夠增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性，為臨床放射治療提供新的前景。 【關(guān)鍵詞】  銀納米顆粒; 放射增敏; 存活分?jǐn)?shù); 細(xì)胞凋亡Abstract Objective： To study the effect of thre

3、e types of silver nanoparticles on enhancing radiosensitivity of glioma cells. Methods: 20, 50 and 100 nm silver nanoparticles were all prepared in sodium citrate system and were characterized by SEM and TEM. The cytotoxicity was tested and the proper dose was determined to guarantee the little effe

4、ct on cell viability. The effect of silver nanoparticles on radiosensitivity of glioma cells was detected by MTT assay and colonyforming assay. The cell cycles and apoptosis after irradiation were tested by FCM. Results: 20 nm silver nanoparticles significantly sensitized the effect of irradiation t

5、reatment upon cancer cells. 50 nm silver nanoparticles had less effect and 100 nm silver nanoparticles had little. Conclusion: Small size of silver nanoparticle can efficiently enhance cytotoxicity of irradiation of glioma， which provide new prospect for clinical radio therapy.Key words silver nanop

6、articles; enhancing radiosensitivity; survival fraction; apoptosis銀納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很多應(yīng)用價(jià)值，它可以作為高性能的抗菌材料1-4、光學(xué)傳感器和生物標(biāo)記物5-7。除此以外，銀納米顆粒還能夠抑制病毒的復(fù)制,具備抗病毒的功效8-10。最近一項(xiàng)研究11顯示，銀納米顆粒能夠進(jìn)入癌細(xì)胞線粒體和胞核中，并可以直接對(duì)癌細(xì)胞的線粒體產(chǎn)生毒性，損傷癌細(xì)胞的DNA。該研究認(rèn)為銀納米顆粒破壞了癌細(xì)胞線粒體的呼吸作用，增加了活性氧的產(chǎn)物，中止了ATP的合成，反過(guò)來(lái)導(dǎo)致了DNA的受損。DNA的損傷通過(guò)銀納米顆粒和DNA相互作用進(jìn)一步增大，導(dǎo)致了細(xì)

7、胞分裂在G2/M期停滯。因此，銀納米顆粒被認(rèn)為在癌癥治療中具有開(kāi)發(fā)的潛力和價(jià)值。作者在上述前人研究的基礎(chǔ)上，提出了使用銀納米顆粒作為腫瘤放療的增敏劑，旨在提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性，增強(qiáng)X射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。1 材料和方法1.1 銀納米顆粒的制備3種尺寸的銀納米顆粒均從檸檬酸鈉體系、經(jīng)不同的控制還原方法獲得12-13。在掃描電鏡下對(duì)顆粒粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確認(rèn)3種樣品尺寸集中分布于20、50和100 nm。獲得后銀納米顆粒經(jīng)離心處理?xiàng)壍粼芤褐猩锨?，將顆粒溶于少量新生牛血清中，按照血清 DMEM=19的比例加入DMEM培養(yǎng)基，最后樣品采用0.2 m孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)U

8、251細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，置于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 、5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。RNaseA、DMSO、MTT和PI購(gòu)自Sigma公司。1.3 MTT比色實(shí)驗(yàn)分組將U251細(xì)胞分為銀納米顆粒結(jié)合放療組和單純放療組，分為0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 Gy 7個(gè)劑量照射組。細(xì)胞和銀納米顆粒孵育24 h后接受X射線照射，然后接種至96孔板培養(yǎng)，于48 h后終止培養(yǎng)棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 l新鮮配制的含MTT的無(wú)血清培養(yǎng)液，37 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min。選擇570 nm波長(zhǎng)，在全自

9、動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值(A)，記錄結(jié)果。1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)分組將U251細(xì)胞分為銀納米顆粒結(jié)合放療組和單純放療組，分為0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 Gy 7個(gè)劑量照射組。細(xì)胞和銀納米顆粒孵育24 h后接受X射線照射，然后稀釋至200(04 Gy)或2 000(6 Gy)細(xì)胞·孔-1接種至6孔板培養(yǎng)14 d后終止培養(yǎng)，固定、染色。1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞加入AgNPs，37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后照射，再過(guò)48 h后收集約105細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞。加入Annexin

10、VEGFP混勻后，加入Propidium Iodioe，混勻。室溫、避光、反應(yīng)15 min。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并分析數(shù)據(jù)。1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞加入AgNPs，37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后照射，再過(guò)48 h后收集約105細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞1次后收集。用70%乙醇固定24 h，4 保存。染色前用PBS洗去固定液。加入RNase A 37 水浴30 min。再加入PI(50 g·ml-1)染色混勻，4 避光30 min。上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 1

11、3.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 3個(gè)尺寸的銀納米顆粒的細(xì)胞毒性由于銀納米顆粒能夠在溶液體系中緩釋出銀離子，體系中銀離子的含量取決于銀納米顆粒自身的性質(zhì)(尺寸和表面包覆等)以及顆粒的濃度。游離的銀離子對(duì)細(xì)胞存在著毒性，銀納米顆粒則存在對(duì)細(xì)胞劑量依賴的毒性關(guān)系。通過(guò)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著銀納米顆粒尺寸的增加，IC50值在增大。其中，20 nm的銀顆粒(圖1)在100 g·ml-1以上顯示出明顯的細(xì)胞毒性(圖2)。由于銀納米顆粒對(duì)細(xì)胞存在劑量依賴的毒性關(guān)系，本研究在做放療增敏實(shí)驗(yàn)時(shí)均采用IC50值的1/5。在這樣低

12、劑量下，銀納米顆粒對(duì)細(xì)胞活性影響就很微弱。本研究中采用的銀納米顆粒的劑量是20(20 nm)、45(50 nm)和150 g·ml-1(100 nm)。圖1 20 nm的銀納米顆粒SEM圖片F(xiàn)ig 1 SEM image of 20 nm silver nanoparticles圖2 和20 nm的銀納米顆粒共孵育的U251細(xì)胞照片F(xiàn)ig 2 The photo of U251 cells treated with 20 nm silver nanoparticles2.2 MTT和集落實(shí)驗(yàn)顯示銀納米顆粒降低細(xì)胞照射后的存活率 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和銀納米顆粒共孵育24 h后經(jīng)射線照射處理，

13、然后去除原培養(yǎng)液中的銀納米顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，通過(guò)MTT分別檢測(cè)各組細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示，20 nm和50 nm的銀納米顆粒結(jié)合放療組的細(xì)胞活性相對(duì)單純放療組有明顯的下降，而100 nm的銀顆粒則無(wú)明顯變化。其中，20 nm的銀納米顆粒結(jié)合X射線對(duì)U251細(xì)胞活性的影響如圖3所示。圖3 MTT結(jié)果顯示和20 nm銀納米顆粒共孵育后，經(jīng)照射U251細(xì)胞生存率相對(duì)單純放療組明顯下降Fig 3 MTT results showed that the survival rate decreased after U251 cells treated with 20 nm silver n

14、anoparticles and irradiation本研究著重對(duì)20 nm的銀顆粒進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。集落形成實(shí)驗(yàn)是對(duì)細(xì)胞在放療后增殖能力更精確的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。集落實(shí)驗(yàn)顯示，和銀納米顆粒共孵育的細(xì)胞在照射射線后生存分?jǐn)?shù)(集落數(shù)目)相對(duì)單純放療組有明顯下降的趨勢(shì)(圖4)，這意味著腫瘤細(xì)胞經(jīng)銀納米顆粒和X射線共同作用后增殖能力顯著降低。圖4 集落實(shí)驗(yàn)顯示，20 nm銀納米顆粒能夠顯著降低細(xì)胞照射后的生存率Fig 4 The colonyforming assay showed that 20nm silver nanoparticles could significantly decrease cell survival rate after irradiation2.3 流式細(xì)胞術(shù)顯示銀納米顆粒能夠提高細(xì)胞照射后的凋亡率 Annexin VPI檢測(cè)進(jìn)一步表明，銀納米顆粒結(jié)合放療組的細(xì)胞凋亡率相對(duì)單純放療組有顯著提高(圖5)。文獻(xiàn)14報(bào)道銀納米顆粒能夠引起更多的細(xì)胞停止在G2/M期，本研究的結(jié)果和其