細(xì)胞爬片的方法與心得

1、細(xì)胞爬片的方法與心得多聚賴氨酸的濃度要求應(yīng)該不嚴(yán)格，主要就是將貼壁能力弱的細(xì)胞固定上去，如0.1（w/)，消毒可用紫外線照射。 園子里搜到的玻片的處理方法：玻片泡酸，自來水沖洗數(shù)遍，去離子水沖洗，就像細(xì)胞培養(yǎng)瓶等的那種處理就可以。然后放在小飯盒或者玻璃皿里高壓滅菌。再烤干備用。 將玻片用滅菌鑷子放于培養(yǎng)皿中，加細(xì)胞。整個過程注意無菌操作就是了。也沒啥難的。要注意的是：1.泡過酸的玻片特別脆。用鑷子夾著過水。要沖得充分，和那些細(xì)胞培養(yǎng)用玻璃管，瓶等的原則一樣。2.如果你覺得玻璃片太大?？梢栽谂葸^酸，水沖洗過用磨石在玻璃片上劃痕，掰開。我曾將一個玻璃片分成4個小片，在12孔，24孔板里放一兩片那種

2、。3.有個問題我一直沒有解決好：就是加上培養(yǎng)基后玻璃片拿動培養(yǎng)皿時，玻璃片會竄，常會壓到長在皿底部的細(xì)胞。挺麻煩的。后來還發(fā)現(xiàn)在玻璃片上的細(xì)胞和長在皿底部的細(xì)胞形態(tài)有點不一樣?，F(xiàn)在我已經(jīng)不做爬片了，直接在皿里做免化等也不錯。爬片的HE染色及注意事項： 要點： 標(biāo)本的制備：細(xì)胞爬片的制作很關(guān)鍵，首先是細(xì)胞能夠爬好，細(xì)胞分布均勻，密度適中；其次是不會在染色過程中脫片，細(xì)胞形態(tài)走形！相應(yīng)的處理-要選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞，一般要選擇消化吹打均勻傳代第二或三天的細(xì)胞，鏡下的標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞平鋪為瓶底的80左右為宜。細(xì)胞分布均勻，形態(tài)良好，吸?。?biāo)準(zhǔn)是吸取而不是傾倒）培養(yǎng)基，加無血清培養(yǎng)基或PBS洗一遍，加1ml胰

3、酶（大號瓶可加致2ml），輕晃使胰酶分布到每個角落，考慮胰酶剛剛?cè)诨?，加后可在火上過幾下，因為在37度消化作用最好。一般消化2到3分鐘（不同細(xì)胞不一樣，），鏡下（金標(biāo)準(zhǔn)）見細(xì)胞回縮，邊緣折光性改變，向圓形改變（經(jīng)驗：這時稍用力搖晃，鏡下見一些圓形細(xì)胞隨胰酶漂移即可），即倒掉胰酶，加培養(yǎng)基或血清（體會：加培養(yǎng)基即可，而且吹打時不易形成泡沫）吹打，感覺象流沙一樣最好，但絕對不可消化過頭！消化后要多吹打幾次，盡量形成單細(xì)胞懸液，離心后調(diào)整細(xì)胞接種密度（摸索本細(xì)胞系體會：25×104/ml合適）。玻片的制備：蓋玻片泡清潔液24小時，自來水洗10遍，1蒸洗3遍，煮沸20分鐘，2蒸洗3遍，煮沸2

4、0分鐘；放入80（須進(jìn)一步明確）酒精24個小時，用綢布搽拭涼干。放入瓶皿高壓滅菌待用。（本實驗未用多聚賴氨酸涂片，具體過程可見DXY）加細(xì)胞時，先在每個孔里滴幾滴培養(yǎng)基，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。接種后6小時細(xì)胞即可貼壁，可去上清加含藥培養(yǎng)基，等作用時間到，取玻片。固定：細(xì)胞爬片后用4的多聚甲醛固定20分鐘后，PBS洗2遍后進(jìn)行染色；染色：玻片用中性樹膠把無細(xì)胞面和載玻片固定，便于染色。過程（此過程適合細(xì)胞爬片，石蠟切片等不盡相同，須查相關(guān)文獻(xiàn)和專著）蘇木素中11.5分鐘；自來水洗數(shù)遍，加氨水（少量，起泛藍(lán)的作用）；放入分化液（配方為鹽酸酒精，比例未記！作用時間，

5、有文獻(xiàn)介紹27秒，具體須自己摸索；作用是溶解藍(lán)色的蘇木素，尤其是胞漿的藍(lán)色）片刻；放入伊紅12分鐘；80酒精23分鐘；95酒精23分鐘；95酒精5分鐘； 100酒精5分鐘；100酒精10分鐘；二甲苯10分鐘；二甲苯10分鐘；將玻片細(xì)胞面和載玻片用中性樹膠封片。細(xì)胞爬片的保存：A：只需要用95酒精或者4多聚甲醛固定1015分鐘，用吹風(fēng)機(jī)吹干后放在20保存就可以了，而且可以長期放置，以后可以根據(jù)實驗需要進(jìn)行HE染色，免疫組化，細(xì)胞化學(xué)等染色。B：對于一般的細(xì)胞免疫組化，我的做法是：細(xì)胞爬片用冰的純丙酮固定20MIN，再在通風(fēng)柜將丙酮吹干，-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，穿透性很強(qiáng)，保

6、存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做細(xì)胞細(xì)胞爬片的固定劑。 當(dāng)然還是要根據(jù)你的實驗?zāi)康臎Q定用那種固定劑。如：1。多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。 主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等 2乙醇。優(yōu)點：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。缺點：但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度 3甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)， 缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間

7、交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。關(guān)于細(xì)胞的打孔：細(xì)胞爬片的保存和抗原修復(fù)問題總結(jié)1. 細(xì)胞爬片可以用 含 疊氮鈉PBS液保存.但不知道具體濃度,請告知.多謝!加在液體中作為防腐劑的疊氮鈉濃度一般為0.04-0.08%。但是我建議對于細(xì)胞爬片，還是盡量快的進(jìn)行處理，以防不必要的問題!2. louischen wrote:但我的細(xì)胞爬片經(jīng)過4%多聚甲醛固定，PBS沖洗后直接就放在了-20度，還能用于免疫組化嗎?!應(yīng)該沒有問題，但是還是現(xiàn)作先染好些，以防抗原的丟失3. mRNA原位雜交經(jīng)4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建議用甲

8、醇固定。-20度保存4. 如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存兩周沒問題。時間再長就沒試過了。5. 丙酮中固定5-10分鐘，然后風(fēng)干，放置4度保存過夜應(yīng)該是沒有問題。不要固定過夜，蛋白質(zhì)固定過度，會影響抗原的暴露，影響免疫組化結(jié)果。如果是胞漿或胞核抗原出現(xiàn)假陰性結(jié)果，可考慮應(yīng)用0.5%的triton-100孵育30分鐘，滲透細(xì)胞膜。如果玻片沒有經(jīng)過特殊處理，不要用其他抗原修復(fù)的方法，會造成掉片，我曾有過這方面的體會6. 丙酮固定后，PBS洗滌3次，即可保存至4度冰箱備用。7. (1)細(xì)胞爬片先用TBS洗3次，每次5分鐘(2)4%多聚甲醛固定，室溫，20分鐘(3)70%

9、-80%-90%-95%-100%梯度酒精脫水，通風(fēng)櫥內(nèi)干燥，-80度保存。2周沒有問題的，我保存過2個月都有信號，不過還是保存時間短一點的好8. 我的心肌細(xì)胞爬片用不同濃度的乙醇依次脫水后,就放在室溫中,因為是要拍電鏡,但是學(xué)校電鏡壞了,呵呵,所以放了一個月后去拍,還是很好9. 細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS沖洗后，晾干，放在-20度保存一個月沒有問題的。10. 細(xì)胞爬片，有機(jī)溶劑如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，輕輕搖動玻片或培養(yǎng)皿等，靜置2min左右，棄去固定液，不用PBS洗而是采用空氣干燥，干燥后的標(biāo)本可于-70長期保存。解凍時要小心抗原破壞，應(yīng)先將標(biāo)本轉(zhuǎn)移于干冰預(yù)冷的固

10、定液，然后再將混合液轉(zhuǎn)移至室溫下，固定液到達(dá)室溫時取出標(biāo)本，再用PBS沖洗，在做以后的步鄹11. 我也做過細(xì)胞爬片的組化染色，不過沒有遇到類似的問題。細(xì)胞培養(yǎng)好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度固定15分鐘，自然風(fēng)干。室溫保存幾周內(nèi)都可以用的。我想這可能與抗原的類型有關(guān)，有的對氧化等損傷比較敏感，有的差一些。最好避光保存在4度，同時盡量隔絕空氣。免疫熒光與普通DAB顯色差別只再二抗的標(biāo)記，樣品的保存應(yīng)該是沒有多大差別的。12. 細(xì)胞爬片丙酮固定后-20度保存，現(xiàn)在要再做免疫熒光，將保存的爬片拿出37度復(fù)溫然后常規(guī)操作就可以了13. 爬片做免疫組化的優(yōu)勢在于抗原新鮮，細(xì)胞形態(tài)保存較好。若爬片

11、需長期保存并出現(xiàn)你這樣的問題，原因可能是：1)試驗步驟有誤，建議重復(fù)并加陽性對照片。2)加一抗前處理同石蠟切片，可進(jìn)行抗原修復(fù)，如胰酶消化或熱修復(fù)。3)因為抗原抗體反應(yīng)在液相中進(jìn)行，故對已極度干燥的爬片充分水化很重要。建議試驗前用PBS浸泡過夜。如不能解決你的問題請QQ聯(lián)系：81825645。本人在湖南省腫瘤醫(yī)院病理科(長沙市)做免疫組化。14. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用無水酒精的，固定好后放-20度，2-3個月是沒有問題的。15. 對于一般的細(xì)胞免疫組化，我的做法是：細(xì)胞爬片用冰的純丙酮固定20MIN，再在通風(fēng)柜將丙酮吹干，-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，穿透性很

12、強(qiáng)，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做細(xì)胞細(xì)胞爬片的固定劑。當(dāng)然還是要根據(jù)你的實驗?zāi)康臎Q定用那種固定劑。如：1.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡;也可用于免疫熒光染色。 主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等2.乙醇。優(yōu)點：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。缺點：但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解;染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度3.甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)， 缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色; 分

13、子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。16. 4度是不能保存這么長時間(1個月)的，如果抗原已被分解，再修復(fù)也沒用!17. 棄去固定液，不用PBS洗而是采用空氣干燥，干燥后的標(biāo)本可于-70長期保存。18. 爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘，然后在4%多聚甲醛中固定15分鐘，然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時操作過程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續(xù)實驗，要不然玻片會掉下來的，就又是

14、前功盡棄了 做好的細(xì)胞爬片可以放在-20保存?zhèn)溆?，具體能保存多長時間不太清楚，當(dāng)然盡量早用。19. 固定后放點PBS，然后放在4度冰箱中保存，我最長保存兩個月的，然后再做免疫組化，應(yīng)該沒有太大的問題的。20. 固定后4度可以存放一周，-20度存放半年，我現(xiàn)在也要做這個，實驗室老師教的。21. 四度放1周應(yīng)該沒問題的，你最好放在-20度，我在-20度放一個月都還出結(jié)果的.很多人作的片子很多，不可能一次作完，一個月沒問題.22. 最佳的固定及保存方法：(1)中性緩沖福爾馬林(不必調(diào)pH)：福爾馬林(40%甲醛，用時加入過量堿式MgCO3中和) 10.0mlNa2HPO4.12H2o 1.9653g

15、NaH2PO4.2H2O 0.5460g加0.85 %NaCl溶液溶解，定容至100ml。(2)細(xì)胞固定：待細(xì)胞接近長成單層時，用鑷子取出蓋玻片，迅速于37PBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血清。(3)將蓋玻片投入中性緩沖福爾馬林溶液中室溫固定30min。(4)用鑷子取出蓋玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干保存于-20備用。可長期保存，做實驗時，取出片子，入PBS濕潤后即可進(jìn)行你的實驗。可以用于做免疫細(xì)胞化學(xué)(H.E.)或免疫熒光。(本帖沒有加分)23. 細(xì)胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1個月內(nèi)可以用.24. skywalkerzz wrote:過氧化氫處理這一步，用三蒸水稀釋

16、商品濃度為30%的過氧化氫，然后室溫下玻片放在其中浸泡10min，是不是過氧化氫導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重脫片?爬片應(yīng)該用甲醇/雙氧水，你的細(xì)胞極可能是過氧化氫導(dǎo)致嚴(yán)重脫片25. 本人比較喜歡用4%得多聚甲醛，20分鐘很好用的。保存的時候注意片子最好晾干，不要擠壓，防止粘片和碎裂。26. 細(xì)胞爬片固定好以后，如果要保存，我們的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最長半年沒問題。27. 1、用新鮮配制的預(yù)冷的4%多聚甲醛緩沖液室溫固定15 min，PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗滌3遍后是否就可以進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色了2、爬片PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗滌3遍后是

17、否能保存，怎樣保存?1、洗過就可以做免疫組化了。2、固定過后自然干燥，不要洗，-20度保存。做之前再洗。28. 細(xì)胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交聯(lián)，這樣組化時不用再抗原修復(fù)。細(xì)胞固定后可室溫保存在丙酮中，不使之干燥。29. 如果是檢測膜上的物質(zhì),好象不能用酒精,30. 適當(dāng)密度后取出固定(丙酮-20固定1020min)，再進(jìn)行免疫染色。31. 一批細(xì)胞爬片,如果細(xì)胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20分鐘，然后放-20度，沒有問題。如果細(xì)胞爬片是在24孔板或6孔板里進(jìn)行，冷丙酮會腐蝕板子，最好4%多聚甲醛。32. 細(xì)胞爬片用純丙酮固定10分鐘，取出干燥后用錫紙包裹，-70度保存。33. 4%多聚甲醛固定后PBS水洗，自然干燥后用錫紙包裹，-20度凍存不超過1月。34. 如果細(xì)胞貼壁困難，可將片子先用純