桔?？傇碥蘸繙y(cè)定方法研究(一)

1、桔?？傇碥蘸繙y(cè)定方法研究(一)    作者：李妍張崇禧魏建和許旭東褚慶龍【摘要】 目的建立一種香草醛-硫酸比色法測(cè)定桔梗中總皂苷含量的方法，為桔梗的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法索氏提取器提取，大孔吸附樹(shù)脂純化，香草醛-硫酸比色法測(cè)定桔?？傇碥蘸?。結(jié)果比色法測(cè)定的線性方程為A=0.003 4C+0.006 4，相關(guān)系數(shù)為r=0.999 7，平均加樣回收率為96.97%，RSD=1.51%(n=6)。對(duì)不同來(lái)源桔梗中總皂苷含量進(jìn)行測(cè)定，其含量范圍為1.07%3.76%。結(jié)論該法測(cè)定準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于桔梗藥材中桔梗總皂苷的含量測(cè)定，便于對(duì)桔梗藥材進(jìn)行質(zhì)量

2、評(píng)價(jià)。 【關(guān)鍵詞】 桔梗；總皂苷；桔梗皂苷D；比色法Abstract：ObjectiveTo develop a vanillin -H2SO4 colorimetry method for the determination of total saponins in Radix Platycodonis samples, in order to provide a scientific basis for the quality control of Radix Platycodonis. MethodsWith Platycodin D as standard, the total sap

3、onins in Radix platycodonis was extracted with soxhlet extractor and purified with macroporous resin column chromatography, its content was determined by vanillin -H2SO4 colorimetry method. ResultsThe calibration curve of total saponins in Radix Platycodonis samples for this method was A=0.003 4C+0.

4、006 4, r=0.999 7. The average recovery and RSD were 96.97% and 1.51%，respectively. The content range of total saponins in Radix platycodonis from different origins was from 1.07% to 3.76%. ConclusionThis determination method is practical, reproducible and can be used for eva luating the quality of R

5、adix Platycodonis samples.Key words：Radix Platycodonis; Total saponins; Platycodin D; Colorimetry桔梗(Radix Platycodonis)為桔梗科(Campanulaceae)植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC的干燥根1，是一種藥食同源的植物，用途廣泛。桔梗性味苦、辛、平，歸肺經(jīng)，有宣肺、利咽、祛痰、排膿之功效，用于咳嗽痰多，胸悶不暢，咽痛，音啞，肺癰吐膿，瘡瘍膿成不潰，被廣泛應(yīng)用于祛痰止咳藥2。桔梗中的皂苷類成分，是桔梗藥用品質(zhì)的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，桔梗中含

6、有大量的三萜皂苷，已經(jīng)分離鑒別出四十多種單體皂苷，如桔梗皂苷D、桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D2、D3、桔梗皂苷E等35。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桔梗皂苷為桔梗主要的藥理活性成分6。中國(guó)藥典(2005年版)采用重量法測(cè)定桔?？傇碥蘸?，該方法操作繁瑣，特別是其中糖類成分等雜質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，造成檢測(cè)結(jié)果大大高于實(shí)際總皂苷的含量7,8。本實(shí)驗(yàn)以桔梗皂苷D為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-硫酸顯色，比色法對(duì)桔?？傇碥盏暮窟M(jìn)行了測(cè)定。1 儀器與材料1.1 儀器與試劑UV2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)；TB-214型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（國(guó)

7、華電器有限公司產(chǎn)品）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-205（BuCHI有限公司產(chǎn)品）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9240（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品）；SK8200H型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；SHZ-型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；大孔樹(shù)脂層析色譜柱(內(nèi)徑3 cm，長(zhǎng)30 cm)。標(biāo)準(zhǔn)品桔梗皂苷D (HPLC制備純化，純度用歸一化法計(jì)算在98%以上)；AB8型大孔吸附樹(shù)脂(南開(kāi)大學(xué)化工廠)；其他試劑均為分析純。1.2 材料桔梗樣品共14個(gè)：GP1BC1-12和GP1BC2-6為3代不育株系，GSNH3-M3為2代粉花自交株系，種質(zhì)來(lái)源于河北；GP2BC4-10和GP2BC4-5為3代

8、不育株系，GS902-7-2為3代自交保持株系，種質(zhì)來(lái)源于安徽；GS218-1，GS218-2和GS228-1為2代自交系，種質(zhì)來(lái)源于山東；GS111-2為2代自交株系，GS262-W4-W2為3代自交保持株系，種質(zhì)來(lái)源于赤峰；GS173-5為2代自交株系，來(lái)源于延慶野生種質(zhì)；CK2為山東生產(chǎn)用種質(zhì)，CK1為赤峰生產(chǎn)用種質(zhì)9。以上各樣品于200711初地上部分枯萎后，將其根部挖出，每個(gè)樣品系內(nèi)隨機(jī)取3株，洗凈，趁鮮刮去外皮，烘箱中60 烘干，粉碎，粉末混合均勻后，裝于自封袋中，置于干燥器中保存，備用。樣品均采自藥用植物研究所試驗(yàn)基地（北京市海淀區(qū)），由魏建和研究員鑒定。2 方法與結(jié)果2.1 標(biāo)

9、準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取經(jīng)60減壓干燥至恒重的桔梗皂苷D 3.5 mg，加70%甲醇適量溶解，置1 ml量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。2.2 供試品溶液的制備取桔梗藥材已干燥粉末約1.0 g，準(zhǔn)確稱定，置索氏提取器中，加入10倍量的70%甲醇后，準(zhǔn)確稱重。浸泡30 min，加熱回流提取3次，2 h/次，再次稱重，補(bǔ)加70%甲醇至回流前重量。過(guò)濾，合并濾液于蒸發(fā)皿中，水浴蒸發(fā)至干，用10 ml水溶解殘留物，將所得溶液緩緩?fù)ㄟ^(guò)已處理好的AB8型大孔吸附樹(shù)脂柱(重量比120)，反復(fù)上樣5次后，以水150 ml洗脫，棄去水液，之后再以300 ml 60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，蒸干

10、。殘留物用70%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，定容，搖勻，即得10。2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇精密移取80 l的標(biāo)準(zhǔn)品及50 l的供試品溶液，置10 ml具塞磨口試管中，于70水浴蒸發(fā)至干，精密加入10%香草醛試液0.5 ml，60%硫酸5 ml，搖勻，于60水浴加熱15 min，冰水浴中冷卻3 min，隨行試劑做空白，在紫外分光光度計(jì)于400700 nm波長(zhǎng)范圍全程掃描11，標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的最大吸收波長(zhǎng)均在472 nm，且空白對(duì)照無(wú)干擾，故選擇472 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，40，80，160，200 l,置10 ml具塞磨口試管中，于70水浴

11、蒸發(fā)至干，精密加入10%香草醛試液0.5 ml，60%硫酸5 ml，搖勻，于60水浴加熱15 min，冰水浴中冷卻3 min，以同法平行處理的空白溶劑為空白，在472 nm處測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度C(l/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為:A=0.003 4C+0.006 4，r=0.999 7，結(jié)果看出C在此濃度系列范圍內(nèi)與A呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。2.5 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液80 l，按照“2.4”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，結(jié)果RSD為0.30%，說(shuō)明儀器的測(cè)試性能良好。2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液50 l，按照“2.4”項(xiàng)下方法操作，按

12、不同時(shí)間測(cè)定其吸光度變化，在放置5，10，20，30，40，50，60 min后，吸光度分別為0.214，0.214，0.214，0.215，0.216，0.215，0.217。結(jié)果表明該法在60 min內(nèi)，吸光度值穩(wěn)定。2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取桔梗藥材已干燥粉末6份，每份1.0 g，準(zhǔn)確稱定，按照“2.2”項(xiàng)下操作，制備6份供試品溶液，各準(zhǔn)確移取50 l，按照“2.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度A，計(jì)算總皂苷含量。結(jié)果平均含量為3.07%,RSD為1.17%。2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取已知含量的桔梗藥材已干燥粉末6份，每份0.05 g，加入桔梗皂苷D適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，

13、各取50 l樣品液，按照“2.4”項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。平均加樣回收率為96.97%,RSD為1.51%(n=6)。表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.9 不同桔梗樣品中總皂苷含量測(cè)定精確稱取所采集的14種不同桔梗選育品系12，各3份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各精密移取50 l，按照“2.4”項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定吸光度，從回歸方程中計(jì)算供試品桔?？傇碥盏暮浚錅y(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。表2 桔梗總皂苷含量測(cè)定結(jié)果（略）3 討論中國(guó)藥典(2005年版)采用重量法測(cè)定桔?？傇碥蘸?，規(guī)定其含量不得少于6%，但是重量法操作繁瑣，重復(fù)性不高，特別是其中糖類成分等雜質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)

14、定結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，造成檢測(cè)結(jié)果大大高于實(shí)際總皂苷的含量，結(jié)果誤差較大。本方法采用大孔樹(shù)脂純化桔?？傇碥?，然后用比色法測(cè)定，雖然不同來(lái)源桔梗中總皂苷的含量范圍為1.07%3.76%，低于藥典規(guī)定，但是本實(shí)驗(yàn)所采集樣品均為一年生植株，且測(cè)定的是較純的桔?？傇碥?，大大地減少了雜質(zhì)的干擾。該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，且精密度高，重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好，平均回收率為96.97%，可用于對(duì)桔梗藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。GP代表桔梗不育系測(cè)交材料，GS代表桔梗自交系材料，CK為對(duì)照樣品;n=3通過(guò)大孔樹(shù)脂純化得到的提取液依“2.4”項(xiàng)下方法顯色，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到的全波長(zhǎng)掃描圖，其最大吸收波長(zhǎng)與標(biāo)準(zhǔn)品相差很小。同時(shí)弱極性的

15、AB-8型大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸附率均比較理想，故AB-8型大孔吸附樹(shù)脂在樣品的純化中不失為較好的選擇?？梢?jiàn)該方法可以有效的去除干擾，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。結(jié)合文獻(xiàn)，為簡(jiǎn)便桔梗總皂苷的提取，多采用超聲提取法代替回流提取法，筆者總結(jié)了超聲提取法的提取條件為：用10倍量甲醇在40，100%功率下超聲提取3次，30 min/次。但與加熱回流提取法所得提取液同時(shí)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，超聲法所得提取液遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于回流法。所以筆者放棄超聲提取法，選用了更為準(zhǔn)確的加熱回流提取法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典,部S.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:196.2魏尚洲. 桔梗資源的綜合開(kāi)發(fā)利用J. 陜西

16、科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 23(5): 141.3Lee J Y，Hwang W I，Lim S T.Antioxidant and anticancer activities of organic extracts from Platycodon grandiflorum A，De Candolle rootsJJ Ethnopharmacol，2004，93(2-3)：409.4吳碧元，孫軍，蔣紅芳. 桔梗提取工藝的研究J.中藥材，2002，25（6）：430.5何美蓮，程小衛(wèi)，陳家寬，等桔梗皂苷類成分及其質(zhì)量分析J中藥新藥與臨床藥理，2005，16(6)：457.6Kim YS，Kim JS，Choi SUIsolation of a new saponin and cytotoxic effect of saponins from the root of Platycodon grandiflorum on human tumor cell linesJPlanta Med，2005，71(6)：566.7石俊英，董其亭，鞏麗麗，等.不同產(chǎn)地桔梗中總皂苷成分與質(zhì)量的相關(guān)性研究J.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，30（3）：247.8李喜鳳，薛