降膽固醇乳酸菌鑒定及其在體外模擬胃腸環(huán)境中抗性研究

1、降膽固醇乳酸菌鑒定及其在體外模擬胃腸環(huán)境中抗性研究    摘要:一株源于四川泡菜的具有降膽固醇能力的乳酸菌P5經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16SrDNA序列分析，鑒定為植物乳桿菌(Lac-tobacillus川antan朋P5)。在體外模擬胃腸環(huán)境中的抗性研究結(jié)果表明，P5具有較強耐酸能力，pH值為2.0時，2h活菌數(shù)保持在106cfi刀mL;pH值為2.5時，4h內(nèi)活菌數(shù)仍可保持在l護c細mL，pH值為30一3.5時，P56h內(nèi)活菌數(shù)可保持在l。戈細mL;P5具有耐高濃度膽汁鹽的能力，在0.1%膽汁鹽MRS中，P5表現(xiàn)出生長趨勢，在02%兩0.5%膽汁鹽M

2、RS中，P5活菌數(shù)下降急速，但6h后活菌數(shù)能保持在105cfi刀n1L;P5對腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌等腸道致病菌有明顯抑制作用。P5可望作為食品工業(yè)用菌種的資源。關(guān)鍵詞:乳酸菌;植物乳桿菌;抗性;抑菌過量膽固醇嚴(yán)重威脅著人類健康，可引發(fā)冠心病、腦中風(fēng)等疾病l-n。乳酸菌及其相關(guān)制品具有降低介質(zhì)及血清膽固醇的能力，已被體內(nèi)及體外的大量實驗所證實閱。乳酸菌在體內(nèi)發(fā)揮降膽固醇作用的重要場所在小腸，所以，乳酸菌及其制品作為生物活性食品或者微生態(tài)制劑要進入人體，則必須經(jīng)過人體胃腸道對其存活能力的考察，才能發(fā)揮其特殊功效l9。本試驗對篩選于泡菜中具有降膽固醇功能的乳酸菌P5

3、進行鑒定，并模擬胃腸道環(huán)境考察此株乳酸菌能否在腸道中存活，為其作為食品發(fā)酵劑或微生態(tài)制劑開發(fā)提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料供試菌:乳酸菌P5，分離自四川泡菜，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品微生物實驗室保存。病原指示菌:銅綠假單胞桿菌認TCC27853)、大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)和腸炎沙門氏菌(CICC21482)，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品微生物實驗室保存。膽固醇，膽汁鹽，溶菌酶(10叭)，BaeterialoNAout抽提試劑盒，ZxlongT叫PeRMaste硯ix等。高膽固醇MRs液體培養(yǎng)基:膽固醇0.19，膽汁鹽0.29，蔗糖酷19，吐溫一80

4、lmL，攪拌均勻，再移取冰乙酸stnL加熱溶解，溶解液用超聲波soow處理20min后，快速加入滅菌后的1000mLMRS液體培養(yǎng)基中，邊加邊攪拌，使其形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液。1.2方法乳酸菌P5降膽固醇的測定:乳酸菌P5接種于MRs液體中，37培養(yǎng)18h，制成種子液。吸取該種子液150林L轉(zhuǎn)接于smL高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基，于37培養(yǎng)(每隔12h振蕩1次)72h，收獲培養(yǎng)液。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品中膽固醇含量測定參見GB/T15206一1994食品中膽固醇測定方法一硫酸鐵錢法l0l。計算膽固醇降解率:膽固醇的降解率=(C一A)/Cxl00%式中:A為菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在波長560nm處的OD值

5、，C為空白對照波長56Ofun處的OD值。膽固醇脫除率及細胞吸收(吸附)率的測定:乳酸菌P5接種于高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)72h后，發(fā)酵液于4000r/min離心1omin，菌體沉淀用與原發(fā)酵液等量的生理鹽水以3000r/min離心smin洗滌3遍，保留洗滌液，測定發(fā)酵上清液與菌體洗滌液中膽固醇含量。分別計算膽固醇脫除率和細胞吸收(吸附)率。膽固醇脫除率一(l一OD，幾清液/?？谖唇泳霚鹸l。%。細胞吸收(吸附)率二。洗滌側(cè)。D衣接菌培養(yǎng)液x100%。形態(tài)學(xué)鑒定:乳酸菌P5劃線在MRS瓊脂平板，37培養(yǎng)48h觀察。記錄其固體培養(yǎng)特征菌落形狀、大小、顏色、邊緣、表面、隆起度、透明度

6、和溶鈣現(xiàn)象;革蘭氏染色觀察記錄顏色、形狀、大小、排列等。生理生化鑒定:參照俘L酸細菌分類鑒定及實驗方法)l進行生理生化特征分類鑒定。包括接觸酶、氧化酶、石蕊牛奶、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、溫度試驗和糖(醇)發(fā)酵。165rDNA的克隆及序列測定:細菌基因組總DNA的提取:將P5接種于sn1LMRS液體培養(yǎng)基中，30筆振蕩培養(yǎng)18h，收獲菌體。按TIA卜amPBaeteriaoNA幻t提取試劑盒使用手冊提取細菌基因組DNA。165rDNA基因的PCR擴增:正向引物:5氣AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3;反向引物:5氣TAeoGeTAeeTTGTTAeGAeTT一3。25卜LPcR反應(yīng)體系:上下游

7、引物各l林L(10卜moFL)，模板DNAl卜L，ZxlongTaqpCRMasterMix6.5卜L(包括:2.suz林LIongTaqpol”erase0.5卜L，250協(xié)mol/LdNTpeaehZ林L，10xPCRBuffer(M獷Free)2.5林L，25mmol/LMgC121.5卜L)，超純水15.5卜L。PCR反應(yīng)條件:94預(yù)變性smin;然后94、455，56、455，72、lmin305，循環(huán)30次;最后72T延伸10min。PCR產(chǎn)物4保存。回收擴一增產(chǎn)物由寶生物工程(大連)有限公司測序，將PS16sr0NA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。1.23耐酸試驗用鹽酸

8、調(diào)MRS液體培養(yǎng)基pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，以2%接種量(調(diào)整細胞濃度約10吃幾恤IL)接種己活化乳酸菌P5后，于37培養(yǎng)0h、2h、4h和6h后，稀釋平板菌落計數(shù)法測定其活菌數(shù)，重復(fù)3次，求平均值。12.4耐膽汁鹽試驗在添加質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的膽汁鹽MRS液體培養(yǎng)基(hav)中，以2%接種量(調(diào)整細胞濃度約lo6cfi“1llL)接種己活化乳酸菌ps后，37培養(yǎng)oh、Zh、4h和6h后，稀釋平板菌落計數(shù)法測定其活菌數(shù)，重復(fù)3次，求平均值。采用牛津杯雙層瓊脂法。將致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌和銅綠假單胞菌活化

9、24h，接種于45營養(yǎng)瓊脂(菌濃度10弋至b/角L)中，混勻后倒入均勻擺放牛津杯的素瓊脂表面，吸取P5發(fā)酵上清液和未接種的無菌MRS培養(yǎng)基50林L加入小孔中，4擴散lh，37恒溫培養(yǎng)24h，測量并記錄抑菌圈直徑，重復(fù)3次求平均值。2結(jié)果2.1乳酸菌P5對膽固醇脫除結(jié)果乳酸菌P5在MRS培養(yǎng)基中對膽固醇的降解率為40.460/0，脫除率為50.15%，細胞吸收(吸附)率為9.69%。2.2乳酸菌P5的鑒定乳酸菌P5在MRS平板上37培養(yǎng)48h，菌落直徑為11.5，白色，不透明，隆起，圓形，邊緣整齊，表面光滑，有溶鈣圈(圖1)。乳酸菌P5為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀，少數(shù)成對或成鏈狀，無芽抱，無鞭

10、毛，無莢膜(圖2)。乳酸菌P5的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。根據(jù)(4L酸細菌分類鑒定及實驗方法)ll，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，可初步判定該菌株屬于乳酸桿菌屬的植物乳桿菌。提取乳酸菌P5總DNA后，利用通用引物對其165rDNA基因進行PCR擴增后，經(jīng)1%電泳檢測，所得PCR產(chǎn)物測序。將乳酸菌PS16srDNA基因測序結(jié)果1437bp與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行同源性對比并提交，結(jié)果表明，乳酸菌P5與oQ461600、AB474370、FJ915774等26個植物乳桿菌的同源性最高，達100%，根據(jù)其親緣關(guān)系和結(jié)合生理生化試驗鑒定結(jié)果將乳酸菌P5鑒定為植物乳桿菌(L夕拍刀細川功)，其在oe祀a欣中登

11、錄號為HQ647115。2.3耐酸性試驗2.4耐膽汁鹽試驗將P5接種于不同膽汁鹽含量的MRS液體培養(yǎng)基中，通過活菌計數(shù)來考察該菌對膽汁鹽的耐受性，結(jié)果見圖4。在不含膽汁鹽的培養(yǎng)基中，經(jīng)2h遲滯期后表現(xiàn)出生長趨勢;在0.1%膽汁鹽培養(yǎng)基中，活菌數(shù)先減少，后生長;在0.2%司.5%膽汁鹽MRS中，P5在2h內(nèi)活菌數(shù)急劇下降，保持活菌數(shù)在10籠創(chuàng)mL，但在此后的4h內(nèi)，活菌數(shù)雖仍在下降，但仍能保持在1護c徹mL。2.5抑菌試驗植物乳桿菌P5發(fā)酵上清液對幾種常見腸道病原菌的抑菌結(jié)果(表2)可以看出，植物乳桿菌P5對幾種病原菌有明顯抑制作用，抑菌效果良好。3結(jié)論與討論(1)正常人的胃液pH值大小因食物結(jié)

12、構(gòu)不同而波動，通常pH值在30左右，且食物(尤其是流體)通過胃的時間相對較短，一般lh一2hl2l。表明植物乳桿菌P5耐酸能力較強，能夠確保一定數(shù)量活菌(至少10吃丘功11L)順利通過胃酸環(huán)境到達腸內(nèi)。小腸是膽固醇的吸收場所，亦是乳酸菌發(fā)揮降膽固醇功能的主要部位。正常人體刁崛種用夢十鹽髓勤0.03%一0.3%l3。也就是說，乳酸菌要定殖于腸道內(nèi)，需耐受一定濃度的膽汁鹽。試驗表明，植物乳桿菌P5耐受膽汁鹽能力較強，推測該菌被食入后能確保一定數(shù)量活菌(至少105c徹mL)達到小腸并發(fā)揮降膽固醇功能。在實際應(yīng)用中，可提高初始菌濃度(如10scfi刀InL)，則在相同條件下，將會有更多的P5活菌到達小

13、腸并發(fā)揮其功效。(2)許多研究表明，微生態(tài)制劑不但能提高機體性能l，而且能降低腸桿科細菌在腸道各部位定殖水平，從而影響腸道菌群微生態(tài)平衡(5。PROHASZKAL等網(wǎng)發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物乳酸和揮發(fā)性脂肪酸對降低沙門氏菌等腸桿菌科細菌定殖腸道起到重要作用。植物乳桿菌P5的發(fā)酵上清液對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌存在明顯抑制作用，有利于阻止病原菌定殖于腸道。(3)乳酸菌ps被鑒定為植物乳桿菌ps(L.pl胡tarumps)。目前對于能耐受0.5%膽鹽濃度的植物乳桿菌少見報道，乳酸菌P5的獲得豐富了膽固醇降解菌種的資源。植物乳桿菌是益生菌中具有代表性的典型菌種ln，作為人體腸道的益生菌群，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡、提高機體免疫力和促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能，可廣泛應(yīng)用于泡菜、發(fā)酵果汁、發(fā)酵肉制品以及微生態(tài)制劑的開發(fā)中，該菌株是食品工業(yè)用菌種佳選。參考文獻:1楊覽春.美國對血壓和膽固醇最新醫(yī)療指南概述J.中闊實用內(nèi)科雜志:l晦床前沿版，2006(8):1295一1296.2齊智，元香南，尹杰，等.高膽固醇不同攝入量對血脂的影響J1.營養(yǎng)學(xué)報，2006，28(5):442一43.【3張佳程.乳酸菌對食品中膽固醇脫除作用的研究J.食品科學(xué)，1998，19(3):21一22.4GILLILANDSE，NELSONCR，MAXNELLC.As