厭氧菌的培養(yǎng)方法

1、厭氧菌的培養(yǎng)方法厭氧菌的培養(yǎng)方法 n物理方法包括遮斷空氣法、煮沸法、真空法、空氣置換法、氣體噴射法或轉(zhuǎn)管法等n化學(xué)方法包括焦性沒(méi)食子酸法、鐵絲絨法、保險(xiǎn)粉法等 n生物學(xué)方法包括與需氧菌共生好氧法、燕麥發(fā)芽法等 n混合法包括厭氧罐（袋）法、厭氧手套箱法或厭氧室法、空氣置換鐵絲絨法、空氣置換鈀粒法等。 1 液體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法液體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法n培養(yǎng)基煮沸：驅(qū)氣后置流水中急速冷卻 n添加還原劑： 0.030.05L-鹽酸半胱氨酸 0.010.02硫乙醇鈉 0.51葡萄糖 0.1抗壞血酸 其它還原劑 n添加瓊脂 2 固體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法固體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法n厭氧罐法 n簡(jiǎn)易厭氧罐和厭氧袋法

2、 n鋼絲絨法 n焦性沒(méi)食子酸法n抽氣換氣厭氧培養(yǎng)法 n生物好氧厭氧培養(yǎng)法 n轉(zhuǎn)管技術(shù)和氣體噴射培養(yǎng)法 n厭氧手套箱法 （又稱厭氧室法） 2.1 Gas-pak法 原理氣體發(fā)生袋： 檸檬酸和碳酸氫鈉 H2O CO2 硼氫化鈉 H2O H2 觸媒 ： 鈀粒 H2O 厭氧罐中的O2 厭氧指示劑 11111 厭氧指示劑 n亞甲基蘭 指示劑n盧卡斯固體厭氧指示劑 n布魯氏指示劑 亞甲基蘭 指示劑n6葡萄糖水溶液 2n0.1N氫氧化鈉水溶液 0.1n0.05亞甲基蘭水溶液 0.2 厭氧 無(wú)色 殘存有氧氣 藍(lán)色 盧卡斯固體厭氧指示劑 n2硼砂溶液 5毫升n9硫乙醇酸 1毫升n酚紅溶液 0.10.2毫升n0.

3、02美蘭溶液 10毫升n瓊脂 1 厭氧 無(wú)色 殘存有氧氣 藍(lán)色 布魯氏指示劑 n60羥甲基氨基甲酯 1n4葡萄糖 1n0.02美藍(lán) 1 厭氧 無(wú)色 殘存有氧氣 藍(lán)色Gas-Pak法的使用操作程序 n平皿培養(yǎng)基裝入平皿架中置厭氧罐內(nèi)；n打開內(nèi)蓋居中金屬網(wǎng)袋，裝入觸媒鈀粒；n打開錫箔紙袋，取出厭氧指示劑片；n剪開氣體發(fā)生袋一角，注入10毫升水，迅速緊閉罐蓋，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。n約經(jīng)510分鐘后，放入?yún)捬踔甘緞┢?。n注：操作較復(fù)雜，需注入水作為觸媒。2.2.1 簡(jiǎn)易厭氧罐 干燥器容內(nèi)徑（厘米） 容器1 容器2 容器3 容積（毫升） 硼氫鈉 氯化鈷 0.2克 檸檬酸0.6克 15cm（約2150毫升）

4、或 和 0.6克 鈀粒1.5克 碳酸氫鈉0.7克18cm（約3500毫升） 硼氫鈉 氯化鈷0.33克 檸檬酸1克 或 和 1克 鈀粒2克 碳酸氫鈉1.15克2.2.2 厭氧袋法 (三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社)聚碳酸酯（復(fù)合塑料膜）制厭氧袋 n產(chǎn)氣袋：2.5L、3.5L、350ml；n厭氧指示劑n厭氧培養(yǎng)罐：2.5L、7L、15x30cm培養(yǎng)袋、立式培養(yǎng)袋；n微需氧產(chǎn)氣袋 適合嗜二氧化碳菌適合嗜二氧化碳菌 培培養(yǎng)養(yǎng)適合厭氧菌的培養(yǎng)適合厭氧菌的培養(yǎng)適合兼性厭氧菌適合兼性厭氧菌 的培養(yǎng)的培養(yǎng)培養(yǎng)容器系列產(chǎn)品MGC厭氧培養(yǎng)產(chǎn)品信息列表n 耗材類產(chǎn)品名稱編號(hào)AnaeroPack（安寧包）厭氧產(chǎn)氣袋C-1微需氧

5、產(chǎn)氣袋C-2CO2產(chǎn)氣袋C-3Oxygen-Ind氧氣指示劑C-22AnaeroPouch（安寧包）厭氧產(chǎn)氣袋C-11相應(yīng)培養(yǎng)容器編號(hào)2.5L密封盒C-317.0L密封盒C-32立式培養(yǎng)袋C-43通用1530cm培養(yǎng)袋C-41備注：少量樣品培養(yǎng)選用AnaeroPouch系列產(chǎn)品（2-4皿/次）； 常規(guī)及大量培養(yǎng)選用AnaeroPack系列產(chǎn)品（10培養(yǎng)皿以上）。厭氧培養(yǎng)氣體變化曲線圖AnaeroPack-Anaero吸收容器中的氧氣，產(chǎn)生二氧化碳，30-60分鐘內(nèi)氧氣被完全吸收，產(chǎn)生21%左右的二氧化碳。微需氧培養(yǎng)氣體變化曲線圖AnaeroPack-MicroAero吸收容器中的氧氣，產(chǎn)生二氧

6、化碳，在一小時(shí)內(nèi)氧氣濃度變?yōu)?-9%，二氧化碳濃度變?yōu)?-8%。1.新鮮指示劑為粉紅色（無(wú)氧，左）和藍(lán)色（有氧，右），重復(fù)使用后受環(huán)境影響，反應(yīng)減弱，指示劑變?yōu)闇\紫色（無(wú)氧，中左）和淡藍(lán)色（有氧，中右）。2.厭氧培養(yǎng)2-3小時(shí)后指示劑顏色變化穩(wěn)定。氧氣指示劑顏色變化圖解2.2.3 保險(xiǎn)粉的厭氧罐培養(yǎng)法 n二亞硫酸鈉（Na2S2O4） 碳酸氫鈉 無(wú)水硫酸鈉 n不用觸媒2.3 鋼絲絨法 酸性硫酸銅溶液 鋼(鐵)絲絨 銅和鐵的絡(luò)合物 O2 厭氧指示劑 n酸性硫酸銅溶液： 將自來(lái)水1升加硫酸銅60g，吐溫-80 20ml，加熱溶解后，又加入2N的硫酸90ml，最后加水至6升 ；n方法： 取56g鋼絲絨

7、/ L，于11.5升酸性硫酸銅溶液浸泡3060s，鋼絲絨變成紅銅色，擠凈液體置鋁質(zhì)或玻璃容器中，放入?yún)捬豕迌?nèi)。隨后將厭氧指示劑放入，密封厭氧罐，14h后可達(dá)厭氧狀態(tài) 2.4 焦性沒(méi)食子酸法 焦性末食子酸粉末，NaHCO3或NaOH溶液 無(wú)菌玻片 已接種細(xì)菌的平板倒扣在上面 融化的白蠟封邊2.5 抽氣換氣厭氧培養(yǎng)法 n玻璃干燥罐 n混合氣鋼瓶: 10二氧化碳、10的氫氣、80的氮?dú)?n三通閥n觸媒:鈀粒 / 浸泡鋼絲絨 / 氯化鈷 n厭氧指示劑1：厭氧培養(yǎng)罐 2：混合氣體（CO2：H2：N2=1：1：8）鋼瓶3：壓力表 4：三通閥 5：緩沖瓶 6：真空泵2.6 生物好氧厭氧培養(yǎng)法 n皰肉培養(yǎng)基:

8、 牛肉渣 0.5g 牛肉浸液 7ml 液面上加蓋34mm厚的融化凡士林，滅菌。n生物好氧厭氧培養(yǎng)方法 2.7 轉(zhuǎn)管技術(shù)和氣體噴射培養(yǎng)法 360鋼瓶進(jìn)氣 銅柱 除氧氣體 （亮黃色）微量O2 H2源 CuO （黑色） 接種或移植2.8厭氧手套箱法n又稱厭氧室法3 厭氧培養(yǎng)方法的選擇厭氧培養(yǎng)方法的選擇n亨格特的預(yù)還原滅菌厭氧培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)管技術(shù)、氣體噴射培養(yǎng)法 n厭氧手套箱培養(yǎng)法 用于要求嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)法的微生態(tài)學(xué)（正常菌群）的研究工作 n厭氧罐(袋)法結(jié)合其它厭氧培養(yǎng)方法 適用于對(duì)氧極其敏感的厭氧菌。 在臨床細(xì)菌的檢驗(yàn)工作中，可以充分使用此法分離感染癥中的厭氧病原菌。 4 厭氧菌的保存厭氧菌的保存4.

9、1繼代保存： 以GAM半固體流動(dòng)培養(yǎng)基和TEP半固體培養(yǎng)基作傳代培養(yǎng)保存。用毛細(xì)吸管吸菌進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使用白金接種環(huán)移菌接種，可以避免有的菌在操作中接觸空氣或氧化物而死亡。數(shù)周作一次繼代培養(yǎng)。新分離的的菌種，在幾個(gè)月內(nèi)，每34星期傳代一次。被保存的菌種，放室溫下暗處。最好是不同菌用不同培養(yǎng)基保存。 4.2 冷凍保存： 20脫脂牛奶0.5ml分注在帶螺旋塞的玻璃瓶中，經(jīng)110、15分鐘高壓滅菌，冷卻后，先用毛細(xì)吸管取半固體高層培養(yǎng)基2448h生長(zhǎng)茂盛部位的厭氧菌液0.5ml，加入玻璃瓶中，直接置于80冰庫(kù)中保存。 厭氧菌較理想的保存方法是液氮保存法。厭氧菌較理想的保存方法是液氮保存法。將將108以上濃菌液置脫纖維羊血、脫纖維兔血以上