痰瘀證的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的臨床研究

1、    痰瘀證的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的臨床研究 郎笑梅,徐珊作者單位：1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053 2.浙江省人民醫(yī)院【摘要】目的分析痰瘀證患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，探討痰瘀證患者血清多肽蛋白表達的差異性。方法應(yīng)用表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(SELDITOFMS)及弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片(weak cationic exchanger protein chip)技術(shù)檢測14例痰瘀證患者和16例性別、年齡匹配的正常對照組血清，獲得血清蛋白質(zhì)指紋圖譜。結(jié)果痰瘀證組與正常對照組之間檢測到18種差異蛋白(P<0.05)。結(jié)論痰瘀證患者血清中存

2、在一些差異表達蛋白質(zhì)?！娟P(guān)鍵詞】 痰瘀證;蛋白質(zhì);指紋圖譜Abstract：ObjectiveTo observe the serum albumin fingerprint spectrum of sputum stasis syndrome and explore the disparity of its polypeptide albumin expressions.MethodApply SELDITOFMS and weak cationic exchanger protein chip to test 14 cases and 16 normal persons serum for

3、 fingerprint spectrum.ResultTherere 18 kinds of disparity albumin between patients and normal persons.ConclusionSputum stasis patients have some different expressed albumin in serum.Key words：sputum stasis syndrome;albumin;fingerprint spectrum所謂“證”，是指在疾病發(fā)展過程中，某一階段的病理概括。它包括病的原因(如風寒、瘀血、痰飲等等)、病的部位(如表、里

4、、某臟、某腑等等)、病的性質(zhì)(如寒、熱等等)，反映了疾病過程中該階段病理變化的全面情況。筆者應(yīng)用SELDITOFMS及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)從蛋白質(zhì)指紋圖譜角度探討痰瘀證本質(zhì)及發(fā)病機制。1 資料與方法1.1 臨床資料14例為2008年1月至2008年12月浙江省人民醫(yī)院中醫(yī)科門診病人，診斷標準根據(jù)中醫(yī)診斷學中關(guān)于痰證和瘀證的診斷標準擬定，主要以舌象的舌質(zhì)紫暗、舌苔滑膩和脈象的脈澀為診斷依據(jù)。其中男13 例，女1例;年齡2569 歲，平均(47)歲。選擇16例正常健康人為對照組，其中男15例，女1例;年齡2865歲，平均(46.5)歲。2組年齡、性別等資料經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異，具有可比性。1.2 材

5、料和方法(1)材料：尿素、乙腈、三氟乙酸、TrisHCl pH9.0、CHAPS、DTT、NaAc、HPLC H2O 和sinapinic acid(SPA)等均購自Sigma公司。(2)方法：血清標本處理：14例痰瘀證患者和16例正常健康人各空腹采集靜脈血3ml，采集后立即于4低溫冰箱靜置2h， 4，4000r/min離心10min分離血清，將血清于4，12000r/min再次離心5min，去除所有殘留細胞碎片和不溶物，在冰上將血清分裝為每管100l，保存于-80冰箱。實驗檢測血清均僅一次凍融。從-80冰箱中取出血清樣品，于4，10000 r/min，離心5min;取血清10l，加入20lU

6、9緩沖液(9M Urea，2% CHAPS，50mM TrisHCl，pH9.0)稀釋，而后，將以上標本冰浴振蕩30min，400r/min;將30l上述變性后標本加入360l相應(yīng)的結(jié)合緩沖液混勻，待用。所有樣本均進行雙份檢測以減少實驗誤差。WCX2操作簡要步驟：將200l結(jié)合緩沖液(50mM NaAc，Ph4.0)加至已裝好WCX2的Bioprocessor(美國Ciphergen公司)中，置振蕩器(MS1 Minishaker)400600 r/min震蕩 5min，甩掉緩沖液。重復(fù)上述操作兩次。在芯片處理器每孔中加入100l處理好的標本，置振蕩器400600 r/min，4震蕩1h;甩出

7、標本。 每孔加入200l結(jié)合緩沖液，室溫置振蕩器400600 r/min，震蕩 5min，甩去孔中液體，再次加入結(jié)合緩沖液200l，重復(fù)操作一次。立刻拆開芯片處理器，取出芯片，待干后，在每個加樣孔上加SPA0.5l，干燥后再重復(fù)加SPA0.5l一次，然后用蛋白質(zhì)指紋圖譜儀(SELDITOFMS，美國Ciphergen公司)閱讀芯片。蛋白質(zhì)指紋圖譜的測定參數(shù)和標化：在讀取數(shù)據(jù)前，用加有allinone標準蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，使分子誤差<0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數(shù)設(shè)定：最佳激光強度240，最佳檢測靈敏度8;設(shè)最高檢測分子質(zhì)量為50Da，最佳狀態(tài)從1Da到15000 Da;

8、蛋白質(zhì)指紋圖譜的標化參數(shù)：蛋白峰范圍質(zhì)荷比(m/z)200045000;m/z為6634.8的蛋白為所有蛋白譜的共有蛋白，作為校正的內(nèi)參照。1.3 統(tǒng)計學處理蛋白質(zhì)指紋圖譜統(tǒng)計用Ciphergen Protein Chip軟件，數(shù)據(jù)輸入計算機，兩樣本總體方差齊同時，兩樣本均數(shù)用t檢驗; 兩樣本總體方差不齊同時，兩樣本均數(shù)用近似t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 實驗結(jié)果14例痰瘀證患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜建立后，在(m/z)200045000Da范圍內(nèi)，與正常對照組比較，共檢測出18種差異表達蛋白(P<0.05)，m/z為2757、4477、6635、6885、7976 、

9、8694 、8898 、 8943 、 13749 、13956和15929的11種血清多肽蛋白的濃度顯著增高， m/z為2058、2146、2190 、2958、3163、5911和6116的7種血清多肽蛋白的濃度顯著降低。極顯著差異的多肽蛋白質(zhì)結(jié)果見表1，極顯著差異的多肽蛋白質(zhì)指紋圖譜見圖1。表1 痰瘀證組與正常對照組之間差異多肽蛋白比較(略)3 討論蛋白質(zhì)作為生命活動的“執(zhí)行者”，參與了DNA合成、基因轉(zhuǎn)錄激活、蛋白質(zhì)翻譯、修飾、定位及信號傳導(dǎo)等重要的生物過程。血漿或血清蛋白質(zhì)組成與細胞、組織與器官的整個生理、病理以及機能狀態(tài)密切相關(guān)，蘊藏著與疾病發(fā)生機制、早期診斷及預(yù)后評估密切相關(guān)的巨

10、大信息1。蛋白質(zhì)組學是從整體的角度，分析細胞內(nèi)動態(tài)變化著的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間相互作用和聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律，其理論與技術(shù)特點，以及其整體、動態(tài)性的核心思想，與中醫(yī)學的“整體觀”和“辨證觀”等理論體系有著驚人的類似之處，用此方法能揭示證候的物質(zhì)基礎(chǔ)并進行定量和定性分析。由此有學者3提出證候蛋白質(zhì)組學觀點，即在證候理論指導(dǎo)下，運用功能蛋白質(zhì)組學的方法，通過探討證候，特別是同病異證或異病同證的蛋白質(zhì)差異表達及翻譯后的修飾情況，提示與某一證候形成相關(guān)的所有蛋白質(zhì)及特征，在整體蛋白質(zhì)表達的水平上闡明證候本質(zhì)。痰是機體水液代謝障礙所形成的病理產(chǎn)物。一般認為

11、濕聚為水，積水成飲，飲凝成痰，總的來講由于水濕痰飲均為津液在體內(nèi)停滯而成。 “瘀，積血也?！?說文解字)故也稱瘀血，是指體內(nèi)血液停滯，不能正常循行，它既指積于體內(nèi)的離經(jīng)之血，又包括阻滯于血脈及臟腑內(nèi)的運行不暢的血液。對痰與瘀的關(guān)系，歷代醫(yī)家認為：痰是津液的病理產(chǎn)物，瘀是血的病理產(chǎn)物，二者關(guān)系密切。通過對14例痰瘀證患者進行SEL DITOFMS及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測，獲得血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，檢測出18種差異表達蛋白，其中m/z為5911的血清多肽蛋白濃度為14.48， 而正常對照組為30.90，痰瘀證患者明顯降低，兩者之間的P值為0.0003;m/z為3163的血清多肽蛋白濃度為4.23，而正常

12、對照組為10.41，痰瘀證患者明顯降低，兩者之間的P值為0.00002。另一方面，m/z為6635 的血清多肽蛋白的濃度為26.64，而正常對照組為20.60，痰瘀證患者明顯增高，兩者之間的P值為0.008。此三種血清多肽蛋白可能為痰瘀證患者蛋白質(zhì)指紋圖譜主要表現(xiàn)特征，提示痰瘀證與正常健康人之間在血清蛋白質(zhì)水平上存在差異，從實驗客觀指標上顯示痰瘀證的發(fā)病機制及本質(zhì)差異?！緟⒖嘉墨I】1張雪群，姜穎，厲有名，等.蛋白質(zhì)組學技術(shù)在非酒精性脂肪肝研究中的應(yīng)用J.中華肝臟病雜志，2006，14(10)：798800.2李悅國，張維銘.蛋白質(zhì)組學在肝癌及其相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用J.中國腫瘤臨床，2005，3

13、2：957960.                     考試寶典-高分練兵場                揭秘論文“低價”根源