蛋白質(zhì)與酶工程復(fù)習(xí)題 金

1、名詞解釋1.生物酶工程又稱高級酶工程它是酶學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù) 相結(jié)合的產(chǎn)物。2.蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程就是運用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和分子遺傳 學(xué)知識,從改變或合成基因入手,定向地改造天然蛋白質(zhì)或設(shè) 計制造新的蛋白質(zhì)。3. 多核糖體把細胞放在極其溫和的條件下處理, 就能得到幾個到 幾十個核糖體在一條 mRNA 上結(jié)合起來的形態(tài)4. 固定化酶水溶性酶經(jīng)物理或化學(xué)方法處理后, 成為不溶于水的 但仍具有酶活性的一種酶的衍生物。在催化反應(yīng)中以固相狀態(tài) 作用于底物5. 酶反應(yīng)器以酶或固定化酶為催化劑進行酶促反應(yīng)的裝置。6.酶工程又叫酶技術(shù),是酶制劑的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)7. 生物傳感器對生物物質(zhì)敏感并將其濃

2、度轉(zhuǎn)換為電信號進行檢 測的儀器。8. motif (模體 指的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中介于二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié) 構(gòu)之間的一個結(jié)構(gòu)層次,又稱超二級結(jié)構(gòu)9. domain功能域 生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)和獨立功能的區(qū) 域 , 特別指蛋白質(zhì)中這樣的區(qū)域10.PDB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank,PDB是一個生物大 分子,11. DNA shuffling體外同源重組技術(shù)。 通過改變單個基因原有的 核苷酸序列創(chuàng)造新基因,并賦予產(chǎn)物以新功能。12. 生物催化劑是指生物反指應(yīng)過程中起催化作用的游離或固定 化細胞各游離或固定化酶的總稱13. 必需基團有的基團既在結(jié)合中起作用,又在催化中起作用, 所

3、以常將活性部位的功能基團統(tǒng)稱為必需基團 (essential group 14. 活性中心。 酶的活性中心是酶與底物結(jié)合并發(fā)揮其催化作用 的部位。15. 有性 PCR dna改組16.DNA 改組通過改變單個基因原有的核苷酸序列創(chuàng)造新基因, 并賦予產(chǎn)物以新功能。17. 免疫傳感器偶聯(lián)抗原 /抗體分子的生物敏感膜與信號轉(zhuǎn)換器 組成的,基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的一種生物傳感器。 18. 易錯 PCR 是從酶的單一基因出發(fā), 在改變反應(yīng)條件的情況下 進行聚合酶鏈反應(yīng),使擴增得到的基因出現(xiàn)堿基配對錯誤,從 而引起基因突變的技術(shù)過程。19. 酶化學(xué)修飾通過對酶蛋白分子的主鏈進行 “ 切割 ” 、 “

4、剪切 ” 以 及在側(cè)鏈上進行化學(xué)修飾來達到改造酶分子的目的。20. 抗體酶通過改變抗體中與抗原結(jié)合的微環(huán)境,并在適當(dāng)?shù)牟?位引入相應(yīng)的催化基團,所產(chǎn)生的具有催化活性的抗體。 二.簡答1. 細胞固定化方法有哪些細胞固定化:吸附法、包埋法。2. 酶的分子修飾方法主要有哪些金屬離子置換修飾、大分子結(jié)合修飾、側(cè)鏈基團修飾、肽鏈有 限水解修飾、核苷酸鏈剪切修飾、氨基置換修飾、核苷酸置換 修飾、物理修飾。3. 遺傳密碼的特點有哪些。1連續(xù)性 2不重疊性 3通用性 4簡并性 5有起始密碼子和終止 密碼子4. 酶的系統(tǒng)命名法根據(jù)酶所催化反應(yīng)的類型將酶分為哪些類 型。按照酶促反應(yīng)的性質(zhì),酶可為分 6大類,其排序

5、如下:(1氧化還原酶類:催化底物進行氧化還原反應(yīng)的酶類。(2轉(zhuǎn)移酶類:催化底物之間進行某些基團的轉(zhuǎn)移或交換的酶 類。(3水解酶類:催化底物發(fā)生水解的酶類。(4裂解酶類(或裂合酶類 :催化從底物移去一個基團并留 下雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)的酶類。(5異構(gòu)酶類:催化各種同分異構(gòu)體之間相互轉(zhuǎn)化的酶類。(6合成酶類:催化兩分子底物合成為一分子化合物,同時偶 聯(lián)有 A TP 的磷酸鍵斷裂釋能的酶類。5.分子伴娘有哪些特點?對靶蛋白不具有高度的專一性、催化效率很低、阻止肽鏈錯誤 折疊6.蛋白質(zhì)工程的類型有哪幾種? 從頭設(shè)計:完全按照人的意志設(shè)計合成蛋白質(zhì);定點突變與局 部修飾:在已有的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上,只進行局部

6、的修飾7.酶的生產(chǎn)方法有哪些?提取分離法、生物合成法、化學(xué)合成法8.圖示蛋白質(zhì)工程的基本程序。預(yù)期蛋白質(zhì)功能 設(shè)計預(yù)期蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) -推測應(yīng)有的氨基酸 序列 找到應(yīng)有的脫氧核苷酸序列(合成基因9.改造天然蛋白質(zhì)的必要性有哪些?生產(chǎn)發(fā)展的需要 (1人類飲食需要必需氨基酸含量高全的的蛋白 質(zhì)、 2預(yù)防疾病需要大量人體本身就有的酶,激素抗體,調(diào)節(jié)因 子、 3發(fā)酵工程需要耐熱, 耐酸堿高活性的酶制劑 4農(nóng)業(yè)需要高 蛋白抗蟲病,耐鹽堿耐干旱的新品種 5材料工業(yè)需要高貯存信 息能力高強度無污染的生物材料。 基礎(chǔ)研究(1、蛋白質(zhì)合成 機理, 蛋白質(zhì)折疊機理蛋白質(zhì)序列語言的語法研究 2、 生命起源 與蛋白質(zhì)分

7、子起源的進化,生物的壽命與蛋白質(zhì)代謝的研究 。 10. 酶的生物合成模式有哪些 ?酶生物合成的模式分為 4種類型。即同步合成型,延續(xù)合成型, 中期合成型和滯后合成型11. 分子伴娘的主要功能有哪些。主要功能:(1蛋白質(zhì)的生物合成:蛋白質(zhì) N 端在 C 端之前合 成,如果合成的速度比折疊速度慢, N 端在 C 端合成之前會與 其本身或其它分子發(fā)生相互作用,在分子伴娘的作用下,可避 免錯誤的快速折疊發(fā)生。 (2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運:新合成蛋白質(zhì) 出入各種細胞器的跨膜轉(zhuǎn)運,通常以非折疊狀態(tài)運輸,定位后 再折疊,在膜兩側(cè)必須有介導(dǎo)折疊和非折疊的分子伴娘協(xié)助。 (3 蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮:各種多聚體蛋白復(fù)合物正常功

8、能發(fā)揮, 涉及亞基與亞基的相互作用變化,亞基接觸區(qū)常會短暫暴露, 在分子伴娘幫助下才能形成正常功能的多聚體結(jié)構(gòu)。 (4細 胞器的發(fā)生:有些多肽由胞漿核糖體合成后再進入細胞器,再 與細胞器內(nèi)合成的其它多肽相互作用形成有活性的多聚體結(jié) 構(gòu)。新合成的蛋白亞基定位于某一細胞器之前,它們的結(jié)合傾 向必須依靠分子伴娘的調(diào)節(jié)。 (5應(yīng)激反應(yīng):環(huán)境的壓力常 導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性形成失活的不溶性凝聚物。分子伴娘在 動物細胞中防止凝聚物的出現(xiàn)或促進凝聚物解離12. 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測定目前主要有哪兩種物理的方法 .x 射線衍射、二維核磁共振13. 易錯 PCR 的基本原理。通過改變 pcr 的條件,通常降低一種

9、DNTP 的量 (降至 5%-10%使 PCR 易于出錯,達到隨機突變的目的。14. 交錯延伸的主要原理。在 PCR 反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,并大大縮短其 反應(yīng)時間(55C , 5S 從而只能合成出非常短的新生鏈,經(jīng)變性 的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù) 延伸。此過程反復(fù)進行,直到產(chǎn)生完整的基因長度,結(jié)果產(chǎn)生 間隔的含不同模板序列的新生 DNA 分子。15. 抗體的人源化的主要原理由于抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)(v 同種 性免疫原性決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)(c 如果在基因水平上把 鼠源性的單克隆抗體的重鏈(h 和輕鏈(L 可變區(qū)分離出來, 分別與

10、人 Ig 的重鏈和輕鏈的穩(wěn)定區(qū)(C 基因連接成人 鼠 嵌合體的和鏈基因,再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞,就能表達出人 鼠的嵌合抗體16. 酶合成的調(diào)節(jié)機制1、酶合成的誘導(dǎo) 2、末端產(chǎn)物的阻遏 3、分解代謝物阻遏 17. 酶的必需基團與酶的活性中心的關(guān)系。酶的活性部位的集團都是必需基團,必需基團還包括活性基團 以外的對維持空間構(gòu)象必需的基團。18. 結(jié)合所學(xué)知識, 談?wù)劦鞍踪|(zhì)工程與酶工程之間的區(qū)別與聯(lián)系。 酶工程是用工程菌生產(chǎn)酶制劑,而沒有經(jīng)過由酶的功能來設(shè)計 酶的分子結(jié)構(gòu),然后由酶的分子結(jié)構(gòu)來確定相應(yīng)基因的堿基序 列等步驟。因此,酶工程的重點在于對已存酶的合理充分利用, 而蛋白質(zhì)工程的重點則在于對已存在的

11、蛋白質(zhì)分子的改造。當(dāng) 然,隨著蛋白質(zhì)工程的發(fā)展,其成果也會應(yīng)用到酶工程中,使 酶工程成為蛋白質(zhì)工程的一部分。19. 酶分子內(nèi)部修飾有哪些方法?1、非催化活性基團的修飾 2、酶蛋白主鏈修飾 3、催化活性基 團的修飾 4、肽鏈伸展后的修飾20. 蛋白質(zhì)折疊假說Anfinsen 的 “ 自組裝熱力學(xué)假說 ” 多肽鏈的氨基酸序列包含了形 成其熱力學(xué)上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必需的全部信息 ” 的 “ 自組裝學(xué) 說, Ellis 于 1987年提出了蛋白質(zhì)折疊的 “ 輔助性組裝學(xué)說 21. 酶的特點有哪些高效性:催化效率比無機催化劑高許多。專一性:每種酶只能催化一種或一類化合物的化學(xué)反應(yīng)。 酶需要適宜的溫度和

12、pH值等條件:在最適宜的溫度和 pH 下, 酶的活性最高。 溫度和 pH 偏高和偏低,酶的活性都會明顯降低。原因是過酸、過堿和高 溫,都能使酶分子結(jié)構(gòu)遭到破壞而失去活性。22. 蛋白質(zhì)的定向進化的概念及其特點屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計,它不需要事先理解酶的空間結(jié)構(gòu)與 催化機制,認為的創(chuàng)造特殊的進化條件,模擬自然進化機制在 體外改造酶基因并定向選擇出所需性質(zhì)的酶。特點:23. 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有哪些類型?主要有 -螺旋、 -折疊、 -轉(zhuǎn)角等幾種形式 , 它們是構(gòu)成蛋 白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的基本要素24. 酶反應(yīng)器有哪些類型 ? 并簡要說明他們的特點 .酶反應(yīng)器主要有 1、攪拌罐型反應(yīng)器(結(jié)構(gòu)簡單、操作容易、傳

13、 質(zhì)阻力較小、反應(yīng)條件容易控制 2、填充床式反應(yīng)器(設(shè)備簡 單、操作方便、單位體積反應(yīng)床的固定化酶密度大可以提高速 度 3、流化床型反應(yīng)器(混合均勻、傳質(zhì)傳熱效果好、溫度和 PH 控制容易、不易堵塞、對粘度較大的反應(yīng)液也可進行催化反 應(yīng) 4、膜式反應(yīng)器(又分平板式、螺旋式、轉(zhuǎn)盤式、空心酶管 式和中空纖維膜式反應(yīng)器特點是集反應(yīng)與分離于一體利于連續(xù) 化生產(chǎn),但清洗比較困難,酶可以循環(huán)使用,降低了產(chǎn)物對酶 的抑制作用 。 5、鼓泡式酶反應(yīng)器(結(jié)構(gòu)簡單,操作容易,剪 切力小,物質(zhì)與熱的傳遞效率高 6、噴射式酶反應(yīng)器(結(jié)構(gòu)簡 單,體積小混合均勻催化反應(yīng)速度快,效率高25. 何為固定化酶 , 簡要說明固定

14、化酶的基本方法 ?水溶性酶經(jīng)物理或化學(xué)方法處理后,成為不溶于水的但仍具有 酶活性的一種酶的衍生物。在催化反應(yīng)中以固相狀態(tài)作用于底 物。大致可分為載體結(jié)合法載體結(jié)合法 (將酶結(jié)合到非水溶 性的載體上 、交聯(lián)法(利用雙官能團或多官能團試劑與酶之間 發(fā)生分子交聯(lián)來把酶固定化的方法和包埋法(將酶包裹于凝 膠網(wǎng)格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化 。26. 結(jié)合所學(xué)知識談?wù)劽改壳霸诟鱾€行業(yè)中的應(yīng)用 .1、醫(yī)學(xué)上(削血栓、人工腎、疾病診斷,治療預(yù)防疾病 2、 食品方面(食品保鮮、食品生產(chǎn)、食品添加劑、改善食品的品 質(zhì)與風(fēng)味 3、輕工業(yè)化工方面(原料處理,用酶處理原料可以 縮短原料處理的時間,增加處理效果,提

15、高產(chǎn)量,改善勞動條 件,減輕勞動強度。利用酶的催化作用可以將各種原料轉(zhuǎn)變?yōu)?所需的輕工化工產(chǎn)品,也可除去某些不需要的物質(zhì)而得到所需 的產(chǎn)品,在某些輕工業(yè)產(chǎn)品中添加一定量的酶,可以顯著地增 強產(chǎn)品的使用效果 4、環(huán)境保護方面(環(huán)境監(jiān)測,利用酶的催 化作用合成可生物降解的材料, 5、生物技術(shù)方面的應(yīng)用(酶 可用于除去細胞壁,大分子切割分子拼接27. 何為生物傳感器 , 并簡要說明各種傳感器的特點. 傳感器 (biosensor對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號進 行檢測的儀器。特點采用固定化生物活性物質(zhì)作催化劑,價值昂貴的試劑可 以重復(fù)多次使用,克服了過去酶法分析試劑費用高和化學(xué)分析 繁瑣復(fù)雜的

16、缺點。專一性強,只對特定的底物起反應(yīng),而且不受顏色、濁 度的影響。分析速度快,可以在一分鐘得到結(jié)果。準確度高,一般相對誤差可以達到 1%操作系統(tǒng)比較簡單,容易實現(xiàn)自動分析成本低,在連續(xù)使用時,每例測定僅需要幾分錢人民幣。 有的生物傳感器能夠可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供 氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在產(chǎn)控制中能得到許多復(fù)雜的物理化 學(xué)傳感器綜合作用才能獲得的信息。同時它們還指明了增加產(chǎn) 物得率的方向28. 酶分離純化的基本方法有哪些 ?沉淀分離、離心分離、過濾與膜分離、層析分離、電泳分離、 萃取分離、濃縮干燥結(jié)晶 29. 固定化酶與游離酶相比 , 性質(zhì)發(fā)生了哪些變化 ?(1易將固定化酶和底物,產(chǎn)物分

17、開產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留 簡化了提純工藝 (2可以在較長的時間內(nèi)連續(xù)使用 (3反 應(yīng)過程可以嚴格控制,有利于工藝自動化 (4提高了酶的穩(wěn) 定性 (5 較能適于多酶反應(yīng) (6 酶的使用效率高 產(chǎn)率高 成 本低30蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測有哪些方法 ?1、 Chou 和 Fasman 方法是一種基于氨基酸殘基統(tǒng)計的經(jīng)驗參數(shù) 方法, 2、 FDOD , 3、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法 4、支持向量機方法。第一階 段是以單殘基,單一序列的分析為重點 Chou 和 Fasman 方法, 第二階段考慮局部殘基的相互影響, Levin er al方法,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 法。第三階段在已有的方法上進一步提出了結(jié)合多重序列比對 的思路,

18、PHD 方法 ,Jnet 方法蛋白質(zhì)與酶工程重點1. 蛋白質(zhì)工程:以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的知識為基礎(chǔ), 通過周 密的分子設(shè)計,把蛋白質(zhì)改造為合乎人類需要的新的突變蛋白 質(zhì)。2. 酶工程:從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶, 就是在一定的生物反應(yīng)裝 置中利用酶的催化性質(zhì),將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成有用的物質(zhì)的技 術(shù),是生物工程的重要組成部分。3. 酶工程根據(jù)酶工程研究方法分為:1化學(xué)酶工程:通過對酶 的化學(xué)修飾或固定化處理,改善酶的性質(zhì)以提高酶的效率和降 低成本,甚至通過化學(xué)合成制造人工酶; 2生物酶工程:用基 因重組技術(shù)生產(chǎn)酶,以及對酶基因進行修飾或設(shè)計新基因,從 而生成能穩(wěn)定,具有新的生物活性劑催化效率更高的酶

19、。 4. 蛋白質(zhì)的融合:將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因重組到另一種蛋 白質(zhì)基因上,或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起,經(jīng)基因 克隆和表達產(chǎn)生新的融合蛋白。5. 蛋白質(zhì)的融合的作用:1用于表達產(chǎn)物的分離純化; 2提高 表達產(chǎn)物的溶解度; 3提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。6. 蛋白質(zhì)晶體學(xué):利用 X 射線衍射技術(shù), 進行生物大分子結(jié)構(gòu)研 究的工程,是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的一個重要組成部分。7. 生物大分子運動性的功能及意義:1 打開一個瞬時的通道; 2 識別和調(diào)節(jié)(通過運動識別底物 ; 3催化; 4信息傳遞。 8. 定點突變:通過分子克隆手段定點的改變特定基因的局部核苷 酸序列,通常被用來研究蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)以及用于目的蛋

20、白 的改造。9. 盒式突變:又稱片段取代法, 利用目標基因序列中適當(dāng)?shù)南拗?酶切位點,插入各種的突變 DNA 片段,用以取代目標基因中特 定的 DNA 片段。10. 酶工程的研究范圍:1各類自然酶的開發(fā)和生產(chǎn);2酶的分離純化和鑒定技術(shù);3固定化技術(shù);4利用其他的生物技術(shù)領(lǐng)域交叉滲透;5多酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用。11. 酶的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化:(一引起酶失活的原因:1酶的活性中心一些特定氨基酸殘基被化學(xué)修飾,使酶活性喪 失(微觀 ;2外部環(huán)境的影響,酶活性中心出現(xiàn)空間障礙,使其不能與底 物結(jié)合;3酶的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(螺旋、折疊發(fā)生變化 ;4多肽鏈的斷裂(很強烈 ;(二酶的穩(wěn)定化:1低溫保存(酶的本身

21、不易變性,不易使其他酶把目的蛋白降 解 ;2添加鹽類(高濃度 (NH42SO4 ;3添加底物輔酶等配體;4添加強變性劑(保護一級結(jié)構(gòu),使用時可復(fù)活 ;5結(jié)晶化。12. 微生物作為酶源的優(yōu)越性:1容易獲得酶需要的酶類;2容易獲得高產(chǎn)菌株;3生產(chǎn)周期短;4生產(chǎn)成本低;5生產(chǎn)易管理;6提高微生物產(chǎn)酶的途徑比較多。13. 固定化酶:指在一定空間呈封鎖狀態(tài)存在的酶,能連續(xù)地進 行反應(yīng),反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。14. 固定化酶的優(yōu)點:1極易將固定化酶與產(chǎn)物和底物分開;2可以在較長時間內(nèi)進行反復(fù)的分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng);3在大多數(shù)情況下能夠提高酶的穩(wěn)定性;4酶的反應(yīng)過程能加以嚴格控制;5產(chǎn)物溶液中沒有酶

22、的殘留,簡化了提純工藝;6較游離酶更適合于多酶反應(yīng);7可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物的質(zhì)量; 8酶的使用效率 提高、成本降低。15. 固定化酶的缺點:1固定化時酶活力有損失;2增加了生產(chǎn)的成本,工廠初始投資大;3只能用于可溶性底物,而且較適用于小分子底物;4與完整的菌體相比不適合多酶反應(yīng),特別是需要輔因子的反 應(yīng);5胞內(nèi)酶必須經(jīng)過的分離手續(xù)。16. 固定化酶的制備原則:1必須注意維持酶的催化活性和專一性;2固定化應(yīng)有利于生產(chǎn)的自動化和連續(xù)化;3固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻,盡可能不妨礙煤與底物的接 近,以提高產(chǎn)品產(chǎn)量;4酶與載體必須結(jié)合力牢固,使固定化酶能夠回收,儲藏利于 反復(fù)使用;5固定化酶應(yīng)有

23、最大的穩(wěn)定性,所選的載體不與廢物產(chǎn)物或反 應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng);6固定化酶成本要低,利于工業(yè)使用。17. 酶固定的方法:(一非共價結(jié)合法:1結(jié)晶法:適用于酶活性低的酶,結(jié)晶后濃度變化大,在不斷 的連續(xù)使用中沒有所損耗;2分解法:將酶制成干粉,將其分散于水中不溶相中,即使干 粉懸浮于溶劑上,優(yōu)點:回收較方便,缺點:干粉易吸水,顆 粒變大,活性降低,在有機溶劑中酶活力會受到影響;3 物理吸附法:酶被物理吸附于不溶性載體的一種方法; 優(yōu)點:酶活性中心不容易被破壞,高級結(jié)構(gòu)變化少,酶活力損失小, 也適用于固定化細胞;缺點:酶與載體相互作用弱,酶易脫落; 4通過離子鍵結(jié)合到水溶性載體上;優(yōu)點:操作簡單、條件

24、溫 和、高級結(jié)構(gòu)及活性中心不能被破壞,也適用于固定化細胞; 缺點:載體與酶的結(jié)合力較弱,陰陽離子或陽離子緩沖液,離 子濃度影響較大、酶較易從載體上脫落;(二化學(xué)結(jié)合法:1共價結(jié)合法:酶與載體共價結(jié)合;方法:將載體有關(guān)的基因 活化,然后與酶有關(guān)的基因發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng),在載體結(jié)合比較牢 固,一般不會固定底物濃度變化而改變;缺點:反應(yīng)條件較激 烈,往往會引起高級結(jié)構(gòu)的變化,破壞活性中心,只適用于酶 的固定化,不適用于細胞的固定化;2交聯(lián)法:就使用多功能試劑或者是雙功能試劑,使酶與酶或 微生物與微生物細胞之間交聯(lián)的固定化方法,一般會通過降低 交聯(lián)劑濃度及反應(yīng)時間保持酶活力;(三包埋法:1網(wǎng)格型:將酶或微生

25、物包埋在高分子凝膠的細微網(wǎng)格中,此 法是固定化微生物細胞用得較多的方法;優(yōu)點:不需要與酶蛋 白發(fā)生結(jié)合反應(yīng),酶活回收率較高;2 微膠囊型:把酶分子包在一個膠囊中, 高分子膜為半透型的, 此膠囊不滲透,可以在一些無水的有機相中存在。18. 固定化酶的性質(zhì):(一固定化后酶活力的變化:原因:1酶分子在固定化過程中空間構(gòu)象有所變化,甚至影響 活性中心的氨基酸;固定化后酶分子空間自由度受到限制,直接影響到活性中心對 底物的空位作用;內(nèi)擴散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻力;包埋時,酶被高分子半透膜包圍,大分子底物不能透過膜與酶 接近; 固定化對酶穩(wěn)定性的影響:熱穩(wěn)定性提高;2對各種有機試劑及酶試劑穩(wěn)定

26、性提高;3對不同 pH 值的穩(wěn)定性,對蛋白酶的穩(wěn)定性,貯存穩(wěn)定性和 操作穩(wěn)定性都有影響;4 固定化酶穩(wěn)定性提高的原因:固定化酶與載體可以多點連接, 可以防止蛋白酶分子伸展變形;固定化后酶的活力可以緩解釋 放;可以抑制酶的自降解;(三最適溫度變化 -升高;(四最適 pH 值變化:范圍擴寬;(五 Km (米氏常數(shù)的變化的變化 -變小,親和力提高 。 19. 固定化方法:1將輔酶和酶共同的固定在同一個載體上,可得到一個永久性 不需外加輔酶的體系;2將輔酶直接固定在酶分子上。20. 細胞固定化:被限制自由移動的細胞,即細胞受到物理、化 學(xué)等因素的約束或限制在一定的空間界限內(nèi),但細胞仍保留催 化活性,并

27、且有能被反復(fù)連續(xù)使用的活力。1. 細胞固定化的優(yōu)缺點:優(yōu)點:1 固定化細胞保持了細胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)和天然環(huán)境, 因而更穩(wěn)定;保持胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng),對于多步催化優(yōu)勢更加明顯,不需 要輔酶再生;對固定化增殖細胞發(fā)酵更具明顯優(yōu)勢;固定化細胞密度大,可 增殖,縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期;發(fā)酵穩(wěn)定性好,可較長時間的反復(fù) 連續(xù)使用;發(fā)酵液中含的菌體較少有利于產(chǎn)品分離純化,提高 產(chǎn)品質(zhì)量;缺點:1細胞內(nèi)多種酶的存在,會形成不需要的副產(chǎn)物; 細胞膜、細胞壁,還有載體的存在都會形成一種擴散限制的作 用;3載體形成的孔隙大小影響到高分子底物的通透性。2. 化學(xué)修飾:凡是通過化學(xué)基因的列入或除去而使蛋白質(zhì)的共價 結(jié)構(gòu)發(fā)生

28、改變,我們把這種現(xiàn)象稱為化學(xué)修飾。3. 蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性影響因素:1 微區(qū)的極性:2 氫鍵效應(yīng);3靜電效應(yīng); 4位阻效應(yīng)。4. 酶蛋白功能級的超反應(yīng)性:指蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基因與個別試 劑能發(fā)生迅速反應(yīng)。5. 影響超反應(yīng)性的因素:1改變蛋白質(zhì)功能的 pK 值; 2蛋白 質(zhì)功能基具有較大的反應(yīng)性; 3通過靜電相互作用來吸引試劑 并使其具有適當(dāng)?shù)娜∠? 4試劑與靠近修飾部位的蛋白區(qū)域之 間的立體化學(xué)適應(yīng)性。6. 修飾劑反應(yīng)性的決定因素:1選擇吸附; 2靜電相互作用; 3位阻因素; 4催化因素:5微區(qū)極性(局部環(huán)境的極性 。 7. 修飾反應(yīng)專一性的控制:(一試劑的選擇:1對氨基酸的修飾有幾種情況:a

29、. 修飾所有的氨基而不修飾其他基因;b. 反修飾 氨基;c. 修飾具有催化活性的氨基; d. 改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)和溶解性, 改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)要選擇能夠在中性條件下帶最大電荷量 的試劑,改變蛋白質(zhì)的溶解性反應(yīng)在水中進行,選擇化學(xué)試劑 為能溶于水的; 3反應(yīng)產(chǎn)物的定量測定; 4考慮試劑的大小:選擇試劑體積小一些,便于修飾,不致使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生較 大變化;反應(yīng)條件的選擇:反應(yīng)條件不會造成蛋白質(zhì)的不可逆變性;反應(yīng)條件選擇有利于專一性修飾蛋白質(zhì);(三 反應(yīng)的專一性:1 可以利用蛋白質(zhì)中某些基因的特殊性; 2選擇不同反應(yīng) pH 值; 3利用某些產(chǎn)物不穩(wěn)定性; 4親和 標記; 5差別標記:在體系中有

30、酶分子、底物、抑制劑存在時; 6利用蛋白狀態(tài)的差異。8. 親和試劑:也稱作為位點專一性抑制劑, 試劑作用于被作用位 點的某一基因,而不與被作用部位以外的其他基因發(fā)生作用, 這類修飾劑叫做親和試劑。9. 親和標記:親和試劑一般都具有與底物相類似的結(jié)構(gòu), 對酶的 活性部位具有高度的親和性,能對活性部位的氨基酸殘基進行 共價標記,把這一類專一性的化學(xué)修飾成為親和標記,也稱專一性不可逆抑制。10. 固定化酶:在一定空間上,呈閉合狀態(tài),可發(fā)生連續(xù)作用, 最后回收再利用。11. 固定化是如何通過下列三種效應(yīng)影響酶的穩(wěn)定性:1產(chǎn)生空 間障礙; 2產(chǎn)生擴散限制; 3多點共價連接。12. 穩(wěn)定化的方法:(一固定

31、化(化學(xué)結(jié)合、包埋法等 :1產(chǎn)生空間障礙:抑 制化學(xué)失活; 2產(chǎn)生擴散限制:把酶包埋在多孔顆粒內(nèi)部,底 物先接觸多孔顆粒表面,再擴散到內(nèi)部與酶作用,不受底物濃 度控制; 3多點共價連接:將酶多點共價連接到載體表面,或 用雙功能試劑交聯(lián)酶,或降酶包埋在載體緊密的孔中,可以使 酶構(gòu)象更加牢固,從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過度。 13. 核酶:是描述具有催化活性的 RNA ,其化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸 具有酶的催化功能,底物可以是不同分子,也可以是同一 RNA 分子中的某些部位。14. 天然核酶:(一剪切型核酶 (催化自身和異體 RNA 的切割, 核酸內(nèi)切酶 :1 錘頭型核酶; 2 發(fā)卡型核酶; 3 蛋

32、白質(zhì) RNA 復(fù)合酶; (二剪接型核酶:包括組 內(nèi)含子和組 內(nèi)含子;實 現(xiàn) RNA 的自我剪接;具有核酸內(nèi)切酶和連接酶的活性。15. 體外選擇:從順序隨機的 RNA 或 DNA 分子構(gòu)建的大容量隨 機分子庫出發(fā),在其中篩選得到極少數(shù)具有特異功能的分子。 16. 適體:能與有機物或蛋白質(zhì)等配體專一高效結(jié)合的 RNA 或 DNA 片段分別稱 RNA 適體或 DNA 適體。17. 篩選適體的方案:1化學(xué)合成 DNA 分子庫,在分子鏈上的 某一位置引入完全隨機或部分突變的順序,分子的兩端是固定 的順序,以便 PCR 擴增; 2經(jīng)過幾輪 PCR 擴增后,體外轉(zhuǎn)錄 形成一個具有隨機順序的 RNA 庫; 3

33、 將這些 RNA 分子通過結(jié) 合有靶分子的親和層析柱, 根據(jù) RNA 與靶分子的結(jié)合能力大小 將其區(qū)分開來,結(jié)合力強的 RNA 分子被最后洗脫下來; 4洗 脫下來的 RNA 分子經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、 PCR 擴增、轉(zhuǎn)錄,在進入下一 次篩選循環(huán),經(jīng)過 510個循環(huán)后,獲得庫中富集了與靶分子親 和力高的 RNA 分子。18. 核酶的篩選過程:1 通過轉(zhuǎn)錄隨機序列的 RNA 構(gòu)建一個 DNA 隨機庫; 2隨機庫中具有催化活性分子可以催化底物與進行共 價連接; 3將反應(yīng)產(chǎn)物通過固定在底物 RNA 的 5 端順序互補 配對的寡核苷酸親和柱,選擇性的吸附隨機庫中那些可以催化 連接反應(yīng)的 RNA 分子; 4經(jīng)過高鹽

34、洗脫:逆轉(zhuǎn)錄、 PCR 擴增、 轉(zhuǎn)錄、 進入下一輪篩選; 5 在接下來的篩選循環(huán)中, 用易錯 PCR 以一定頻率向有活性的分子中引入突變,增加了篩選得到的隨 機庫的分子多選擇性; 6經(jīng)過多輪篩選,有催化活性的 RNA 分子富集起來,而活性比較低的分子被淘汰。19. 脫氧核酶:利用體外分子進化技術(shù)合成的一種具有催化功能 的單鏈 DNA 片段具有高效催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力。1. 體外選擇方法:1 不需要轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄, 人工合成 DNA 分子, 直接進行 PCR 擴增; 2獲得單鏈 DNA 分子:PCR 擴增在引物 上連接一個生物素,將 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過生物素蛋白的親和柱來實 現(xiàn)正負鏈的分離; 3引

35、入二價的金屬離子作為輔助因子; 4 針對這些脫氧核酶,將一些額外功能團引入到 DNA 當(dāng)中,來增 加結(jié)構(gòu)和功能的親和性。2. 脫氧核酶的分類:(切割 RNA 的脫氧核酶 (切割 DNA 的脫 氧核酶 (具有激酶活力的脫氧核酶 (連接酶功能的脫氧核苷 酶 (催化卟啉環(huán)金屬螯合反應(yīng)3. 反義核酸:DNA 或 RNA 分子與 mRNA 分子結(jié)合,形成空間 位阻,使其不能與核糖體結(jié)合,進而翻譯成蛋白質(zhì)另外也能降 解 mRNA 。4. 酶分子的合理性設(shè)計:利用各種生物化學(xué)、晶體學(xué)、光譜學(xué)等 方法對天然酶或其實突變性進行研究,獲得酶分子特征?？臻g 結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系,以及氨基酸殘基等方面的信息, 然

36、后以此為依據(jù)對酶進行改造。5. 酶分子的非合理性設(shè)計:不需要準確的酶分子結(jié)構(gòu)信息, 而通 過隨機突變、基因重組、空白篩選等方法對其進行改造,定向 選擇出所需要性質(zhì)的突變酶。6. 酶分子定向進化:即酶分子的發(fā)展方向; 是從一個或多個存在 的親本酶(天然的或人為獲得的出發(fā),經(jīng)過基因的突變或重 組,構(gòu)建一個人工突變酶庫,通過篩選最終獲得領(lǐng)先期望的具 有某些特性的進化酶。定向進化 =隨機突變 +正向重組 +選擇(或 篩選 。 7. 易錯 PCR :在采用 Taq 酶進行 PCR 擴增目的基因時,通過調(diào) 整反應(yīng)條件,例如提高 Mg2+濃度,加入 Mn 離子,改變體系中 dNTP 的濃度等,改變 Taq

37、酶的突變頻率,從而向目的基因中以 一定的頻率隨機引入突變構(gòu)建突變庫,然后選擇或篩選需要的 突變體。8. 連續(xù)易錯 PCR :將一次 PCR 擴增得到的有用突變基因,作為 下一次 PCR 擴增模板,連續(xù)反復(fù)地進行隨機誘變,使每一次后 的的小突變累積而產(chǎn)生重要的有意突變。9.DNA 改組:將已經(jīng)獲得的存在于不同基因中的正突變結(jié)合在一起,形成新的突變基因庫,又稱有性 PCR 。10.DNA 改組的操作:從正突變基因庫中分離出來的 DNA 片段 用脫氧核糖核酸酶 隨機切割得到的隨機片段, 經(jīng)過不加引物的 多次 PCR 循環(huán), 在 PCR 循環(huán)過程中, 隨機片段之間互為模板和 引物進行擴增,直到獲得全長的基因,這導(dǎo)致來自不同基因片 段之間的重組,將親本中的有意突變進行重新組合。11. 交錯延伸法:在 PCR 反應(yīng)中,把常規(guī)的退火和延伸合并為一 步,并大大縮短其反應(yīng)時間,從而只能合成出非常短的新生鏈, 經(jīng)變性的新生鏈再作為引物,與體系內(nèi)同時存在的不同模板退 火,而繼續(xù)延伸。此過程反復(fù)進行,直到產(chǎn)生完整長度的基因 片段