口服型聚丙交酯胰島素微囊的初步研究

1、口服型聚丙交酯胰島素微囊的初步研究摘要：目的：為保護(hù)胰島素口服后不被腸道酶分解，用聚丙交酯包裹胰島素制成口服型微囊（PLA-MCI），對(duì)其活性進(jìn)行初步研究。方法：PLA -MCI體外釋藥胰島素測(cè)定用福林-酚法。體內(nèi)活性通過(guò)糖尿病大鼠口服后血糖變化反映。結(jié)果：體外釋藥實(shí)驗(yàn)顯示PLA-MCI自30min開始釋藥，610h已釋放6 5%80%，持續(xù)釋藥達(dá)108h。將釋藥后的上清液注入糖尿病兔，其中的胰島素仍保持降血糖的生物活性。34只非空腹糖尿病大鼠口服PLA-MCI （含胰島素2.5mg），平均血糖下降(5721)%，峰時(shí)為712h，持續(xù)作用(84)h，血糖下降幅度與劑量正相關(guān)。結(jié)論：PLA-MC

2、I 保持了胰島素生物活性，具有新的藥理作用模式。關(guān)鍵詞：口服型胰島素；聚丙交酯；微囊化胰島素A tentative study of the insulin-loaded polylactide microspheresMa Xueyi (Ma XY)(Department of Endocrinology, Beijing 304 Hospital of PLA, Beijing 100037)Pan Guomin (Pan GM)(Department of Endocrinology, Beijing 304 Hospital of PLA, Beijing 100037)L Ze (L

3、u Z)(Department of Endocrinology, Beijing 304 Hospital of PLA, Beijing 100037)ABSTRACT：OBJECTIVE：In order to protect insulin from degradat ion in gastrointestinal tract by proteolytic enzyme, polylactide was used to en capsulate the insulin. The insulin release profile from microspheres in vitro and

4、 characteristics after oral administration in vivo were studied.METHODS：Insulin entrapped in polylactide microcapsulated insulin (PLA-MCI) was determined by Follin-phenol method by UV spectrophotometer.The hypo glycemic effects were determined by periodically assaying blood glucose levels in diabeti

5、c rats.RESULTS：In vitro insulin began to release from PLA-MCI since 30 min in 10 mmol.L-1 PBS buffer (pH 7.4) ,it released for 65%80% after 610 hours. The above buffer contained released insulin was injected into diabetic rabbits.It showed similar hypoglycemic profile to insulin.34 unfasting diabeti

6、c rats were gavaged by PLA-MCI (contained insulin 2.5mg).Their peripheral blood glucose decreased to (-57-21)% of control levers for (84)h.The peak action was in 712 hours after oral administration.The hy poglycemic effects were positively related to the doses of PLA-MCI.CONCLUSION：PLA-MCI kept the

7、hypoglycemic effects of native insulin but showed a new pharmacologic model.KER WORD：insulin，polylactide acid，microcapsulated insulin胰島素是很多糖尿病人須終生注射的藥物，但每日多次皮下注射給病人帶來(lái)很大的痛苦與不便。近年來(lái)人們對(duì)新的胰島素給藥途徑進(jìn)行了多種嘗試：直腸、鼻粘膜、眼、肺泡膜給藥，透皮給藥及口服給藥等。其中以口服最理想，口服后門靜脈內(nèi)胰島素濃度較高，符合生理狀態(tài)下胰島素分泌模式。但胰島素直接口服可在腸道被蛋白酶迅速降解，變性失活。很多研究采用如脂質(zhì)體、

8、高分子化合物作為載體幫助胰島素經(jīng)腸道吸收入血已獲得程度不等的降血糖效果12。我們采用了可在體內(nèi)降解并完全代謝的生物相容性高分子聚合物聚丙交酯研制了胰島素口服型微囊，進(jìn)行了體內(nèi)外的初步研究，結(jié)果如下。1材料和方法1.1聚丙交酯胰島素微囊（PLA-MCI）的制作和特點(diǎn)1.1.1材料聚丙交酯(中國(guó)科學(xué)院化學(xué)所合成3)；胰島素粉劑(Sigma公司)；Span 80(中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站)；二氯甲烷(北京化工廠 )。1.1.2方法將胰島素10 mg溶于10 mmol.L-1 NaO H（pH10）0.5 ml中，加入聚丙交酯（PLA，相對(duì)分子質(zhì)量10000）250 mg，乳化劑Span80（0 .

9、05% 5ml）及二氯甲烷5 ml的混合物中，超聲震蕩（50 W）下形成PLA/胰島素微粒乳液（W/ O），再倒入快速攪拌（2000 r.min-1）中的1%明膠液（含0.05% Span80）100ml中，形成了包裹PLA的胰島素微囊（W/O/W）。經(jīng)離心、漂洗、冷凍干燥制成PLA-MCI干粉。其中胰島素含量為0.040.11 mg PLA。1.1.3PLA-MCI的物理特點(diǎn)用掃描電鏡（日立5530型，日本）觀察，PLA-MCI呈中空的小球形，表面光滑完整平均直徑25 m,壁厚300400 nm（ 1）。1掃描電鏡下觀察單個(gè)PLA-MCI的形態(tài)(16000) 1.2PLA-MCI體外釋藥實(shí)驗(yàn)

10、根據(jù)蛋白質(zhì)中含苯環(huán)氨基酸能與Folin-酚絡(luò)合生成藍(lán)色化合物的原理，用分光光度計(jì)可測(cè)定蛋白質(zhì)含量。而PLA-MCI中只有胰島素分子含苯環(huán)氨基酸，故采用Folin-酚法研究PLA- MCI的體外釋藥。以751G型分光光度儀（上海分析儀器廠）在波長(zhǎng)500 nm測(cè)定。本方法敏感度為1 u/ml。在(371)時(shí)PLA-MCI 在10 mmol.L-1，pH7.4磷酸鹽緩沖液環(huán)境中，測(cè)定不同時(shí)間內(nèi)胰島素含量，觀察其體外釋藥情況。1.3動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)全部實(shí)驗(yàn)均采用四氧嘧啶糖尿病大鼠及兔（四氧嘧啶購(gòu)自Sigma，大鼠及兔分別給以150，18 0mg.kg-1，ip.）血糖?16.7 mmol.L-1至少3 d

11、。血糖測(cè)定采用快速血糖測(cè)定儀（One touch II，美國(guó)）。1.3.1消化道不同部位胰島素直接給藥實(shí)驗(yàn)為觀察胰島素分子是否可通過(guò)消化道粘膜吸收，將大鼠麻醉后開腹直視下直接將胰島素溶液注入消化道不同部位，觀察血糖變化。四氧嘧啶糖尿病大鼠17只，非空腹?fàn)顟B(tài)下以2%戊巴比妥鈉36 mg.kg -1 ip，頸靜脈預(yù)先留置肝素化導(dǎo)管以備抽血。分別經(jīng)管飼口服（n=7，不開腹），注入回腸（n=5），升結(jié)腸內(nèi)（n=4）胰島素混懸液2ml（含胰島素2.5mg溶于2%膽酸鈉2ml，pH7 .8），并以向回腸內(nèi)注入等量的生理鹽水作為開腹手術(shù)(對(duì)照1,n=2)，分別于給藥前，給藥后10，30 min及以后每小時(shí)測(cè)

12、頸靜脈血血糖，直至血糖自然恢復(fù)至給藥前水平，每次抽血后立即從導(dǎo)管內(nèi)補(bǔ)入等量生理鹽水。當(dāng)血糖2.0 mmol.L-1時(shí)立即iv給予25% GS 5 ml。為排除多次測(cè)血糖對(duì)大鼠正常進(jìn)食的影響，我們還對(duì)6只糖尿病大鼠（對(duì)照2）進(jìn)行了同期無(wú)麻醉不開腹不給藥的饑餓實(shí)驗(yàn)（可飲水），同上法觀察血糖變化。1.3.2PLA-MCI中胰島素活性測(cè)定為了解微囊制備過(guò)程是否會(huì)破壞胰島素活性，在室溫下將PLA-MCI溶于水中自然釋藥24 h，離心，取上清液用Folin -酚法測(cè)定胰島素含量，給4只糖尿病兔im該上清液觀察血糖變化，并以含等量胰島素（上海生物制藥廠）藥液給2只糖尿病兔肌注，比較胰島素活性的變化。1.3.

13、3口服PLA-MCI的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)34只糖尿病大鼠非空腹、無(wú)麻醉于清晨管飼PLA-MCI 混懸液23 ml（其中含胰島素2.5mg)。于服藥前、服藥后30 min、每小時(shí)至18 h測(cè)尾靜脈血血糖，直至血糖恢復(fù)至對(duì)照水平。如18 h血糖仍未升高至對(duì)照水平，則每24 h測(cè)血糖直至48 h。當(dāng)血糖2.0 mmol.L-1ip 給以25% GS 5m l。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物可自由進(jìn)食、水。2結(jié)果2.1PLA-MCI體外釋藥實(shí)驗(yàn)當(dāng)PLA微球直徑分別為1.52，25，1020 m時(shí)，藥物包裹率分別為82%，93%，44%，載藥率為10%。以下研究均采用直徑25 m微球。 37時(shí)直徑為25 m的PLA-MCI在

14、PBS （pH7.4）中30 min開始釋藥，610 h為釋藥高峰，36 h后達(dá)釋放平臺(tái)，持續(xù)釋放可達(dá) 108 h。該微囊在上述緩沖液中于2，6，8，10 h時(shí)胰島素已分別釋放出?38%，58%，65%，74%（2）。2PLA-MCI于(371)時(shí)，在10 mmol.L -1磷酸鹽緩沖液中15 h內(nèi)累積釋放胰島素的情況2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)2.2.1不同消化道部位直接注入胰島素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。以回腸部位胰島素注入后血糖下降率最明顯，并與經(jīng)口、結(jié)腸及2種對(duì)照實(shí)驗(yàn)的血糖變化相比呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異。提示胰島素分子可經(jīng)小腸壁直接吸收并保持其生物活性。由于口服后胰島素先進(jìn)入胃，胃的酸性環(huán)境及胃、十二指腸段含

15、有的高濃度消化酶可使胰島素變性失活，故直接口服基本不能降低血糖，口服后血糖的變化可能是經(jīng)小腸段吸收后引起的。2.2.2PLA-MCI中胰島素活性測(cè)定4只四氧嘧啶糖尿病兔im含 8u胰島素的PLA-MCI體外釋放上清液后，平均血糖下降(90.24.4)%（n=4），而注射含8u的藥用胰島素溶液的糖尿病兔平均血糖下降(81.09.9)%（n=2）（P0.05），且起效時(shí)間相似，高峰作用均在35 h。提示PLA-MCI制作過(guò)程未改變胰島素生物活性。2.3口服PLA-MCI的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)34只糖尿病大鼠口服PLA-MCI（含胰島素?2.5 mg）后23只（占68%）血糖下降(68.5? 11.7)%，7只

16、（占21%）血糖下降(39.76.6)%，還有4只（占12%）血糖下降(20.08.3)% 。全組34只大鼠平均最大血糖變化為(-57-21)%?？诜LA-MCI平均起效時(shí)間13 h ，峰作用時(shí)間在712 h，持續(xù)作用(84) h，最長(zhǎng)可達(dá)18 h。個(gè)別大鼠體內(nèi)還出現(xiàn)多個(gè)峰效應(yīng)，可能與胰島素不斷從微囊中釋放有關(guān)。為觀察口服不同劑量PLA-MCI對(duì)血糖的影響， 32只糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組，每組分別管飼含胰島素1.2，1.8，2.2，3 mg的PLA-MCI（實(shí)驗(yàn)中大鼠可自由進(jìn)食、水）。結(jié)果顯示平均血糖下降為(28.07.7)%，(36.017.0)%，(54 .014.0)%及(78.021

17、.2)%（每組n=8），PLA-MCI劑量與血糖的下降呈正相關(guān)。胰島素直接給藥對(duì)血糖的影響見表1。表1胰島素直接給藥對(duì)血糖的影響給藥部位例數(shù)/n血糖下降率/%口服742.224.6回腸585.017.41)結(jié)腸434.824.62)對(duì)照120對(duì)照2636.015.0注：對(duì)照1為向回腸內(nèi)注入2ml生理鹽水，對(duì)照2為同期饑餓實(shí)驗(yàn)；與口服比P0.0 2，與對(duì)照2比P0.001；2)與回腸內(nèi)注射比P0.05 3討論口服胰島素是目前多種給藥方法中最理想、最簡(jiǎn)便的。但胃及十二指腸內(nèi)的大量蛋白水解酶可迅速使胰島素變性失活，過(guò)去公認(rèn)胰島素口服是不能降低血糖的。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及很多其他研究者均發(fā)現(xiàn)胰島素分子是能透

18、過(guò)腸壁吸收入血的，小腸的吸收率最高，結(jié)腸與直腸也有較高的吸收率4，并已證實(shí)胰島素分子是通過(guò)小腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腸內(nèi)環(huán)境，再滲透入毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜并進(jìn)入血循環(huán)5。本研究證實(shí)經(jīng)PLA-MCI中釋出的胰島素仍保持其生物活性，等量的微囊中釋放的胰島素與藥用胰島素可在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生相似的藥理作用及幾乎相同的降血糖效果。但由于PLA-MCI的緩慢釋放，口服后作用模式發(fā)生變化，平均高峰作用時(shí)間在(712) h，持續(xù)作用時(shí)間(84) h，平均降血糖可達(dá)(5721 )%，并表現(xiàn)較大的個(gè)體差異。這可能與動(dòng)物未禁食，實(shí)驗(yàn)前體重、血糖及攝食、水情況不同有關(guān)。因?yàn)檫M(jìn)食與否及進(jìn)液體或固體食物的不同會(huì)引起不同的腸蠕動(dòng)波

19、及食物的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，空腹可能會(huì)使PLA-MCI轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收加快，降血糖效應(yīng)提前或增強(qiáng)，大量飲水可能有利于胰島素分子擴(kuò)散，此外血糖的高低可直接影響胃腸運(yùn)動(dòng)6。近年來(lái)，PLA用于臨床的縫合線，骨釘及皮下埋置的緩釋疫苗等的生物相容性高分子聚合物。其基本組成單位是乳酸，通過(guò)酯鍵聚合成相對(duì)分子質(zhì)量不等的聚合物。在酸、堿、微生物存在時(shí)互聯(lián)的酯鍵發(fā)生斷裂，最終降解為小分子乳酸。其降解速度非常緩慢，在體內(nèi)達(dá)數(shù)月之久，降解速率與分子量成反比。本研究中采用相對(duì)分子質(zhì)量10000的PLA制成直徑為25 m的中空微球，壁厚300 nm，表面光滑具半透膜特性。水進(jìn)入微囊后直徑30 nm的胰島素分子主要經(jīng)稀釋透過(guò)半透膜的微小

20、孔隙（100 nm）向外擴(kuò)散，從而保護(hù)胰島素避免在胃、十二指腸等含有大量消化酶的部位被降解7?？诜LA-MCI降糖高峰在712 h，正是其通過(guò)胃、十二指腸進(jìn)入小腸后的時(shí)間，較體外釋藥延遲12 h，可能與胰島素從微囊中釋放，透過(guò)腸壁進(jìn)入血循環(huán)再發(fā)揮降血糖效應(yīng)需要一段時(shí)間有關(guān)。其持續(xù)降血糖時(shí)間多短于18 h，顯著短于目前報(bào)告的其它高分子聚合物包囊的胰島素降血糖時(shí)間（620 d），且降血糖的幅度較大，有利于控制餐后的高血糖。關(guān)于PLA微球在體內(nèi)的代謝，我們測(cè)定了糖尿病兔口服PLA-MCI后每小時(shí)血乳酸值，觀察28 h，并未發(fā)現(xiàn)血乳酸水平的增高（2.51.2) mmol.L-1，提示PLA可能主要最

21、終隨糞便排出而不會(huì)進(jìn)入血液。這完全不同于目前報(bào)道的其它高分子聚合物毫微囊胰島素可進(jìn)入血液產(chǎn)生有毒的代謝終產(chǎn)物8。因?yàn)镻LA的終產(chǎn)物乳酸也是腸道內(nèi)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，即使有少量進(jìn)入血液，也可經(jīng)生物代謝排出，故PLA-MCI具有良好的安全性，可能是一個(gè)有希望的口服型胰島素制劑。作者單位：馬學(xué)毅(北京解放軍304醫(yī)院內(nèi)分泌科100037)潘國(guó)敏(北京解放軍304醫(yī)院內(nèi)分泌科100037)胡景勝(北京解放軍304醫(yī)院內(nèi)分泌科100037)賈軍宏(北京解放軍304醫(yī)院內(nèi)分泌科100037)呂澤(北京中國(guó)科學(xué)院化學(xué)所100080)王身國(guó)(北京中國(guó)科學(xué)院化學(xué)所100080)參考文獻(xiàn)：1Dange C, Mick

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