用雞胚絨毛尿囊膜研究血管內(nèi)皮細(xì)胞移動和增殖

1、用雞胚絨毛尿囊膜研究血管內(nèi)皮細(xì)胞移動和增殖關(guān)鍵詞：雞胚；內(nèi)皮，血管； 細(xì)胞中國病理生理雜志000626中分類號 Q 24 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1000-4718(2000)06-0572-02MeSH Chick embryo; Endothelium, vascular; Cells血管生成主要包括內(nèi)皮細(xì)胞的移動與增殖，它不僅存在于胚胎發(fā)育、黃體形成等生理過程，而且在許多病理過程如惡性腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、銀屑病、創(chuàng)傷愈合中起重要作用。因此，血管生成與抑制的研究近年受到廣為關(guān)注，特別是研究抑制血管生成為控制腫瘤生長和抗轉(zhuǎn)移開辟新途徑而日益受到重視1。由于大多數(shù)血管生長抑制

2、劑都是抑制內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)的移動與增殖，因而，研究EC移動與增殖的實(shí)驗方法顯得很重要。本文介紹用雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)研究血管EC移動和增殖的體內(nèi)方法。雞胚CAM是在胚齡45 d時由絨毛膜的體壁中胚層和尿囊膜的臟層中胚層融合而成。孵育至第67 d時CAM及其血管覆蓋整個卵黃囊表面。CAM的組織學(xué)結(jié)構(gòu)有3層：外胚層，位于殼膜下方，由來自絨毛膜的上皮組成；中胚層，是一層富含毛細(xì)血管的結(jié)締組織；內(nèi)胚層，位于尿囊，由來自尿囊膜的內(nèi)皮形成。CAM是一體外呼吸器官，隨胚齡增加而增大，且毛細(xì)血管極其豐富2。材 料 和 方

3、法一、材料Leghorn雞胚由山東省農(nóng)科院家禽研究所提供，3H-TdR和核型乳膠由北京中國原子能研究院提供，鹽酸平陽霉素(pingyangmycin, PY)由天津河北制藥廠生產(chǎn)。二、方法(一)PY對血管EC移動的影響 取胚蛋在38和60%相對濕度下孵育至第7 d時，將胚蛋隨機(jī)分為兩組。對照組：分別取胚齡第8、10、12、14、16和18 d的胚蛋各5枚，無菌條件下，在氣室端(胚蛋大頭端)用電動牙科鉆鋸1個1 cm2 cm的小窗，去除蛋殼，暴露殼膜，以10%甲醛固定。實(shí)驗組：取第8 d的胚蛋10枚，暴露殼膜，將一吸附有5g PY的玻璃纖維濾紙載體(5mm)置于殼膜中央，用透明玻璃紙密封后放入孵

4、箱。隔日1次取出胚蛋，往載體上滴加5g PY，密封后放回孵箱。第18 d時，用10%甲醛固定殼膜和CAM。將兩組固定后的殼膜和CAM剪取2 cm2 cm，在10%甲醛中繼續(xù)固定，待做組織學(xué)檢查。(二)PY對血管EC增殖的影響 取胚齡為10 d的胚蛋20枚，分為對照組和實(shí)驗組，每組10枚。用假氣室法，在蛋殼上開1個1 cm2 cm的小窗，小心撥去蛋殼和殼膜，暴露CAM。實(shí)驗組將一吸附有5g PY的載體置于CAM中央；對照組用PBS(pH 7.0)10L。然后，在每個雞胚CAM上滴加3H-TdR 7.4105Bg，密封后放回孵箱中。5 h后取出胚蛋，掀去玻璃紙，用適量Carnoy液固定30 min

5、，以載體為中心剪下CAM約2 cm2 cm，繼續(xù)固定612 h后，做組織學(xué)切片，片厚5m，H-E染色，不封片，在暗室內(nèi)涂乳膠膜。具體做法是：將盛有配制好的核型乳膠溶液的小燒杯，置入38水浴中，將標(biāo)本加熱至3740，在切片上滴少量乳膠(1滴3.0 cm3.5 cm)，用細(xì)玻棒牽引乳膠使之均勻覆蓋于切片上，保持3740 1 min，使乳膠流體均勻，保持水平位置，在室溫干燥。將干燥的制片放入暗盒，在4冰箱中曝光1014 d。曝光后顯影和定影，觀察乳膠透明后，在過23 min，放在自來水細(xì)流中沖洗約1 h，風(fēng)干。用中性加拿大樹膠封片3。結(jié) 果一、PY對血管EC移動的影響對照組：孵育第8 d時，CAM的

6、3層結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成。毛細(xì)血管都位于中胚層內(nèi)，在絨毛膜上皮細(xì)胞下方相互連接成血管網(wǎng)。EC外形扁平，核區(qū)稍增厚。CAM毛細(xì)血管壁僅有12個EC構(gòu)成。EC核亦呈梭形，核質(zhì)淡染，含有一明顯核仁，核內(nèi)有少量染色質(zhì)。不突向管腔，管腔平滑，略呈圓形或橢圓形(1)。第10 d時，CAM毛細(xì)血管仍位于外胚層上皮細(xì)胞之下。EC改變與第8 d相似。第12 d時，CAM毛細(xì)血管開始向絨毛膜上皮細(xì)胞層及其上方移動，與殼膜更加接近。EC核變圓，使核區(qū)向血管腔突出，核染色質(zhì)明顯增加。第14 d時，CAM毛細(xì)血管已完成向絨毛膜上皮上方的移動，EC移至外胚層上方，與殼膜緊貼。EC靠近殼膜的一側(cè)明顯變薄。第16和18 d時，毛細(xì)血

7、管EC位于外胚層上皮細(xì)胞上方，與殼膜緊貼，與第14 d時所見相同。EC核更圓，核區(qū)常向血管腔突出，核染色質(zhì)深染，富含染色質(zhì)，EC核多位于遠(yuǎn)離殼膜的一側(cè)(2)。實(shí)驗組：第18 d時，CAM毛細(xì)血管EC移動受到明顯抑制，仍停留于外胚層上皮細(xì)胞的下方，距殼膜較遠(yuǎn)(3)。與對照組中第8和10 d時所見相似。二、PY對血管EC增殖的影響光鏡下觀察處于外胚層絨毛膜上皮細(xì)胞下方并與之緊靠的毛細(xì)血管或血竇EC的3H-TdR 標(biāo)記率。根據(jù)背景，每個細(xì)胞大小面積內(nèi)銀粒數(shù)少于3個。我們規(guī)定如果一個細(xì)胞大小面積內(nèi)銀粒數(shù)大于10個，則認(rèn)為這個細(xì)胞被標(biāo)記。在油鏡下每次計數(shù)100個EC，共4次，對照組與實(shí)驗組EC的3H-T

8、dR 標(biāo)記率平均值分別為41.5%3.4%和20.3%1.5%，兩組間有非常顯著差異(P0.01)。Fig 1 Three layers of CAM were formed on the 8th days. Capillaries localized in the mesenchyme, and became net beneath the ectoderm (200)1 胚齡第8d時，CAM的3層結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成。毛細(xì)血管都位于中胚層內(nèi)，在絨毛膜上皮細(xì)胞下方相互連接成血管網(wǎng)Fig2 ECs of CAM migrated above the ectoderm on the 14th day a

9、fter incubation, and localized closely beneath the shell membrane (200)2 胚齡14d時，CAM EC 移至外胚層上方，與殼膜緊貼Fig 3 EC migration was significantly inhibited. Even on the 18th day of incubation, EC was still under the ectoderm, farther away from the shell membrane (200)3 胚齡18d時，PY可使CAM EC 移至受到明顯抑制，仍停留于外胚層之下，距殼

10、膜較遠(yuǎn)討 論研究EC移動的方法主要有Boyden室法、吞噬動力軌跡法4及l(fā)inear under-agarose assay等，均為體外EC培養(yǎng)法，十分復(fù)雜。Ausprunk等報告用電鏡觀察EC有無偽足來判斷EC移動，但費(fèi)用太高，而且操作與觀察技術(shù)要求高而復(fù)雜。因此作者設(shè)想能否用較簡單的辦法研究EC移動，果然在一次觀察CAM組織學(xué)結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)孵育第9 d的CAM毛細(xì)血管EC都位于外胚層絨毛膜上皮之下，而孵育至第14 d后CAM毛細(xì)血管EC大都移至上皮之上，緊貼殼膜。這是因為胚胎發(fā)育需要越來越多的氧氣彌散之故。PY可抑制CAM毛細(xì)血管EC的移動，使第18 d胚齡時早已該移至外胚層之上的毛細(xì)血管EC

11、仍停留在外胚層上皮細(xì)胞層之下。抑制EC移動可能是其抑制血管新生的重要機(jī)制之一。在雞胚發(fā)育中，胚齡10 d時CAM毛細(xì)血管EC分裂增殖最旺盛，DNA合成達(dá)到高峰期，因此，選用第10 d的雞胚做3H-TdR 標(biāo)記最便于觀察。結(jié)果表明PY可使CAM毛細(xì)血管EC的3H-TdR 標(biāo)記率明顯降低，DNA合成減少，即抑制EC增殖，是抑制血管生成的又一重要機(jī)制。CAM上能被3H-TdR 標(biāo)記的細(xì)胞除EC外，還有絨毛膜細(xì)胞、尿囊內(nèi)胚層細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和血細(xì)胞。在鑒別一個被標(biāo)記的細(xì)胞是不是EC時，主要根據(jù)CAM的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。第10 d時，CAM毛細(xì)血管EC大多移近外胚層，集中在絨毛膜上皮下方，毛細(xì)血管或血竇

12、管腔清晰，并?？梢姷郊t細(xì)胞，血管壁上能被標(biāo)記的細(xì)胞只有EC，所以不難識別。PY是一細(xì)胞毒類抗腫瘤抗生素。作者證明它不僅可強(qiáng)烈抑制雞胚CAM的血管生長，還可抑制S180、Lewis肺癌等腫瘤的血管生成。本實(shí)驗證明PY抑制血管生成的機(jī)制是抑制EC的移動和增殖。另外，鄭勤田等在局部注射PY治療小兒血管瘤和淋巴管瘤這兩種內(nèi)皮細(xì)胞增殖性腫瘤臨床實(shí)踐中已取得了滿意的療效5。提示PY是一有潛力的血管生長抑制劑。雞胚CAM可作為研究EC移動和增殖的體內(nèi)方法，用于血管生成刺激因子和抑制因子的篩選和研究?；痦椖繃易匀豢茖W(xué)基金資助(No. 39170829)參 考 文 獻(xiàn)1 Liu Y, Thor A, Sht

13、ivelman, et al. Systemic gene delivery expends the repertoire of effective antiangiogenic agents J.J Biol Chem, 1999， 274(19):1333813344.2 Leeson TS， Leeson CR. The chorio-allantois of the chick. Light and electron microscopic observations at various times of incubation J. J Anat， 1962， 97(4):585589.3 Hobson B， Denekamp J. Endothelial proliferation in tumors and normal tissues: continuous labelling studies J. Br J Cancer， 1984， 49:4054