RNA病毒擴(kuò)增檢測的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品研究進(jìn)展

1、RNA病毒擴(kuò)增檢測的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品研究進(jìn)展    nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;李金明衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，100730，北京RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒(HIV)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）等的核酸檢測對于感染的早期診斷和抗病毒治療療效的動態(tài)觀察具有重要價(jià)值。自1983     李金明 衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，100730，北京    RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒(HIV)、

2、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）等的核酸檢測對于感染的早期診斷和抗病毒治療療效的動態(tài)觀察具有重要價(jià)值。自1983年發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)以來，出現(xiàn)了基因擴(kuò)增的概念。目前多采用核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）來檢測病毒RNA，最常用的是逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR方法。核酸擴(kuò)增檢測要想得到可靠的結(jié)果，必須要使用質(zhì)控品進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，要對病毒進(jìn)行定量測定，通常還須有病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品。目前RNA病毒擴(kuò)增檢測的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品可分為兩大類，一是裸露的RNA片段，二是內(nèi)含特定RNA的病毒樣顆?；蚍Q之為帶盔甲的RNA(armored RNA)。   一、裸露的RNA 裸露的RNA即沒有任

3、何蛋白包裹的RNA片段。其通常將特定的RNA病毒擬擴(kuò)增RNA的 cDNA經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄的方式進(jìn)行構(gòu)建后，得到一種與相應(yīng)cDNA互補(bǔ)的RNA（cRNA）。 cRNA的構(gòu)建方法基本上是首先將所需的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物DNA片段經(jīng)T載體克隆入相應(yīng)的質(zhì)粒載體，然后再構(gòu)建入含T7啟動子的載體，體外逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cRNA1-5。這種裸露的RNA即可用作為相應(yīng)RNA RT-PCR測定的質(zhì)控品和定量標(biāo)準(zhǔn)品。 裸露的RNA構(gòu)建方法簡單，可通過OD260nm波長下比色進(jìn)行準(zhǔn)確定量。其缺點(diǎn)是：（1）穩(wěn)定性差，難于保存1-3。cRNA片段完全暴露于外界環(huán)境中，很容易被環(huán)境中的核糖核酸酶（RNa

4、se）所降解。（2）cRNA由相應(yīng)模板DNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，原有模板DNA的“污染”很難通過加DNase消化去除5。（3）不能監(jiān)測樣本中RNA病毒顆粒的裂解效率。cRNA直接暴露于樣本溶液中，無法模擬和監(jiān)測真正的病毒顆粒的核酸提取過程1-5。由于上述原因，cRNA質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品很難在臨床RNA病毒RT-PCR檢測中實(shí)際應(yīng)用，目前僅限于一些文獻(xiàn)報(bào)道1-5。    二、內(nèi)含特定RNA的病毒樣顆?；驇Э椎腞NA(armored RNA) 已知某些RNA病毒如MS2噬菌體、煙草花葉病毒（TMV）的外殼可以耐受RNase的作用，因此，如將特定的RNA序列包裹到這些病

5、毒外殼內(nèi)，就可以使其免受環(huán)境中RNase的降解，同時(shí)，在應(yīng)用過程中還可以模擬病毒顆粒監(jiān)測核酸提取過程中的病毒裂解效率。 1包裹于MS2噬菌體包膜蛋白內(nèi)的RNA MS2噬菌體屬于正極性單鏈RNA球形病毒，基因組全長3569堿基對，編碼成熟酶蛋白、包膜蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白等四種蛋白質(zhì)分子。噬菌體由180包膜蛋白單體、一分子成熟酶蛋白和一分子基因組RNA組成。在較早期的大腸桿菌病毒MS2噬菌體包膜蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)包膜蛋白與操縱子RNA序列有特異性相互作用，這種作用可引發(fā)噬菌體外殼的組裝，同時(shí)，將噬菌體基因組RNA包裝到包膜內(nèi)。因此，如果將特定病毒RNA的cDNA克隆于MS2噬菌體包膜蛋白基因

6、序列cDNA下游，并在其下游插入終止子，轉(zhuǎn)錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的特定病毒RNA轉(zhuǎn)錄本，隨后操縱子RNA序列就可以引發(fā)噬菌體包膜蛋白組裝成外殼，并將攜帶有特定病毒RNA序列的部分噬菌體基因組包裝到包膜內(nèi)，構(gòu)成噬菌體病毒樣顆粒。在構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體時(shí)，需將噬菌體成熟酶蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆表達(dá)于表達(dá)載體啟動子下游，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，所表達(dá)的包膜蛋白不僅僅作為病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)成分，而且可作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子和pac信號對表達(dá)過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，使包膜蛋白的表達(dá)和RNA的轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)一致，組裝所得噬菌體樣顆粒具有成熟特性，從而具有RNase抗性6-7。 國外及我們的研究8-13將編碼MS2

7、噬菌體相應(yīng)蛋白的cDNA序列連接到表達(dá)載體如pET28b T7啟動子下游，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)得到成熟酶蛋白和包膜蛋白，在成熟酶以及噬菌體基因組RNA片段的協(xié)同作用下，組裝得到了耐RNase的病毒樣顆粒。據(jù)此，我們成功構(gòu)建了表達(dá)載體pI NCCL，并經(jīng)原核表達(dá)后，得到的病毒樣顆粒具有耐RNase的特性12。我們將HCV RNA13、HIV RNA和SARS-CoV RNA等的cDNA序列構(gòu)建于該質(zhì)粒載體中的MS2噬菌體1.9kb基因組下游，經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌表達(dá)后，即可得到具有耐RNase的特性的內(nèi)含特定RNA的病毒樣顆?！，F(xiàn)我們亦已完成構(gòu)建腫瘤標(biāo)志物如前列腺特異抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）的mRNA的

8、病毒樣顆粒的表達(dá)載體。由于pI NCCL表達(dá)載體的通用性，可以預(yù)見其在涉及RNA的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的研制中將具有極為廣闊的應(yīng)用前景。 2包裹于煙草花葉病毒（TMV）包膜蛋白內(nèi)的RNA 將特定的病毒RNA序列的cDNA與煙草花葉病毒（TMV）的包膜基因序列cDNA一起克隆連接到表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)包膜蛋白并組裝成病毒樣顆粒。早已有報(bào)道說可以將外源基因插入植物病毒如TMV等病毒基因組中進(jìn)行高水平表達(dá)14。在誘導(dǎo)表達(dá)過程中，外源基因表達(dá)產(chǎn)物隨同組裝的TMV顆粒一起組裝到病毒顆粒內(nèi)。在將外源基因序列克隆到病毒基因組的過程中，既要注意病毒基因組的組成又要注意引入外源基因序列的位點(diǎn)，這樣可以確保病毒基因組可以

9、引發(fā)包膜蛋白的組裝，并且使組裝成的顆粒具有成熟特性，即RNase抗性，同時(shí)，確保引入的外源基因序列不會在重組過程中發(fā)生丟失現(xiàn)象。 使用內(nèi)含特定RNA的病毒樣顆?；驇Э椎腞NA做為RNA病毒RT-PCR檢測的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，具有下述幾個方面的優(yōu)點(diǎn)：（1）無生物傳染危險(xiǎn)性。（2）作為RNA RT-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品具有很好的穩(wěn)定性。（3）在核酸提取中，對病原體內(nèi)RNA有很好的模擬作用。由于表達(dá)產(chǎn)物為噬菌體樣顆粒，具有很好的病毒顆粒模擬功能，因此，在核酸提取過程中，與標(biāo)本中真正病毒核酸的提取過程有很好的相似性。 此外，也有人應(yīng)用牛腹瀉病毒（BVDV）作為檢測HCV的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品15，或者用H

10、CV病毒顆粒作為檢測HCV RNA的標(biāo)準(zhǔn)品代替WHO提供的HCV標(biāo)準(zhǔn)品16，或者用HIV病毒顆粒作為通用的病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品，但是，這些技術(shù)無法克服病毒顆粒傳染性、病毒顆粒制備運(yùn)輸困難等問題，也就是說病毒顆粒不是理想的標(biāo)準(zhǔn)品。 綜上所述，在RNA病毒的RT-PCR檢測中，影響實(shí)驗(yàn)過程的因素較多，如實(shí)驗(yàn)人員測定操作中的隨機(jī)誤差、擴(kuò)增儀孔間溫度的差異、標(biāo)本核酸提取后抑制物的殘留、待擴(kuò)增靶核酸的濃度、逆轉(zhuǎn)錄的效率以及試劑的問題等，這些因素均可能會影響PCR擴(kuò)增的效率，進(jìn)而造成結(jié)果的偏差。因此，PCR測定必須使用質(zhì)控品進(jìn)行嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)量控制才能保證結(jié)果的可靠性。此外，為進(jìn)行定量測定，必須有定量的標(biāo)準(zhǔn)品或

11、內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)還可以起到單管即時(shí)質(zhì)控的作用。一個穩(wěn)定可靠且無生物傳染危險(xiǎn)性的RNA質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，對于保證RNA病毒的RT-PCR檢測質(zhì)量具有重要意義。在這一點(diǎn)上，裸露的RNA或病毒顆粒及病毒替代品均難以作為理想的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，而采用分子克隆和原核表達(dá)方法構(gòu)建的內(nèi)含特定病毒RNA片段的噬菌體病毒樣顆粒則較好的解決了這些問題，其不但對于RNA病毒 RT-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，而且對于特定的mRNA的檢測等均有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。    參考文獻(xiàn) 1Fronhoffs S, Totzke G, Stier S, et al. A method for the ra

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