生物化學(xué)：第十章DNA的生物合成-MJ

1、DNA的生物合成（復(fù)制）的生物合成（復(fù)制）DNA Biosynthesis (Replication) 基基 因因（gene）基因是為蛋白質(zhì)和基因是為蛋白質(zhì)和RNA等生物活等生物活性分子編碼的性分子編碼的DNA功能片段功能片段根據(jù)產(chǎn)物的類別分為蛋白質(zhì)基因和根據(jù)產(chǎn)物的類別分為蛋白質(zhì)基因和RNA基因基因根據(jù)產(chǎn)物的功能分為結(jié)構(gòu)基因（酶根據(jù)產(chǎn)物的功能分為結(jié)構(gòu)基因（酶和不直接影響其他基因表達(dá)的蛋白和不直接影響其他基因表達(dá)的蛋白質(zhì)）和調(diào)節(jié)基因（阻遏蛋白和轉(zhuǎn)錄質(zhì)）和調(diào)節(jié)基因（阻遏蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子）激活因子）ReplicationReplication TranscriptionReverse Transc

2、ription TranslationDNARNAProtein 中心法則中心法則（the central dogma）James Watson詹姆斯杜威沃森，20世紀(jì)分子生物學(xué)的帶頭人之一，1953年和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（包括中心法則），獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，被譽(yù)為“DNA之父”?！按笞彀汀蔽稚?007年10月16日開始抵達(dá)英國進(jìn)行巡回演講的沃森表示，黑人不如白人聰明；有關(guān)不同種族智力水平相同的觀點(diǎn)是一種錯(cuò)覺。這種說法立即引起多方猛烈抨擊。西方國家對(duì)非洲國家的政策錯(cuò)誤地建立在這樣一種假設(shè)的基礎(chǔ)上，即認(rèn)為黑人與白人同樣聰明，但試驗(yàn)證明事實(shí)并非如此。沃森聲稱，10年之內(nèi)都無法找到造成

3、人類智商差別的基因。此前，沃森15日在接受采訪時(shí)也曾表示，他“對(duì)非洲的前途天生悲觀”，因?yàn)椤拔覀兯械纳鐣?huì)政策都基于這樣一個(gè)設(shè)想：非洲人的智力與我們相同，但所有試驗(yàn)都表明并非如此”。他說，人們有一種自然的愿望，認(rèn)為所有人應(yīng)該平等，但“那些和黑人雇員打交道的人發(fā)現(xiàn)事實(shí)不是這樣”?！按笞彀汀蔽稚?. 關(guān)于“同性戀不該出生”： Women should have the right to have abortions if tests could determine their children would be homosexual.2. 關(guān)于“愚蠢是種病，應(yīng)該治療”： He has previo

4、usly argued that stupidity is a disease that should be cured, and that 3. 關(guān)于“女性應(yīng)該被基因改造得更漂亮”： “it would be great“ if women were genetically engineered to be pretty.4. 關(guān)于“我不會(huì)雇胖人”： “Whenever you interview fat people, you feel bad, because you know youre not going to hire them“.5. 關(guān)于“黑色素能增加性欲” ： In 2000

5、 Watson shocked an audience at the University of California, Berkeley, when he advanced a theory about a link between skin color and sex drive. His lecture, complete with slides of bikini-clad women, argued that extracts of melanin which give skin its color had been found to boost subjects sex drive

6、. “Thats why you have Latin lovers,” he said, according to people who attended the lecture. “Youve never heard of an English lover. Only an English patient.“基因表達(dá)（基因表達(dá)（gene expression）通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將DNA分子上分子上A，G，C，T四個(gè)符號(hào)所包含的遺傳信息，轉(zhuǎn)四個(gè)符號(hào)所包含的遺傳信息，轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子上變?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子上20種氨基酸的信息種氨基酸的信息生物體內(nèi)生物體內(nèi)DNA合成的三個(gè)方面合成的三個(gè)

7、方面復(fù)制（復(fù)制（replication）反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription）損傷損傷DNA的修復(fù)的修復(fù)第一節(jié)第一節(jié) 復(fù)制的基本特征復(fù)制的基本特征Basic characteristics of DNA Replication復(fù)制的方式復(fù)制的方式 半保留復(fù)制半保留復(fù)制 （semi-conservative replication）復(fù)制的高保真性（復(fù)制的高保真性（high fidelity）雙向復(fù)制（雙向復(fù)制（bidirectional replication）半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制 （semi-discontinuous replication）復(fù)制的特點(diǎn)復(fù)制的特點(diǎn) 一

8、、半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和意義一、半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和意義 半保留復(fù)制的概念半保留復(fù)制的概念 DNA復(fù)制時(shí)，親代復(fù)制時(shí)，親代DNA解開的兩條單解開的兩條單鏈各自作為模板，按堿基配對(duì)原則，合成鏈各自作為模板，按堿基配對(duì)原則，合成與模板互補(bǔ)的與模板互補(bǔ)的DNA子鏈，成為兩個(gè)與親代子鏈，成為兩個(gè)與親代DNA完全相同的子代完全相同的子代DNA分子，在子代分子，在子代DNA分子中一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，另一條是分子中一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，另一條是保留親代的，故稱保留親代的，故稱半保留復(fù)制。半保留復(fù)制。子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式由Meselson和Stahl設(shè)計(jì)證明半保留復(fù)

9、制的實(shí)驗(yàn)的被譽(yù)為生物學(xué)最美麗的實(shí)驗(yàn)Meselson 和Stahl的證明DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)流程 半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義 按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。 遺傳的保守性，使物種穩(wěn)定性的分子基遺傳的保守性，使物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。Meselson與與Stalh在在42年以后在最初年以后在最初他們相遇的一顆樹他們相遇的一顆樹下重逢時(shí)的合影下重逢時(shí)的合影二、雙向復(fù)制二、雙向復(fù)制 DNA復(fù)制

10、時(shí)，是從起始點(diǎn)復(fù)制時(shí)，是從起始點(diǎn)（origin）向兩個(gè)方向解鏈，形）向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為稱為雙向復(fù)制雙向復(fù)制。1.復(fù)制起點(diǎn)（復(fù)制起點(diǎn)（origin of replication) 原核生物原核生物 僅一個(gè)；特殊的重復(fù)序列；約僅一個(gè)；特殊的重復(fù)序列；約245bp。真核生物真核生物 多個(gè)起始點(diǎn)多個(gè)起始點(diǎn)2.復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制時(shí)，親代復(fù)制時(shí)，親代DNA開鏈，子鏈沿張開鏈，子鏈沿張開的模板生長，形成的開的模板生長，形成的 Y 形結(jié)構(gòu)稱形結(jié)構(gòu)稱為為復(fù)制叉（復(fù)制叉（replication fork）。）。3.復(fù)制子（復(fù)制子（replicon）習(xí)慣上把

11、兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定位一個(gè)距離定位一個(gè)復(fù)制子。復(fù)制子。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的單位。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的單位。多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)三、半不連續(xù)復(fù)制三、半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication）在在DNA復(fù)制過程中，一條鏈連續(xù)復(fù)制過程中，一條鏈連續(xù)合成，稱為合成，稱為領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈（前導(dǎo)鏈）（前導(dǎo)鏈）。另一條鏈不連續(xù)合成，稱為另一條鏈不連續(xù)合成，稱為隨從隨從鏈鏈（后隨鏈）。（后隨鏈）。岡崎片段：岡崎片段：隨從鏈不連續(xù)合成的隨從鏈不連續(xù)合成的DNA子鏈片段。子鏈片段。這種領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不這種領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制的復(fù)制方式稱

12、為連續(xù)復(fù)制的復(fù)制方式稱為半不連半不連續(xù)復(fù)制續(xù)復(fù)制 。半不連續(xù)復(fù)制第第 二二 節(jié)節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化參與參與DNA復(fù)制的物質(zhì)復(fù)制的物質(zhì)底物底物(substrate)：dATP, dTTP, dCTP, dGTP 聚合酶聚合酶(polymerase):依賴依賴DNA的的DNA聚合酶，聚合酶， 簡寫為簡寫為DNA-pol模板模板(template):解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈母鏈引物引物(primer):提供提供3-OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次 聚合。聚合。其他的酶、其他的酶、Mg2+和蛋白因子等。和蛋白因子等。 一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)一、復(fù)制的化學(xué)反

13、應(yīng)聚合反應(yīng)的特點(diǎn)聚合反應(yīng)的特點(diǎn)以以DNA為模板，按堿基互補(bǔ)規(guī)律完成為模板，按堿基互補(bǔ)規(guī)律完成合成合成在在RNA引物或引物或DNA片段的片段的3 -OH后接后接續(xù)進(jìn)行，續(xù)進(jìn)行，DNA單鏈聚合方向?yàn)閱捂溇酆戏较驗(yàn)? 3 2個(gè)個(gè)dNTP之間形成磷酸二酯鍵之間形成磷酸二酯鍵二、二、DNADNA聚合酶聚合酶全稱：依賴全稱：依賴DNA的的DNA聚合酶（聚合酶（DNA- dependent DNA polmerase 簡稱：簡稱：DNA-pol活性：活性：1. 5-3的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性Arthur Kornberg 大腸桿菌細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物大腸桿菌細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物+ +

14、DNA模板模板有無有無DNA合成合成?- dNTPs- Mg2+ (輔助因子輔助因子)- ATP (能源能源)- 游離的游離的3OH端端 (引物引物)體外測定體外測定DNA復(fù)制復(fù)制純化得到純化得到DNA聚合酶聚合酶I 目前是目前是Standford大大 學(xué)醫(yī)學(xué)院的終身教授學(xué)醫(yī)學(xué)院的終身教授（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol IDNA-pol IIDNA-pol III（1） DNA pol 5 3 的聚合作用，合成的聚合作用，合成20個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸即離開模板即離開模板3 5 外切酶活性外切酶活性5 3 外切酶活性外切酶活性去除去除RNA引物，校正錯(cuò)誤，修復(fù)損傷引

15、物，校正錯(cuò)誤，修復(fù)損傷Klenow酶的晶體結(jié)構(gòu)模型（2） DNA pol只在缺只在缺DNA pol、時(shí)起作用時(shí)起作用5 3 的聚合作用的聚合作用3 5 外切酶活性外切酶活性體內(nèi)功能不清楚體內(nèi)功能不清楚（3）DNA pol 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)10種種亞基共亞基共22個(gè)個(gè)組成不對(duì)稱二聚體組成不對(duì)稱二聚體、亞基組成核心酶亞基組成核心酶亞基結(jié)合模板并使酶沿模板滑動(dòng)亞基結(jié)合模板并使酶沿模板滑動(dòng)亞基與核心酶和模板的結(jié)合有關(guān)，亞基與核心酶和模板的結(jié)合有關(guān)，有有ATPase活性活性DNA-pol III的結(jié)構(gòu)示意圖的結(jié)構(gòu)示意圖功能功能5 3 的聚合作用的聚合作用（亞基）亞基）3 5 外切酶活性外切酶活性（亞基）亞基）在

16、在DNA復(fù)制中主要作用復(fù)制中主要作用 Pol I Pol Pol III酶活性酶活性 5 3 聚合作用聚合作用 + + +3 5 外切酶活性外切酶活性 + + +5 3 外切酶活性外切酶活性 + 構(gòu)成（亞基數(shù)）構(gòu)成（亞基數(shù)） 單體單體 多個(gè)多個(gè) 22個(gè)個(gè)分子大小（分子大?。?03） 109 90 900體外鏈延長速度（核苷酸體外鏈延長速度（核苷酸/分）分） 600 30 9000分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞 400 10-20功能功能 修復(fù)合成修復(fù)合成 不詳不詳 復(fù)制復(fù)制 切除引物切除引物 填補(bǔ)空缺填補(bǔ)空缺大腸桿菌中大腸桿菌中DNA聚合酶聚合酶（二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA

17、-pol：起始引發(fā)，有引物酶活性。：起始引發(fā)，有引物酶活性。DNA-pol：參與低保真度的復(fù)制，無其它：參與低保真度的復(fù)制，無其它DNA pol 時(shí)起作用。時(shí)起作用。DNA-pol：在線粒體：在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。復(fù)制中起催化作用。DNA-pol：延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。：延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol：在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。：在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。酶活性酶活性5 3 聚合作用聚合作用+3 5 外切酶活性外切酶活性+構(gòu)成（亞基數(shù)）構(gòu)成（亞基數(shù)）44425分子大?。ǚ肿哟笮。?10）30036-38160-300170

18、250細(xì)胞內(nèi)定位細(xì)胞內(nèi)定位核核核核線粒體線粒體核核核核抑制作用抑制作用雙脫氧胸苷雙脫氧胸苷+弱弱弱弱真菌二類萜烯真菌二類萜烯+功能功能引發(fā)引發(fā)修復(fù)修復(fù)復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制修復(fù)修復(fù)（二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶三、三、 復(fù)制復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。準(zhǔn)確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（一）（一）DNA-pol的核酸

19、外切酶活性和及時(shí)校讀的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制1.遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2.聚合酶在復(fù)制延長時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；聚合酶在復(fù)制延長時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；3.復(fù)制出錯(cuò)時(shí)復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能。的及時(shí)校讀功能。四、復(fù)制中的解鏈和四、復(fù)制中的解鏈和DNA分子的拓?fù)鋵W(xué)變化分子的拓?fù)鋵W(xué)變化

20、（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白原核生物復(fù)制起始的相關(guān)基因原核生物復(fù)制起始的相關(guān)基因解螺旋酶解螺旋酶（helicase） 利用ATP功能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶引物酶（primase） 復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白（single stranded DNA binding protein, SSB） 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整解螺旋酶解螺旋酶ATP供能解開供能解開DNA雙鏈雙鏈rep蛋白蛋白=DnaB解螺旋解螺旋酶酶II 5 3 3 5 DnaA辨認(rèn)起始點(diǎn)辨認(rèn)起始點(diǎn)DnaB解

21、開解開DNA雙鏈雙鏈DnaC運(yùn)送和協(xié)同運(yùn)送和協(xié)同DnaB引物、引物、引發(fā)酶引發(fā)酶引物（引物（primer）以以DNA為模板，由為模板，由5 3 合成合成十幾到幾十個(gè)核十幾到幾十個(gè)核苷酸的苷酸的RNA小片段小片段。引物酶（引物酶（primase）催化催化RNA引物的合成。引物的合成。 E.coli中稱中稱DnaG蛋白蛋白，由，由dnaG編碼，對(duì)利福平編碼，對(duì)利福平不敏感。不敏感。單鏈結(jié)合蛋白（單鏈結(jié)合蛋白（SSB） 與解開的與解開的DNA單鏈結(jié)合，保護(hù)、穩(wěn)單鏈結(jié)合，保護(hù)、穩(wěn)定單鏈定單鏈DNA（二）（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA topoisomerase)DNA復(fù)制時(shí)復(fù)制時(shí)松弛超螺旋，

22、以利復(fù)制叉的行松弛超螺旋，以利復(fù)制叉的行進(jìn)及進(jìn)及DNA合成，合成后再使其恢復(fù)成超螺合成，合成后再使其恢復(fù)成超螺旋。旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn) 既能水解、又能連接磷酸二酯鍵分類分類 拓?fù)洚悩?gòu)酶I 拓?fù)洚悩?gòu)酶II（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶）拓?fù)洚悩?gòu)酶I（Topo I）切開雙鏈環(huán)狀切開雙鏈環(huán)狀DNA的的一股一股鏈，使鏈，使DNA解解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需不需ATP。（2）拓?fù)洚悩?gòu)酶）拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topo）切斷切斷DNA分子分子兩股鏈兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。螺旋松弛。利用

23、利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。螺旋狀態(tài)。五、五、DNA連接酶（連接酶（ligase）使相鄰的使相鄰的DNA片段片段，以，以3 ,5 -磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵相連，需相連，需ATP或或NAD+。它連接堿基互補(bǔ)配對(duì)基礎(chǔ)上的雙鏈它連接堿基互補(bǔ)配對(duì)基礎(chǔ)上的雙鏈DNA中的缺口。中的缺口。DNA連接酶的作用機(jī)理連接酶的作用機(jī)理 第第 三三 節(jié)節(jié) 原核生物原核生物DNA復(fù)制過程復(fù)制過程（The Process of DNA Replication I）一、原核生物的一、原核生物的DNA合成合成（一）復(fù)制的起始（一）復(fù)制的起始 1.DNA解開成單鏈，提供模板。

24、解開成單鏈，提供模板。 2.合成引物，提供合成引物，提供3-OH末端。末端。1. DNA解鏈DnaA辯認(rèn)并結(jié)合到模板鏈辯認(rèn)并結(jié)合到模板鏈OriC，DnaB、DnaC結(jié)合結(jié)合DnaA形成引發(fā)前體復(fù)合物，從形成引發(fā)前體復(fù)合物，從OriC解開雙鏈。解開雙鏈。SSB固定單鏈，形成復(fù)制泡。泡兩端為復(fù)制叉。固定單鏈，形成復(fù)制泡。泡兩端為復(fù)制叉。雙鏈解開一定長度后雙鏈解開一定長度后DnaA脫落。脫落。大腸桿菌大腸桿菌DNA復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu) GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 53E.coli復(fù)制起始點(diǎn) oriC 1 13 17 29 32 44

25、TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列532. 引發(fā)體形成引發(fā)體形成引發(fā)前體結(jié)合于后隨鏈，沿復(fù)制叉行進(jìn)引發(fā)前體結(jié)合于后隨鏈，沿復(fù)制叉行進(jìn)方向移動(dòng)，在不同部位與引物酶間斷結(jié)方向移動(dòng)，在不同部位與引物酶間斷結(jié)合，聚合為引發(fā)體。合，聚合為引發(fā)體。大腸桿菌大腸桿菌DNA復(fù)制復(fù)制過程中引發(fā)體的形成過程中引發(fā)體的形成 引發(fā)體沿模板引發(fā)體沿模板鏈由鏈由3 5 滑滑動(dòng)中，引發(fā)酶動(dòng)中，引發(fā)酶催化催化NTP按按 5 3 方向合方向合成成RNA引物。引物。復(fù)制開始復(fù)制開始超螺旋超螺旋DNA拓

26、撲酶拓?fù)涿杆沙谒沙诮怄溍附怄溍附忾_雙鏈解開雙鏈SSB大大腸腸桿桿菌菌D DNNA A復(fù)復(fù)制制過過程程中中復(fù)復(fù)制制體體的的形形成成 DNA pol 催化與模板鏈已配對(duì)結(jié)合的催化與模板鏈已配對(duì)結(jié)合的dNTP在在引物引物3 -OH上接續(xù)形成第上接續(xù)形成第1個(gè)磷酸二酯鍵。個(gè)磷酸二酯鍵。Topo解開超螺旋，為繼續(xù)解鏈和引發(fā)體繼續(xù)解開超螺旋，為繼續(xù)解鏈和引發(fā)體繼續(xù)沿模板鏈滑動(dòng)創(chuàng)造條件。沿模板鏈滑動(dòng)創(chuàng)造條件。兩個(gè)復(fù)制叉不斷向前移動(dòng)，兩個(gè)復(fù)制叉不斷向前移動(dòng)，DNA雙向解鏈，雙雙向解鏈，雙向復(fù)制。向復(fù)制。（二）（二）復(fù)制復(fù)制的延長的延長DNA pol 的不對(duì)稱二聚體同時(shí)結(jié)合兩條的不對(duì)稱二聚體同時(shí)結(jié)合兩條單鏈單鏈

27、DNA模板，朝復(fù)制叉方向滑動(dòng)，按模模板，朝復(fù)制叉方向滑動(dòng)，按模板鏈堿基順序同時(shí)催化板鏈堿基順序同時(shí)催化前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈和隨從鏈的和隨從鏈的合成，新鏈延伸方向?yàn)楹铣?，新鏈延伸方向?yàn)? 3 。大腸桿菌大腸桿菌DNA復(fù)制的延伸復(fù)制的延伸 1.原核生物復(fù)制的終止原核生物復(fù)制的終止2.不連續(xù)片段的連接。不連續(xù)片段的連接。（三）復(fù)制的終止（三）復(fù)制的終止大腸桿菌大腸桿菌DNA復(fù)制終止區(qū)的結(jié)構(gòu)復(fù)制終止區(qū)的結(jié)構(gòu) 子代子代DNA的分離的分離 二、真核與原核生物二、真核與原核生物DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較 原核原核 真核真核復(fù)制速度復(fù)制速度 快快 慢慢起始點(diǎn)起始點(diǎn) 少少 多（復(fù)制子）多（復(fù)制子）引物引物 幾十幾十b

28、10個(gè)個(gè)b岡岡崎崎片段片段 10002000b 100200b主要復(fù)制酶主要復(fù)制酶 Pol III Pol ， 第 四 節(jié) 真核生物基因組DNA復(fù)制和調(diào)控（The Process of DNA Replication II）哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM 細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1S及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。 細(xì)胞分裂期一、真核生物DNA復(fù)制基本過程真核生物復(fù)制的起始與原核生物基本類似 真核生物的復(fù)制發(fā)生在S期。 復(fù)制起始點(diǎn)難以確定。 酵母DNA復(fù)制起始點(diǎn)含11bp富含AT的核心序列：A（T

29、）TTTATA（G）TTTA（T），稱為自主復(fù)制序列（ARS）。CHO：中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary),該細(xì)胞具有不死性,可以傳代百代以上,是目前科研中廣泛使用的細(xì)胞。真核DNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)功能功能RPA單鏈DNA結(jié)合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合DNAPCNA激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性RFC有依賴DNA的ATPase活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活DNA聚合酶，促使PCNA結(jié)合于引物-模板鏈Pol /引發(fā)酶合成RNA-DNA引物Pol /DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)FEN1核酸酶，切除RNA引物RHas

30、e H I核酸酶，切除RNA引物DNA連接酶I連接岡崎片段DNA解旋酶DNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體拓?fù)洚悩?gòu)酶去除負(fù)超螺旋，去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋1. DNA聚合酶/引發(fā)酶復(fù)合物合成RNA-DNA引物DNA聚合酶由4個(gè)亞基組成： p180-催化亞基 p70-引發(fā)酶活性 p58-穩(wěn)定和維持p48活性 p48-組裝引發(fā)體引發(fā)反應(yīng)：首先合成RNA引物，再利用聚合酶活性延伸引物，產(chǎn)生起始DNA短序列。DNA聚合酶/引發(fā)酶脫離模板鏈。2.復(fù)制蛋白A促進(jìn)雙螺旋DNA解旋并激活Pol /引發(fā)酶復(fù)制蛋白A（RPA ）：是單鏈DNA結(jié)合蛋白R(shí)PA可促使進(jìn)一步解旋，并在一定條件下激活Pol /引發(fā)酶活性。

31、RPA為Pol 依賴復(fù)制因子（RFC）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）3.復(fù)制因子C促進(jìn)三聚體PCNA結(jié)合引物-模板鏈RFC含有5個(gè)亞基： p140結(jié)合PCNA p40、p37、p36組成穩(wěn)定的核心復(fù)合物 p38可能起連接作用RFC主要作用是促進(jìn)同源三聚體PCNA環(huán)形分子結(jié)合引物-模板鏈或雙螺旋DNA的切口。 4. 增殖細(xì)胞核抗原促進(jìn)Pol 持續(xù)合成的能力PCNA為同源三聚體，氨基酸序列保守性在種屬間不高。但酵母和人PCNA三維結(jié)構(gòu)幾乎相同。PCNA是Pol 的進(jìn)行性因子。PCNA內(nèi)表面的某些氨基酸殘基是激活Pol 所必需的。PCNA可與許多蛋白質(zhì)分子結(jié)合。5. Pol 負(fù)責(zé)DNA后隨鏈的復(fù)制和D

32、NA損傷修復(fù)Pol 是異源二聚體：p125和p50p125是催化亞基，具有DNA聚合酶活性和3-5核酸外切酶活性PCNA可激活p125的DNA聚合酶活性，但必須p50存在6. FEN1和RNase H I與岡崎片段5端的RNA引物切除有關(guān)FEN1是一種特異切割具有“帽邊”或“蓋子”結(jié)構(gòu)的DNA內(nèi)切酶Rhase H I是核酸內(nèi)切酶，參與岡崎片段5端的RNA引物切除，但在DNA鏈的5端殘留一個(gè)核糖核苷酸，該核苷酸再被FEN17. Waga S和Lewin B等提出的真核復(fù)制叉模型（二）真核生物復(fù)制中DNA鏈的延長發(fā)生DNA聚合酶/ Pol 和Pol 分別兼有解螺旋酶和引物酶活性 Pol 主要負(fù)責(zé)催

33、化合成引物 Pol 負(fù)責(zé)合成DNA鏈岡崎片段長度大致與一個(gè)核小體所含DNA堿基數(shù)（135bp）或若干倍相等。真核生物合成速率約為50dNTP/s3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體（三）切除RNA引物有兩種機(jī)制第一種：Rnase H I先切，留一個(gè)核苷酸由FEN1完成第二種：解旋酶Dna2介入形成蓋子結(jié)構(gòu)，再由FEN1切除（四）真核生物DNA合成后需要立即組裝成核小體復(fù)制-偶聯(lián)途徑 S期，等量已有的和新合成的組蛋白混合物裝配染色質(zhì)。復(fù)制叉前移中，前方核小體組蛋白八聚體解聚形成(H3-H4)2四聚體和二個(gè)H2A-H2B二聚體，產(chǎn)生的已有的(H3-H4)2四聚體和H2A-H2B二聚體與

34、新合成的同樣四聚體和二聚體在復(fù)制叉后約600bp處與兩條自鏈隨機(jī)組裝成新的核小體。 二. 真核生物DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)DNA復(fù)制調(diào)控主要發(fā)生在復(fù)制起始和末端，且與細(xì)胞周期密切相關(guān)。（一）細(xì)胞周期調(diào)控蛋白控制DNA復(fù)制的起始細(xì)胞周期中至少有兩個(gè)檢查位點(diǎn)（checkpoint），一個(gè)存在于G1期，一個(gè)存在于G2期由細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶控制1. 細(xì)胞周期蛋白和CDK調(diào)控DNA復(fù)制所需的酶和相關(guān)蛋白質(zhì)細(xì)胞周期蛋白基因激活合成細(xì)胞周期蛋白；細(xì)胞周期蛋白結(jié)合CDK；CDK磷酸化或去磷酸化；CDK激活后可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。2. 細(xì)胞周期蛋白和CDK調(diào)控復(fù)制起點(diǎn)激活并保證每個(gè)細(xì)胞周期中DNA只能一次

35、pre-RC由4種類型蛋白質(zhì)組成： 起始識(shí)別復(fù)合物（ORC）募集Cdc6，Cdt1和Mcm2-7CDK嚴(yán)格控制pre-RC的激活pre-RC只能在S期被CKD2激活并起始復(fù)制 2. 細(xì)胞周期蛋白和CDK調(diào)控復(fù)制起點(diǎn)激活并保證每個(gè)細(xì)胞周期中DNA只能一次三、真核生物的端粒和端粒酶1.端粒（端粒（telomere）指真核生物染色體線性指真核生物染色體線性DNA分子末端的特殊分子末端的特殊結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。由末端單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。末端末端DNA序列是多次重復(fù)的富含序列是多次重復(fù)的富含T、G堿基的堿基的短序列（人端粒含短序列（人端粒含TTAGGG的短重復(fù)序列）。的短重復(fù)

36、序列）。線性線性DNA復(fù)復(fù)制的末端制的末端2.端粒酶（端粒酶（telomerase）（1）組成：）組成：RNA（150b，富含富含CxAy） 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（反轉(zhuǎn)錄酶）（反轉(zhuǎn)錄酶）（2）作用：）作用： 與端粒與端粒3 端結(jié)合后，端結(jié)合后，以其以其RNA為模板，為模板， 經(jīng)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄延長端粒。反轉(zhuǎn)錄延長端粒。端粒酶催化的爬行模型端粒酶催化的爬行模型爬行模型（3 3）生物學(xué)意義合成端合成端粒粒，保證染色體復(fù)制的完整性，保證染色體復(fù)制的完整性保護(hù)保護(hù)DNA雙鏈雙鏈末段免遭降解及相互融合末段免遭降解及相互融合可能和衰老、腫瘤的發(fā)生或防治有關(guān)可能和衰老、腫瘤的發(fā)生或防治有關(guān)第四節(jié)第四節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式

37、逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 一一、逆轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription） 以以RNA為模板為模板 ，4種種dNTP為原料為原料 ，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，合成，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，合成DNA的過程。的過程。逆逆轉(zhuǎn)錄酶（轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）（1） 三種活性三種活性RNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA合成（合成（RDDP）RNAaseHDNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA合成（合成（DDDP）（2） 特點(diǎn)特點(diǎn)無無3 5 和和5 3 外切酶活外切酶活需需tRNA引物、引物、Zn2+

38、逆轉(zhuǎn)錄過程逆轉(zhuǎn)錄過程 dNTPs 引物引物 RNA模板模板 RNA/DNA雜化雙鏈雜化雙鏈 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 RNA 單鏈單鏈DNA dNTPs 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 雙鏈雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義補(bǔ)充了中心法則補(bǔ)充了中心法則，并認(rèn)識(shí)到，并認(rèn)識(shí)到RNA在生命過在生命過程中的重要性；程中的重要性；發(fā)現(xiàn)了癌基因、原癌基因，發(fā)現(xiàn)了癌基因、原癌基因，深化深化了對(duì)了對(duì)RNA病毒致癌、致病病毒致癌、致病機(jī)理的研究；機(jī)理的研究；利用利用逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行基因操作，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行基因操作，構(gòu)建cDNA文庫，制備文庫，制備cDNA探針。探針。三、滾環(huán)復(fù)制和D D環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制（

39、rolling circle replication） 是某些低等生物的復(fù)制形式，如是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和和M13噬菌體等。噬菌體等。滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制 滾環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制（D-loop replication） 是線粒體是線粒體DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）的復(fù)制形式。的復(fù)制形式。DNA損傷（突變）與損傷（突變）與修復(fù)修復(fù)DNA Damage(Mutation)and Repair 突變突變(mutation) DNA分子中一個(gè)或多個(gè)堿基的構(gòu)成、復(fù)制及分子中一個(gè)或多個(gè)堿基的構(gòu)成、復(fù)制及表型功能的異常。即遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變引起遺傳表型功能的異常。即遺

40、傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變引起遺傳信息的改變，也稱信息的改變，也稱DNA損傷損傷(DNA damage)。一、突變的意義一、突變的意義進(jìn)化的分子基礎(chǔ)進(jìn)化的分子基礎(chǔ)基因型改變（表型不變）基因型改變（表型不變）致死性的突變（消滅病原體）致死性的突變（消滅病原體）某些疾病發(fā)病的某些疾病發(fā)病的分子分子基礎(chǔ)基礎(chǔ)二二、引發(fā)、引發(fā)突變的因素突變的因素自發(fā)突變自發(fā)突變 10-9 （如脫嘌呤作用、脫氨基作用）（如脫嘌呤作用、脫氨基作用）物理因素物理因素 紫外線（紫外線（T-T）、各種輻射）、各種輻射化學(xué)因素化學(xué)因素 誘變劑誘變劑化學(xué)物類別化學(xué)物類別作用點(diǎn)作用點(diǎn)分子改變分子改變（從原型配對(duì)至突變型）（從原型配對(duì)至突變型）堿基

41、類似物堿基類似物5溴尿嘧啶溴尿嘧啶（5BU） A5BUG（被取代）（被取代）-A- -G- -G- -T- -T- -C-羥胺類羥胺類（NH2OH）TC -T- -C- -C- -A- -A- -G-亞硝酸鹽亞硝酸鹽（NO2 ）CU -G- -G- -A- -C- -U- -T-烷化劑烷化劑（如氮芥類）（如氮芥類）GGCH3（G堿基堿基N-7位甲化）位甲化） DNA缺失缺失G常見的化學(xué)誘變劑常見的化學(xué)誘變劑三、突變分子改變的類型三、突變分子改變的類型錯(cuò)配錯(cuò)配（mismatch）缺失缺失（deletion） 框移框移（frame-shift）插入插入（insertion）重排重排（rearrangement）（一）錯(cuò)配（一）錯(cuò)配 DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變點(diǎn)突變（point mutation）1.轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 發(fā)生在同型堿基之間。即嘌呤代替另發(fā)生在同型堿基之間。即嘌呤代替另 一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。2.顛換顛換 發(fā)生在異型堿基之間。即嘌呤代替嘧發(fā)生在異型堿基之間。即嘌呤代替嘧 啶，或嘧啶代替嘌呤。啶，或嘧啶代替嘌呤。CTCGAGGTGCACHb A基因基因肽