生化,分子,細(xì)胞試驗(yàn)匯總課件

1、主要培養(yǎng)基的配制LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨 10 g，酵母浸出物 5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水 1000 ml，用 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.4，121高壓滅菌 20 min。如果需要加抗生素，則待滅過菌的培養(yǎng)基溫度降到 55以下后加入適量的抗生素儲(chǔ)存液。LB 固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM溶液90%(v/v)，F(xiàn)BS 10%(v/v)，青霉素100U/ml，鏈霉素100 mg/mlMcCoys 5A細(xì)胞培養(yǎng)基McCoys 5A溶液90%(v/v)，F(xiàn)BS 10%(v/v),青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/ml實(shí)驗(yàn)試劑及藥品的

2、配制1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)在800 ml的雙蒸水中溶解Tris(三羥甲基氨基甲烷)121.1 g，用濃鹽酸調(diào)pH至8.0，用雙蒸水定容至1000 ml。121高壓滅菌15 min，備用。TE 緩沖液(pH8.0)1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)10 ml和500 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液2 ml，用雙蒸水定容至1000 ml。121高壓滅菌15 min，備用。500 mmol/L 乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)在 800 mL 的雙蒸水中加入18.6 g 乙二銨四乙酸二鈉，充分溶解后，用10 mol/L NaOH 溶液調(diào)p

3、H 至8.0，用雙蒸水定容到1000 ml。121高壓滅菌 15 min，備用。溴化乙錠(EB)1 g EB，加入100 ml 滅菌雙蒸水中，磁力攪拌數(shù)h以確保其完全溶解，然后轉(zhuǎn)入棕色瓶中，4保存。TAE 電泳緩沖液(50×)242 g Tris堿，57 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA，加滅菌去離子水定容至 1000 ml，使用時(shí)稀釋50倍。10% SDS將10 g高純度的SDS置于燒杯中，加入約 80 ml的ddH2O，68加熱溶解，滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2，定容至100 ml后，室溫保存。G418 (Neomycin)用PBS (pH 7.4) 配成濃度為50 m

4、g/ml的原液，0.22 mm濾膜過濾除菌，分裝儲(chǔ)于-20備用?；蚪MDNA提取液1 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)1 mL和0.1 mol/L EDTA (pH8.0)溶液20 ml， 0.5% (m/v) SDS，加滅菌去離子水定容至100 ml，備用。蛋白提取液1M Tris-HCl (pH7.6) 5 ml，5 M NaCl 3 ml，10%SDS 1 ml，100% NP-40 1 ml，加滅菌去離子水定容至100 ml，備用。100 mM 姜黃素用DMSO配成濃度為100 mM的儲(chǔ)存液，分裝避光儲(chǔ)存于-20備用。100 mM CPT-11CPT-11原裝瓶為50 m

5、g，加入802 ml DMSO溶解，分裝儲(chǔ)存于-20備用。100 mM DHADHA原裝瓶為50 mg，加入1758 ml DMSO溶解，配成濃度為100mM的儲(chǔ)存液，分裝避光儲(chǔ)存于-20備用。100 mM 5-Fu用DMSO配成濃度為100 mM的儲(chǔ)存液，分裝避光儲(chǔ)存于-20備用。實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞凍存（HEK293細(xì)胞為例）1. 消化細(xì)胞并700rpm離心5min收集細(xì)胞；2. 吸除上清，沉淀用凍存培養(yǎng)基（80% DMEM，10%FBS，10%DMSO，現(xiàn)配現(xiàn)用）充分重懸；3. 將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，1ml/管，標(biāo)注細(xì)胞名稱/型號(hào)、代數(shù)、日期、操作者，并迅速放于室溫的凍存盒內(nèi)；4. -80過

6、夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮罐中凍存。細(xì)胞復(fù)蘇（HEK293細(xì)胞為例）1. 將凍存的細(xì)胞迅速從液氮罐中取出，放入37水浴中進(jìn)行溶解至無冰晶；2. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml無菌離心管中。逐滴加入5ml完全培養(yǎng)基，邊滴加邊充分搖動(dòng)；3. 700rpm離心5min收集細(xì)胞；4. 吸除上清以2ml完全培養(yǎng)基來重懸細(xì)胞沉淀并轉(zhuǎn)移到6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。總RNA提取1) 棄12或6孔板中的原Medium后，PBS 500 ul/孔洗兩次.2) TRIzol 1 ml/孔（組織經(jīng)勻漿處理后每100 mg加入1ml的Trizol）。吹打混勻后轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的做好標(biāo)簽的好的1.5 ml的離心管中，并立即放在冰上以防RNA降解，5

7、 min.3) 氯仿 200 ul/管，劇烈震蕩15 s （Dont Vortex?。?，使細(xì)胞充分裂解,室溫靜止3 min.4) 4，12000 rcf，15 min.5) 轉(zhuǎn)移500 ul上清到相應(yīng)的做好標(biāo)記的1.5 ml的離心管中，加入500 ul/管異丙醇，顛倒混勻，室溫靜止10 min。4，12000 rcf，15 min.6) 棄上清，加入用DEPC水配好的75%的乙醇1 ml/管，顛倒兩次后，放4離心機(jī)，7500 rcf，5 min.7) 棄上清，等RNA干燥透明后加入30 ul的DEPC水，吹打混勻使得RNA溶解后，1% 凝膠電泳分析（100V 15-20 min），置于-80冰

8、箱保存。基因克隆1. 查找目標(biāo)基因的基本信息，查找相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)克隆基因方案。利用DNA處理軟件和引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，將引物序列送公司合成，根據(jù)合成引物的退火溫度確定PCR退火溫度。2. 查詢?cè)摶蛴斜磉_(dá)的細(xì)胞株，培養(yǎng)細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA。3. 反轉(zhuǎn)錄。4. PCR：首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，跑膠初步判斷大小，摸索最佳退火溫度和體系。然后進(jìn)行回收目標(biāo)片段。5. 連接18T vector：載體和插入片段的比例為1:3。6. 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選單克隆。7. 挑取單克隆至1ml LB液體培養(yǎng)基（含抗生素）中，37，300rpm，約1012 h，小抽并且進(jìn)行酶切驗(yàn)證。8. 測(cè)序：挑取酶切驗(yàn)證

9、正確的陽性克隆送測(cè)序。9. 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將測(cè)序正確的片段連接入真核表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)室有多種表達(dá)載體，根據(jù)需要選擇。連接體系參考T4Ligase 說明書。10. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑選陽性克隆進(jìn)一步酶切驗(yàn)證，挑取陽性克隆中抽質(zhì)粒并純化，瞬轉(zhuǎn)真核細(xì)胞（根據(jù)課題的方向選擇細(xì)胞株），Western Blot驗(yàn)證所構(gòu)建的表達(dá)載體是否在該細(xì)胞株中表達(dá)。11. 大抽，操作步驟詳見說明書。中抽質(zhì)粒（基因克隆時(shí)酶切驗(yàn)證時(shí)所用方法）1）6000 rpm，離心5 min（4），棄上清;2）重復(fù)步驟1），收集34ml菌液至1個(gè)EP管中；3）加入2.5 ml 預(yù)冷的solution ，吹打混勻，充分懸浮細(xì)菌；4）加入

10、2.5 ml 現(xiàn)配的solution ，輕柔顛倒幾次，充分混勻（solution 配置：0.4 M NaOH：2% SDS=1：1）；5）加入3.5 ml預(yù)冷的solution ，輕柔顛倒幾次，充分混勻，中和裂解液的堿性；6）冰浴10 min，使雜質(zhì)充分沉淀；7）12,000 rpm 離心10 min（4），輕輕吸取上清800 l/管，轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 ml離心管中；8）加入2/3 體積的異丙醇（530 l），混勻后冰浴5 min；9） 12,000 rpm離心10 min，棄上清；10）預(yù)冷的70% 乙醇溶液 750l/管洗滌DNA沉淀，12,000 rpm離心10 min（4）；11）棄

11、上清，晾干，每管加入30 l TE(含20lg/ml RNase)，65 ，5 min；去除RNA；12）將幾管合并至一管，加等體積酚、氯仿混合液(成品)，劇烈振蕩10 s；13） 12,000 rpm離心10 min，取上清；14）加入1/10體積的3 M NaAc 和2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，即1ml；15）12,000 rpm 離心10 min，棄上清；16）70% 乙醇水溶液洗滌DNA沉淀，12,000 rpm離心10 min，棄上清；17）用適量ddH2O或者TE溶解DNA沉淀，得比較純凈的DNA，測(cè)濃度。瓊脂糖凝膠電泳1) 配制足量的電泳緩沖液（1xTAE 或0.5xTBE）用

12、以灌滿電泳槽或配制凝膠；2) 根據(jù)欲分離DNA片段的大小用電泳緩沖液配適宜濃度的瓊脂糖溶液：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉加到盛好電泳緩沖液的玻璃瓶中；3) 玻璃瓶松松蓋住，沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖溶化；4) 用隔離手套轉(zhuǎn)移玻璃瓶到55箱內(nèi)后，待溶化的凝膠稍冷卻后加入EB，終濃度為0.5 ug/ml,輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液；5) 瓊脂糖冷卻時(shí)，用一合適的梳子形成加樣孔，梳齒的位置應(yīng)在托盤底面上0.5-1.0 mm,這樣瓊脂糖澆灌到托盤時(shí)將形成符合要求的加樣孔；6) 澆灌溫?zé)岬沫傊侨芤哼M(jìn)入模具；7) 讓膠完全凝結(jié)，室溫下30-45min,小心拔出梳子，將凝膠安放到電泳槽中；8) 向電泳槽中加入電泳

13、緩沖液，剛好沒過凝膠1 mm；9) 混合DNA樣品和0.2倍體積的6xloading buffer,用微量移液器將樣品混合液緩慢加至加樣孔中；10) 1關(guān)上電泳槽蓋子，接好電極插頭，設(shè)好電壓和時(shí)間，按Run鍵，DNA應(yīng)向陽極移動(dòng)；11) 當(dāng)DNA樣品或染料在凝膠中遷移了足夠距離時(shí)，關(guān)上電源、拔下插頭和打開電泳槽蓋，取出膠放入凝膠成像儀中拍照。RT-PCR1) 根據(jù)所測(cè)的RNA的濃度，計(jì)算上樣500 ng的RNA樣品所需的體積，用DEPC 水補(bǔ)至5 ul，加入1 ul的6xloading buffer進(jìn)行電泳：120V、15 min。2) 根據(jù)所測(cè)的RNA的濃度，計(jì)算上樣2 ug RNA樣品所需

14、的體積，用DEPC水補(bǔ)至5 ul隨機(jī)引物1 uldNTP4 ulRNA5 ul65 5min5 x buffer4 ulInhibitor0.5 ulRTase1 ulDEPC水4.5 ul30 10min42 50min70 15min4 foreverPCR產(chǎn)物膠回收1) 按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書步驟，制備含大加樣孔的1%瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物加入加樣孔。2) 電泳結(jié)束后，在320nm波長紫外燈下根據(jù)Marker指示快速切取目的片段，用紙巾轉(zhuǎn)移至Ep管，秤取其重量。3) 加入相應(yīng)體積的溶膠液Buffer DE-A，水浴鍋75加熱至凝膠完全融化（約6-8min）。4)

15、加入Buffer DE-B，混合均勻。5) 將上步驟的所得液體加入DNA制備管中12,000×g離心1min，棄濾液。6) 加入500ul Buffer W1，12,000×g離心30s，棄濾液。7) 加700ul Buffer W2，12,000×g離心30s，棄濾液。8) 以同樣的方法再用700ul Buffer W2洗滌一次，12,000×g離心1min。9) 將制備管置于潔凈的1.5ml離心管，在制備膜中央加25-30ul Eluent Buffer，室溫靜置1min。12,000×g離心1min洗脫DNA。感受態(tài)細(xì)胞的制備1. 準(zhǔn)備L

16、B培養(yǎng)基和LB平板。2. 取凍存的Ecoli,37 融解后接種于LB平板上，37 培養(yǎng)16-20h。3. 在平板上挑取單菌落（2-3mm）,轉(zhuǎn)到含有100mlLB培養(yǎng)基的1L的燒瓶中，37 劇烈振蕩培養(yǎng)（250-300r/min）3h。4. 去1.5mlEp管，加入1mlLB培養(yǎng)基，再加入200ul菌液，37 振蕩孵育過夜（300rpm/min）。5. 在無菌的500ml燒瓶中加入50mlLB培養(yǎng)基，加入0.5-1 ml 培養(yǎng)過夜的的菌液（即稀釋50-100倍），然后與37 300r/min 振蕩孵育OD600=0.6(0.4-0.6)(約2h)。6. 當(dāng)菌液密度達(dá)到0.6以后，將菌液在冰上放

17、30min.。7. 將菌液在轉(zhuǎn)入50ml離心管，4 2500rpm, 離心20min,棄上清。8. 將沉淀用25ml預(yù)冷的0.1M Cacl2 重懸，按步驟7重復(fù)一次，棄去Cacl2 溶液。9. 用2ml 預(yù)冷的0.1M Cacl2 重懸沉淀（輕柔），然后在冰上放置1h.。10. 在重懸的菌液中加入丙三醇（甘油）（15% v/v）(即857ul 50%滅菌甘油)，充分混勻后分裝，200ul或100ul每管（1.5mlEp管），-80保存。感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化1) -80中取出已制備好的感受態(tài)菌，冰上放約20 min。2) 去1 ul質(zhì)粒加入1個(gè)感受態(tài)管中，混勻，放冰上約30 min。3) 將混合液

18、放入已加溫至42的循環(huán)水浴中，90 s（其間，不要搖動(dòng)管子）4) 快速轉(zhuǎn)到冰浴中，3 min。5) 加800 ul不含任何抗生素的培養(yǎng)基于每管，37，120 r/min，搖1h。6) 取100 ul菌涂板于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)板上，37培養(yǎng)箱中倒置平板培養(yǎng)12-14 h，出現(xiàn)菌落。SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA（小抽）1) 取1 ml LB培養(yǎng)液加入1個(gè)1.5ml的EP管中，挑一個(gè)單菌落于該管中，37，120300r/min，搖過夜，800ul用于提取質(zhì)粒，200ul保留。2) 6000 rpm，5min，棄上清。3) 加入250 ul預(yù)冷solutionI/管，充分混勻，重懸細(xì)菌。4) 加

19、入新配制的solutionII 250 ul/管，反復(fù)顛倒(輕輕5-10次)混勻5次，以混合內(nèi)溶物，室溫靜止3-5 min。5) 加入350 ul/管的solutionIII，快速反復(fù)顛(輕輕5-10次)倒混勻后，冰浴10 min。6) 12000 rpm，5 min，取上清750 ul轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml的EP管中。7) 加入500 ul(2/3)體積的異丙醇，充分混勻后冰浴5min,沉淀DNA。8) 12000 rpm，10 min，棄上清。9) 加入預(yù)冷的70%乙醇潤洗除鹽，12000 rpm，10min3min，棄上清。10) 加入10 ul含RNase的TE融解DNA，65反應(yīng)10

20、min(37反應(yīng)1 h)11) 質(zhì)粒檢測(cè)。中抽質(zhì)粒1) 取小抽剩下的200 ul菌液轉(zhuǎn)入50ml的含Amp+的LB培養(yǎng)基中，37，300rpm,搖約16h。2) 6000 rpm，5min,棄上清，收集菌體。3) 加入2.5ml預(yù)冷solutionI/管，重懸菌體。4) 加入新配制的solutionII 2.5ml /管，反復(fù)顛倒混勻5次，以混合內(nèi)溶物，室溫靜止3-5min。5) 加入3.5ml /管的solutionIII，快速反復(fù)顛倒混勻后，冰浴10min。6) 12000rpm,10min,取800ul/管上清于新的1.5 ml的EP管中。7) 加入2/3體積（533.3ul）的異丙醇，

21、充分混勻后室溫放5min。8) 12000rpm，3min，棄上清。9) 加入預(yù)冷的70%乙醇700ul/管，潤洗除鹽，12000rpm，10 min，棄上清。10) 質(zhì)粒DNA晾干透明后，加入300ul/管含RNase的TE融解DNA（65反應(yīng)5min）11) 加入等體積300 ul的（苯酚:氯仿=1:1）劇烈震蕩10s，然后4，12000rpm，10min。12) 吸取上清于另一管中，加入1/10體積的3M NaAC,兩倍體積的無水乙醇，混勻后室溫放置3min。13) 4，12000rpm，10min，棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇潤洗除鹽。14) 加入合適體積的含RNase的TE融解DNA

22、（200ul）。15) 質(zhì)粒檢測(cè)。大抽質(zhì)粒（QIAGEN試劑盒）挑取單菌落于300 ml LB培養(yǎng)液中，250rpm，搖過夜，約12-16h.4000rpm，5min，收集沉淀。加入8ml預(yù)冷solutionI/管，劇烈震蕩至沉淀重懸。加入新配制的solutionII 16ml /管，輕輕混勻5次，以混合內(nèi)溶物，室溫靜止5min。加入12ml /管的solutionIII，輕輕混勻，冰上放置15 min。4，12000rpm，20min。若離心不緊密，再離心一次。將上清用擦鏡紙過濾于小的管中，加0.6-1倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫放置20min.4，12000rpm,20min,棄上清。用

23、70%的乙醇洗管底和管壁3次，若沉淀漂起重新離心，放于架子上晾至乙醇揮發(fā)干凈。加400ulTE(PH 8.0)充分溶解后，轉(zhuǎn)移到1.5 ml 的EP管中。質(zhì)粒純化1）質(zhì)粒酶切后加入200 ul ddH2O，然后加入100 ul 酚/氯仿，劇烈震蕩混勻；2) 4, 12000 rpm, 15 min；3)轉(zhuǎn)移上清至一新EP管中，加入1/10體積的3 M NaAC和2倍體積的無水乙醇，充分混勻（直接從大抽質(zhì)粒純化時(shí)，100 ul質(zhì)粒（不夠，ddH2O補(bǔ)齊）+10 30 ul 3 M NaAC + 200 ul無水乙醇）；4) 4, 12000 rpm, 10 min；5)用預(yù)冷的75%乙醇洗3次（

24、4, 12000 rpm, 5 min每次）；6)用75%乙醇裝滿，拿進(jìn)細(xì)胞房，倒掉乙醇，風(fēng)干5-6 min（不超過10 min，否則難溶）；7)加入20-40 ul 1xTE buffer（已過濾除菌）充分溶解；8)測(cè)濃度，分裝，-204保存。細(xì)胞DNA抽提1) 吸棄去培養(yǎng)液，用PBS洗兩次（6孔板中）；2) 加1 ml細(xì)胞裂解液、40 ul 20 mg/ml的蛋白酶K、10ul的10mg/ml的RNaseA，用封口膜封好，再用保鮮膜包好后，55烘箱過夜；3) 2 ml異丙醇沉淀DNA，搖勻后，用槍將DNA 挑起放入新的1.5 ml EP管中；4) 75%酒精沉淀兩次，12000 rpm，5

25、min，再用100%的酒精洗一次；5) 晾干后，加入1xTE 100 ul 溶解過夜。鼠尾中DNA的提取1) 在含有約0.5 cm 小鼠尾巴的EP管中加入600 ul 50 mM的NaOH；2) 在金水浴中90-100煮1 h；3) 加入50 ul pH 8.0的Tris/HCl后，顛倒混勻；4) 12000 rpm，20 min；5) 取上清500 ul于另一做好標(biāo)記的管中。Real-time PCR1. SYBR檢測(cè)方法：（請(qǐng)注意2.5xRealMasterMix和20xSYBR solution避光保存）1) 20xSYBR solution在室溫下平衡并徹底混勻。2) 將125 ul

26、20xSYBR solution 加入至1.0 ml 2.5x RealMasterMix中。（加入20xSYBR solution的2.5xRealMasterMix溶液在-20可以保存三個(gè)月。在使用前務(wù)必徹底混勻RealMasterMix/SYBR solution。如果解凍后并沒有使用，一定要注意在再次冷凍前徹底混勻。反應(yīng)體系組成成分50 ul體系25 ul體系20 ul體系終濃度2.5xRealMasterMix /20xSYBR solution22.5 ul11.25 ul9 ul1x正向引物100-300nM反向引物100-300nMDNA模板-ng-pg超純水至50 ul至25

27、 ul至20 ul2PCR檢測(cè)反應(yīng)步驟（建議）循環(huán)步驟溫度時(shí)間內(nèi)容1x194-951-2min起始模板變性35-45x294-9510-20sPCR循環(huán)中模板變性350-6010-30s退火46810-60s延伸（解鏈時(shí)間的長短與模板的長度和GC含量有關(guān)）2. 引物稀釋：引物總濃度為1 mM，體積：200 mlddH2O 180 ulPrimer 1 (20 uM)10 ulPrimer 2 (20 uM)10 ulTotal200 ul3. SYBR mixture與template的混合：SYBR mixture9 ulDNA template1 ulTotal10 ul4. 操作流程：1

28、） 加人10 ul 稀釋好的primer至管底2） 加入10 ul SYBR mixture與template的混合物3） Vortex and Spin down4） 放入儀器檢測(cè)5. PCR程序95 2 min40x95 15 s60 30 s68 30 s95 15 s溶解曲線60 1 min95 15 s60 15s40x*68收集熒光6. 儀器的使用(1) 建立文件1） 打開7300 software2） 點(diǎn)擊Create New document3） Next4） Next5） 點(diǎn)擊Create New File6） Add files （e.g. Actin, PDE4DIP）t

29、o the right box7） Next8） Select wells9） Finish10) Name11) Done(2) 檢測(cè)1）打開菜單欄中的Instrument2）Edit program （將默認(rèn)program的后兩項(xiàng)刪除->add step->輸入數(shù)值->add step->program輸入完成，點(diǎn)擊add dissociation stage->下方下拉框中選擇Data collection為68）3）Save file至指定文件夾4）放入樣品5）點(diǎn)擊Start6）程序完成后關(guān)閉software和儀器注意事項(xiàng)：1） 先開儀器，設(shè)好progra

30、m再開始配制試劑2） 使用SYBR mixture一定要先恢復(fù)到室溫3） 配制試劑盡量避光（超凈工作臺(tái)操作）4） 檢測(cè)用的PCR管蓋不能標(biāo)記、及用手碰觸，帶手套操作5） 冰上配制，PCR管先預(yù)冷6） 熒光產(chǎn)物很容易污染，不能隨便打開蓋子，要丟棄指定位置7） 使用無RNA酶的耗材操作Western blot檢測(cè)1) 配制分離膠和濃縮膠；2) 加樣電泳：向凝固好的加樣孔中加入等量的蛋白，在電泳槽中進(jìn)行電泳，采用恒壓模式，初始電壓為50 V，待樣品進(jìn)入分離膠后電壓增至100 V，根據(jù)蛋白大小決定電泳時(shí)間；3) 轉(zhuǎn)膜前準(zhǔn)備：提前10 min將PVDF膜浸泡在甲醛甲醇中，濾膜和海綿浸泡在轉(zhuǎn)膜液中；4)

31、轉(zhuǎn)膜：按照以下順序裝配轉(zhuǎn)膜裝置：負(fù)極海綿濾紙凝膠PVDF膜濾紙海綿正極，將轉(zhuǎn)膜裝置放入電轉(zhuǎn)槽中，將電轉(zhuǎn)槽置于4冰箱，40 V恒壓12 h (蛋白>250 kDa，50V，16 h)；5) 封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，在正面做好標(biāo)記，將膜置5%脫脂奶粉中室溫封閉1-3 h；TBST洗膜 洗3次，每次10 min；6) 一抗孵育：加入稀釋好的一抗，室溫孵育2-3 h；7) TBST洗膜 洗3次，每次10 min15/5/5/5；8) 二抗孵育：二抗用5%封閉液按1：1000-5000稀釋，室溫孵育2-3 h；9) TBST洗膜 洗3次，每次10 min；10) 曝光顯影：將膜蛋白面與熒光

32、混合液充分接觸；孵育10 min，使用鑷子將膜輕輕轉(zhuǎn)移到另一保鮮膜上，將殘存的底物吸干，包好，放入X-光片夾中固定好，取大小適中的感光片蓋在膜上，曝光15 s/1 min/3 min；11) 定影：將X-光片從光片夾中取出，在顯影液中浸泡30s，取出，浸入定影液中，以膠片透明為止，用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。顯影和定影的具體步驟及注意事項(xiàng)（要點(diǎn)：均勻、快速）:1) 將底物（Bio-Rad）按1:1混合（1.5 ml + 1.5 ml）；2) 二抗孵育洗膜后將膜至于面巾紙中，快速輕壓一下，取出至于底物混合液中；3) 將膜快速浸濕其中一面，然后鑷子提取翻轉(zhuǎn)，浸濕另一面；4) 室溫避光放

33、置5 min；5) 將膜取出沾一下面紙以吸走多余底物；6) 將膜置于保鮮膜上，包好，放置于暗夾中；7) 暗房中，取出X-光片，抵住暗夾一側(cè)，快速連同暗夾蓋子一起合上；8) 曝光時(shí)間結(jié)束，將暗夾倒轉(zhuǎn)放置，打開蓋子，快速取出X-光片置于顯影液中；9) 均勻充分顯影后將X-光片至于定影液中；10) 定影結(jié)束用自來水清洗輕柔漂洗X-光片。Transfection（Lipofectamine 2000）1）Seed 8x105 HEK293 cells to 6-well plate and culture overnight;2) Change medium to pre-warmed Opti-ME

34、M 1 h (or medium with PS 3 h) before transfection;3) Prepare following solution:A: 4 ug DNA plasmid + 250 ul Opti-MEM B: 10 ul lipofectamin + 250 ul Opti-MEM Incubate for 5 min at RT;4) Mix A and B gently, and incubate for 20 min at RT;5) Add DNA/lipo mixture onto cells;6) After incubation for 4-6 h

35、, change medium without PS.穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆的篩選1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后1:5分到10 cm plate（分盤比例根據(jù)不同細(xì)胞、不同質(zhì)粒調(diào)整）；2）細(xì)胞培養(yǎng)12-14 d至克隆形成，每3天更換含G418的培養(yǎng)基；3）加入20 ul 胰酶至96-well plate；4）挑克隆至含有胰酶96-well plate，37孵育3-5 min；5）加入200 ul培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)80%以上；6）PCR鑒定，具體步驟如下：(1) 往標(biāo)記好的PCR管中加入5 l 50mM NAOH；(2) 往96孔板的每孔中加入20 l不含酚紅的胰酶，37消化10 min；(3) 從96孔板取2

36、 l細(xì)胞懸液加入到(1)中，在PCR儀中100度5 min后暫停，加入0.6ul的1M Tris PH 7.6再根據(jù)如下程序裂解細(xì)胞，提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板：CycleTemperatuer ()Time (seconds)1653028303659049718058606651807976086560980300 (4) PCR鑒定體系：取1 l裂解產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:ddH2O14.2 l10x PCR Buffer2 lDNTP Mixture2 lP1(上游引物)(20uM)0.3 lP2(下游引物)(20uM)0.3 lDNA Polymerase0.2 lTem

37、plate1 lTotal20 l*引物的用量可根據(jù)具體情況調(diào)整PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，直到找到所需單克隆。7）往96孔板中剩下的細(xì)胞加入200 l/孔新的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到新的96-well plate中繼續(xù)培養(yǎng)；8）PCR陽性克隆繼續(xù)培養(yǎng)，96well 48 well 24well 12well 6well。當(dāng)細(xì)胞長滿1個(gè)6孔時(shí)，將細(xì)胞1:2分成2個(gè)6孔，其中一個(gè)孔的細(xì)胞用于蛋白提取和Western blot驗(yàn)證，另外一個(gè)孔的細(xì)胞凍存。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染試劑使用lipofectamin 2000，所有耗材均為RNase free.1) Seed 1 x 105 cells to 1

38、2-well plate and culture for 24 h;2) Prepare following solution:A (Mock): 50 ul Opti-MEM B (Non-targeting): control siRNA 50 nmol + 50 ul Opti-MEMC (siRNA): siRNA 50 nmol + 50 ul Opti-MEMD (Lipo): 3*3 lipofectamin +150 ul Opti-MEM Incubate for 5 min at RT;3) Add 50 ul D to A or B or C, and incubate

39、for 20 min at RT;4) Add 200 ul Opti-MEM to RNA/lipo mixture;5) Add 300 ul RNA/lipo mixture onto cells;6) After incubation for 6 h change medium without PS;7) If needed, re-transfect the cells with siRNA 48 h later.Colony formation assay 1）24 h after transfection, count cells;2) Seed cells in triplic

40、ate in 6-well plate;3) Culture for 10-12 days, change medium with G418 every three days;4) Wash cells gently with PBS;5) Fix the cells with pre-chilled methanol (-20), 10 min, RT;6) Remove methanol, add 1 ml 0.5% crystal violet diluted in 20% methanol, 15 min, RT;7) Wash the plate with tag water gen

41、tly;8) Air dry the plate and count the colonies.MTT assay1) Seed cells in triplicate in 96-well plate (2000-3000 cells/well);2) Culture for 1-7 days, change medium every three days;3) Add 20 ul MTT stock solution (5 mg/ml) to cells;4) Incubate for 4-6 h at 37;5) Remove the medium and add 100 ul DMSO

42、 to dissolve the formazan;6) The absorbance was measured at a wavelength of 570 nm.劃痕實(shí)驗(yàn)1）用marker筆在6孔板背面用尺子比著劃5道橫線；2）鋪適量細(xì)胞于6孔板中；3）細(xì)胞密度達(dá)95%用200 ul進(jìn)口槍頭比著直尺劃3道垂直直線（貼壁不牢的細(xì)胞可改用10 ul的槍頭）；4）PBS洗3遍以去除漂浮細(xì)胞；5）加入1 ml培養(yǎng)基，拍照（取樣點(diǎn)為交叉點(diǎn)的上下位置）；6）加入含10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)（FBS的量可根據(jù)不同細(xì)胞調(diào)整）；7）每12 h或24 h拍照。Transwell assay1) Cell cu

43、ltured to 80-90% confluence;2) Starve the cells overnight (12 h);3) Equilibrium the transwell insert with medium without FBS at 37 for at least 1 h or overnight;4) Trpsinize the cells and adjust the density to be 1 x106/ml with medium containing 0.1% BSA and no FBS;5) Add 100 ul cells (1x105) to tra

44、nswell insert in medium containing 0.1% BSA and no FBS;6) Add 600 ul medium containing 10% FBS to lower chamber;7) Incubate for 24 h;8) Wash the cells with PBS;9) Fix the cells with pre-chill methanol (-20);10) Stain the cells with 0.5% crystal violet diluted in 20% methanol for 10 min;11) Wash the

45、inserts with PBS 3x (Plate the insert in wells containing PBS);12) Carefully remove the cells on upper site of the membrane with cotton sticks;13) Count the cells under microscopy.Note: Medium used in this assay without PS!裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4-5周齡nu /nu裸鼠購于維通利華；裸鼠長至6-8周齡進(jìn)行腫瘤接種。所需細(xì)胞量：5 x 106 x 8只x 2=8 x 107

46、約8個(gè)10 cm plates (2倍的細(xì)胞量)細(xì)胞處理：1) 小心吸去培養(yǎng)基，10 ml PBS洗一次；2) 每個(gè)10 cm 盤加入1.5 ml 0.25%的胰蛋白酶消化，RT 5 min；3) 用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至50 ml離心管，800 rpm離心5 min；4) 吸去培養(yǎng)基，用30 ml PBS重懸細(xì)胞，充分吹成單個(gè)細(xì)胞(先加4 ml PBS吹散細(xì)胞，再加26 ml PBS上下顛倒混勻)；5) 細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后算出細(xì)胞總量，800 rpm 離心5 min，6) 用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為為5×107個(gè)/ml，吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞放置于冰上(避免冰中有水，快速低溫半小時(shí)

47、之內(nèi)接種于裸鼠體內(nèi))；7) 將細(xì)胞接種于裸鼠左臀大肌背側(cè)，100 ml/只 (即5×106細(xì)胞/只)。裸鼠接種：1) 皮下麻醉注射，酒精棉球消毒皮膚，針頭刺入，進(jìn)針4/5，即可注射，注射完成快速抽出針頭，鑷子輕鑷注射口10 s，以防細(xì)胞因壓力而溢出；2) 裸鼠接種后放回籠子做好標(biāo)記裸鼠均給予自由飲水、飲食，SPF飼養(yǎng)。腫瘤的測(cè)量:1) 接種后每天定時(shí)觀察與記錄裸鼠精神、飲食及排便等狀況，用電子天平稱量裸鼠體重；2) 用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的最大直徑(L)和最小直徑(W)，腫瘤體積用公式V = L ×W2×0.5326 計(jì)算，從第4天開始測(cè)量，之后2天測(cè)量一次，同時(shí)測(cè)

48、量體重；3) 接種20-28天后，腫瘤體積達(dá)1000-1500 mm3，裸鼠處死，取瘤稱重，腫瘤放置液氮或-80ºC保存。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)1.細(xì)胞準(zhǔn)備1）鋪3.5x105細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)24 h；2）血清饑餓24 h；3）用含10%FBS血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h；4）加入400 ul Trypsin消化細(xì)胞；5）加入含10%FBS血清終止消化，1000 rpm，5min；6）用1 ml PBS重懸細(xì)胞，1000 rpm，5min；7）小心吸走全部PBS，再準(zhǔn)確加入1 ml PBS重懸細(xì)胞（吹打30下左右）；8）轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至2.5 ml預(yù)冷的無水乙醇中，充分混勻（吹打30下左右）；9）-2

49、0°C固定過夜（我們做到此部；打包好用干冰快遞至上海營養(yǎng)所）；2.染色與檢測(cè)（上海營養(yǎng)所完成）：1）1500 rpm，5 min離心收集細(xì)胞；2）用500 ul PI-solution（用PBS將2.5 mg/ml的PI stock solution稀釋成50 ug/ml PI-solution工作液）重懸沉淀；3）加入0.1 mg/ml RNase A和0.05%Tritin X-100，37°C孵育40 min；4）加入3 ml PBS，1500 rpm，5 min；5）棄上清，500 ul PBS重懸沉淀并檢測(cè)。細(xì)胞免疫熒光染色蓋玻片的處理：酒精擦拭干凈2% HCl

50、12 h流水沖洗蒸餾水沖洗3遍95%酒精滅菌烘干除非特別說明，否則操作均在室溫進(jìn)行：1) Place sterilized coverslips into the 6-well plate.2) Add 500 µl of the gelatin-coating solution (0.1% in ddH2O) onto the coverslips and incubate for 10 min.3) Remove the gelatin-coating solution and air dry the coverslips for 15 min.4) Wash the cover

51、slips with PBS 5) Plating the cells onto the coverslips.6) Transect the cells and culture for 24 h-48 h.7) Wash the cells with PBS once and fixed them with 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS for 20 min. 8) Wash the cells briefly with ice cold PBS, 3 times.9) Block excess aldehyde groups of the ce

52、lls with 1 ml 0.1 M glycin for 10 min. 10) Wash briefly with PBS, 3 times.11) Permeablize the cells with 1 ml PBS-0.5% TX-100 for 10 min. 12) Wash 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.13) Block the cells with 1 ml 2% BSA in PBS-0.1% TX-100 (ABDB) for 10 min.14) Add 200 ml diluted primary antibod

53、y (0.5-5 mg/ml) in ABDB and incubate in a humidified chamber for 1 h at RT or at 4°C overnight.15) Wash 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.16) Add 200 ml diluted secondary antibody (1-5 mg/ml) in ABDB to the wells and incubate for 2 h in the dark.17) Rinse 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5

54、min each.18) DAPI staining: add 500 µl of the 0.5 g/ml DAPI solution (碧云天C1002, 1 ul stock+1 ml ddH2O+9 ml PBS) to each well and incubate for 1 min. 19) Rinse once with PBS and once with water.20) Carefully take out the coverslips from the wells and blot to remove any excess water.21) Give 10 m

55、l of 抗熒光淬滅封片液(碧云天 P0126) onto the glass slide. 22) Mount the coverslip with the cells facing towards the microscope slide and leave it overnight at 4°C.23) Visualize using a fluorescence microscope. Slides can also be stored in a slide box at < -20 °C for later examination.免疫組化實(shí)驗(yàn)玻片的處理：洗干凈泡酸水洗95%乙醇烘干0.05%多聚賴氨酸處理（用10 ul槍頭涂片，干了再涂，共3遍）1）組織福爾馬林固定12 h；2）組織經(jīng)組織處理機(jī)處理過夜（12-13 h）；3）石蠟包埋；4）切片機(jī)切片（4-6 um）；5）切片放進(jìn)50°C水浴，完全伸展后撈片；6）65°C固定 2 h或55&#