柱前手性衍生化反相高效液相色譜分離酮洛芬對映體

1、柱前手性衍生化反相高效液相色譜分離酮洛芬對映體要：目的：建立柱前手性衍生化反相高效液相色譜法分離酮洛芬對映體的方法。方法：分別以二氯亞砜和1，1-羰基二咪唑為?；瘎?，R-(+)-甲基芐胺作為柱前手性衍生化試劑，甲醇-0.025 molL-1磷酸二氫鉀溶液(7030)作流動相，在Shim-Pack CLC-ODS柱上反相色譜分離酮洛芬對映體衍生物，柱溫，室溫。結(jié)果：在選定的條件下，酮洛芬的對映體衍生物得到分離，并確認(rèn)了R-(-)-和S-(+)-兩個衍生物的色譜峰。結(jié)論：通過酰化，再以R-(+)-甲基芐胺為柱前手性衍生化試劑，用反相色譜法，實現(xiàn)了對酮洛芬對映體的分離。關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜法；酮

2、洛芬；對映體；R-(+)-甲基芐胺 Separation of enantiomeric ketoprofen by pre-column chiral derivatization reversed-phase HPLCZhao Hua (Zhao H)Mu Zhaode (Mu ZD)Li Huizhi (Li HZ)(Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016)ABSTRACT：OBJECTIVE：To establish a pre-column chiral derivatization reversed-pha

3、se high performance liquid chromatographic method for the separation of ketoprofen enantiomers.METHODS：Thionyl chloride and 1,1-carbonyldiimidazole were chosen as the reagents for acylation,respectively.R-(+)-methylbenzylamine as the reagent for pre-column chiral derivation to give two diastereomeri

4、c acylamide derivatives.These derivatives were separated on a Shim-Pack CLC-ODS column using MeOH-0.025 molL-1KH2PO4(7030) as the mobile phase and detected by UV detector at a wavelength of 254 nm.RESULTS：Two diastereomeric acylamide derivatives were effectively separated under the chosen conditions

5、,and two peaks were determined.CONCLUSION：A simple highly sensitive method for the separation of ketoprofen was established.It may be a suitable analysis method for ketoprofen enantiomers? pharmacology studies.It may also be a purity detective method for ketoprofen eanantiomers.KEYWORDS：RP-HPLC,keto

6、profen,enantiomer,R-(+)-Methylbenzylamine酮洛芬(ketoprofen)為2-(3-苯氧苯基)丙酸()-2-(3-benzoylphenyl)-propionic acid,是一種-芳基丙酸非甾體類抗炎藥物，臨床使用均以外消旋體形式。Mauleon等1對酮洛芬的(S)-(+)對映體的臨床前藥理和臨床藥理作了大量研究，發(fā)現(xiàn)其作用幾乎為同劑量消旋異構(gòu)體的兩倍，其高鎮(zhèn)痛強度為布洛芬的2040倍，幾乎與度冷丁相當(dāng)，對中等及劇烈疼痛均有效，且鎮(zhèn)痛作用起效迅速，無成癮性，不良反應(yīng)少，患者耐受性好。手性藥物的分離分析可采用手性固定相高效液相色譜法直接分離，但每類手性柱

7、能分離的樣品有限，且價格昂貴。對酮洛芬異構(gòu)體的分離，國外有用手性柱高效液相色譜法直接分離的報道2，也有柱前衍生化高效液相色譜法間接分離-芳基丙酸類藥物的報道34，均采用正相高效液相色譜法。作者尚未見國內(nèi)分離酮洛芬異構(gòu)體的文獻報道。本實驗分別以二氯亞砜和1，1-羰基二咪唑為?；瘎琑-(+)-甲基芐胺為手性衍生化試劑用反相高效液相色譜法分離酮洛芬對映體，獲得了滿意的結(jié)果，為酮洛芬各異構(gòu)體的藥理學(xué)研究提供了有效的分析方法，同時也為發(fā)展單一異構(gòu)體藥物提供了必須的純度檢測手段。1儀器和試劑1.1儀器島津LC-6A液相色譜儀，配用SPD-6A UV-VIS檢測器和C-R3A數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，色譜柱為島津Sh

8、im-Pack CLC-ODS柱(150 mm6.0 mm，10 m);Elgastat UHO超純水器(英國Elga公司)；Model SA720 pH計(美國Orion公司)；SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉實驗設(shè)備廠)。1.2試劑及藥品R-(+)-甲基芐胺和1，1-羰基二咪唑(CDI，Sigma公司)；()-酮洛芬和S-(+)-酮洛芬(西南合成制藥廠提供)；氯化亞砜(SOCl2)、甲醇、三氯甲烷(CHCl3)、冰醋酸、正己烷、硫酸、鹽酸和氨水均為國產(chǎn)分析純試劑：水為超純水；()-酮洛芬配制成0.1 mg.ml-1的甲醇溶液和三氯甲烷溶液備用，S-(+)-酮洛芬配制成0.1 mg.

9、ml-1的甲醇溶液備用。2方法和結(jié)果2.1實驗方法.ml-1酮洛芬的CHCl3溶液0.1 ml，加入1，1-羰基二咪唑(65 mg.ml-1CHCl3溶液)(新鮮配制)0.5 ml，旋轉(zhuǎn)混勻10 min。然后加入冰醋酸10 l，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)混勻10 min。加入R-(+)-甲基芐胺25 l，旋轉(zhuǎn)混勻25 min，再繼續(xù)反應(yīng)30 min后，向反應(yīng)液中加入0.2 ml.L-1NH3 1.0 ml，正己烷2 ml提取15 min，離心10 min(1500 r.min-1)。取有機層加0.2 mol.L-1HCl 1 ml，混勻，離心，有機層用N22氣吹干甲醇后，加入1.2%氯化亞砜正己烷溶液(新鮮配制

10、)0.1 ml，混勻，塞緊試管塞，于75水浴中反應(yīng)1 h。反應(yīng)液冷至室溫后加2% R-(+)-甲基芐胺的二氯甲烷溶液(新鮮配制)0.5 ml，75下繼續(xù)反應(yīng)15 min。反應(yīng)液冷至室溫，加入2 mol.L-1硫酸0.2 ml，正己烷2 ml，混勻，提取15 min，離心10 min (1500r.min-1)。取有機相用N2.L-1磷酸二氫鉀溶液(pH=4.45)(7030)，流速1 ml.min-1，紙速1 cm.min-1，柱溫：室溫，檢測波長：254 nm。2.2結(jié)果通過方法一、方法二，酮洛芬的對映體轉(zhuǎn)變?yōu)?個非對映異構(gòu)體衍生物，此衍生物可在反相色譜條件下分離，其色譜條件：甲醇-0.02

11、5 mol.L-1磷酸二氫鉀溶液(pH=4.45)(7030)，柱溫：室溫，流速1 ml*min-1。分離的色譜如1。1()酮洛芬與R-(+)-甲基芐胺衍生物的色譜A-方法一；B，C-方法二；1-R-(+)-酮洛芬(tR12.66 min);2-S-(+)-酮洛芬(tR 13.33 min);3-R-(+)-酮洛芬(tR 12.71 min);4-S-(+)-酮洛芬(tR13.50 min)；5-S-(+)-酮洛芬(tR 13.51 min)3討論方法一中酮洛芬與1，1-羰基二咪唑的反應(yīng)很迅速，而后一步反應(yīng)則較慢，反應(yīng)時間較長，一般不少于30 min5。盡管方法一反應(yīng)步驟稍長，且1，1-羰基二

12、咪唑的貯存條件苛刻，但實驗操作簡單，衍生效率高，重現(xiàn)性好，缺點是1，1?-羥基二咪唑不易獲得和貯存。方法二中，由于二氯亞砜是易揮發(fā)和易分解的物質(zhì)，因此二氯亞砜溶液必須新鮮配制，且操作必須嚴(yán)格，否則二氯亞砜的用量難以控制。同時，本方法的衍生化效率也不如方法一理想(相同量的酮洛芬用不同方法衍生，方法一衍生物的峰面積大于方法二衍生物的峰面積)。這可能是由于酰氯與R-(+)-甲基芐胺反應(yīng)時的產(chǎn)物中有HCl產(chǎn)生，它一方面消耗堿性的R-(+)-甲基芐胺，另一方面HCl與R-(+)-甲基芐胺生成的胺鹽抑制酰氯與R-(+)-甲基芐胺的反應(yīng)。方法二的優(yōu)點是反應(yīng)時間較短，且氯化亞砜易于獲得。為使衍生化反應(yīng)完全，酰

13、化劑和芐胺必須過量，過量的?；瘎┖推S胺與衍生物能很好的分離，不影響酮洛芬異構(gòu)體的分析。我們曾使用了pH3.08，pH5.54和pH6.47磷酸緩沖溶液配合甲醇作流動相，流動相組成均為甲醇-0.025 mol.L-1磷酸緩沖液(7030)。實驗發(fā)現(xiàn)在本文選定的分離系統(tǒng)下，上述流動相pH值的改變對各成分分離度影響不大。這可能是由于生成的酰胺堿性太弱，pH值的改變幾乎不改變其存在狀態(tài)所致。故本實驗直接選用0.025 mol.L-1的磷酸二氫鉀溶液配合甲醇作流動相，同樣可以獲得滿意的分離效果。作者單位：趙華(重慶醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)與生物材料研究室，重慶，400016)母昭德(重慶醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)與生物材

14、料研究室，重慶，400016)李惠芝(重慶醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)與生物材料研究室，重慶，400016)邱宗蔭(重慶醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)與生物材料研究室，重慶，400016)參考文獻：1Mauleon D.Preclinical and clinical development of dexketoprofen.Drugs,1996，52(Suppl 5):24.2Castellani L,Flieger M,Sinibaldi M.Enantiomer separation of 2-arylpropionic acid on an ergot alkaloid-based stationary phase mircobore column application.J Liq Chromatogr,1994,17(17):3695.3Maitre JM,Boss G,Testa B.HPLC separation of enantiomers of anti-inflammatory -arylpropionates:suitablity of the method for iv vitro metabolic studies.J Chro matogr,1984,299:397.4Hayball PJ,Na