培養(yǎng)技術課件

1、培養(yǎng)技術v高的發(fā)酵水平高的發(fā)酵水平v生產過程的穩(wěn)定生產過程的穩(wěn)定v成本控制成本控制v分類依據(jù)分類依據(jù)v一、投料方式不同：v二、發(fā)酵與氧的關系v三、菌體生長與產物合成之間關系v四、代謝方式不同一、投料方式不同1 1、分批發(fā)酵、分批發(fā)酵2 2、補料分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵3 3、連續(xù)發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵4 4、半連續(xù)發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵是指在一封閉培養(yǎng)系統(tǒng)內具有初始限制量基質的一種發(fā)酵方式 。特點：v一次性投料，經滅菌、接種后，在發(fā)酵過程中不再補料，直到放罐。v整個過程中菌濃、營養(yǎng)成分和產物濃度等參數(shù)都隨時間變化。分批發(fā)酵中微生物的生長分批發(fā)酵中微生物的生長遲滯期遲滯期對數(shù)生長期對數(shù)生長期穩(wěn)定期穩(wěn)定期死亡期死

2、亡期遲滯期：菌體沒有分裂只有生長，細胞形態(tài)變大，菌種進入新環(huán)境，細胞內核酸、酶等稀釋，細胞不能分裂；對數(shù)生長期：細胞內與分裂相關的物質達到一定程度，細胞生長代謝活性最強，細胞開始分裂，呈幾何級數(shù)增加；穩(wěn)定期：培養(yǎng)液中營養(yǎng)物減少，廢物積累，生長速率下降，生成率等于死亡率，細胞總數(shù)最高，細胞開始積累貯存物；死亡期： 細胞死亡率大于生成率，有些細胞開始自溶。對于初級代謝產物，在對數(shù)生長期初期就開始合成并積累；而對于次級代謝產物，則在對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期大量合成。優(yōu)點：操作簡單，周期短，染菌機會少，優(yōu)點：操作簡單，周期短，染菌機會少，生產過程和產品質量易掌握生產過程和產品質量易掌握缺點：產率低缺點：

3、產率低 也稱半連續(xù)培養(yǎng)、流加培養(yǎng)，它是以分批培養(yǎng)為基礎，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的一種發(fā)酵方法。特點:v一次或多次補入新鮮料液，延長產物合成周期，提高產量；v只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結束時發(fā)酵液體積比開始時有所增加。v連續(xù)流加、不連續(xù)流加、多周期流加；v快速流加、恒速流加、指數(shù)速率流加、變速流加；v單組分補料和多組分補料等?；|濃度低，避免快速利用碳源的阻遏效應；避免在培養(yǎng)基中積累有毒代謝物，即代謝阻遏；避免分批發(fā)酵中因一次投料過多造成細胞大量生長所引起的不良影響，降低發(fā)酵液粘度；維持適當?shù)木w濃度，使不致于加劇供氧矛盾；可以通過補料控制達到最佳的生長和產物合成條件；還可以利用

4、計算機控制合理的補料速率，穩(wěn)定最佳生產工藝。優(yōu)點：優(yōu)點：v沒有物料取出，v產物的積累導致生產速率下降；v染菌機會增加。v發(fā)酵過程中，一邊補入新鮮無菌料液，一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內的體積維持恒定。v達到穩(wěn)態(tài)后，菌體濃度、產物濃度，限制性基質濃度都是恒定的，不隨時間而變化。優(yōu)點：發(fā)酵條件穩(wěn)定自動化程度高設備效率高設備使用壽命長易于優(yōu)化發(fā)酵過程易引起菌種退化；染菌機會大大增加；對設備要求高菌體有掛壁和成團問題v 雜菌污染問題v 生產菌株突變問題連續(xù)培養(yǎng)過程中的主要問題連續(xù)培養(yǎng)過程中的主要問題v連續(xù)發(fā)酵過程中，需要長時間連續(xù)不斷地向發(fā)酵系統(tǒng)供給無菌的新鮮空氣和培養(yǎng)基，這就不可避免地發(fā)生雜菌污染

5、問題。v雜菌污染問題是連續(xù)培養(yǎng)中難以解決的問題。 v微生物在復制過程中難免會出現(xiàn)差錯引起突變，如果突變的結果使這一細胞獲得在給定條件下高速生長的能力，那么它就有可能像雜菌一樣，取代系統(tǒng)中原來的生產菌株，而使連續(xù)發(fā)酵過程失敗。 在補料分批培養(yǎng)的基礎上間歇放掉部分發(fā)酵液；四環(huán)素發(fā)酵常用。v優(yōu)點：放掉部分發(fā)酵液，再補入部分料液，使代謝有害物得以稀釋，有利于產物合成，提高產量。v缺點：代謝產生的前體物被稀釋，提取的總體積增大。1、需氧發(fā)酵：抗生素、氨基酸等；2、厭氧發(fā)酵：乙醇、丙酮、乳酸等。1、生長關聯(lián)型發(fā)酵2、生長部分關聯(lián)型發(fā)酵3、非生長關聯(lián)型發(fā)酵v產物直接來源于產能的初級代謝，菌體生長、糖的分解和

6、產物的形成幾乎是平行的；v單細胞蛋白、葡萄糖酸的發(fā)酵。 產物的形成和菌體的生長相偶聯(lián)產物的形成和菌體的生長相偶聯(lián)xp X（菌體）（菌體） P（產物）（產物）v第一階段：菌體生長階段；v第二階段：產物合成階段。v檸檬酸發(fā)酵。 產物的形成和菌體的生長部分偶聯(lián)產物的形成和菌體的生長部分偶聯(lián)xp X（菌體）（菌體） P（產物）（產物）v第一階段：菌體生長階段；v第二階段：產物合成階段。v抗生素、氨基酸發(fā)酵。 產物的形成和菌體的生長非偶聯(lián)產物的形成和菌體的生長非偶聯(lián)xp X（菌體）（菌體） P（產物）（產物）1、初級代謝產物發(fā)酵2、次級代謝產物發(fā)酵生物細胞在生命活動過程中進行的與菌體的生長、繁殖相關的一

7、類代謝活動。微生物合成的主要供給細胞生長的一類物質，如氨基酸、核苷酸、乙醇、有機酸、多羥基化合物、糖類和維生素等。v菌體進入發(fā)酵罐，其生長表現(xiàn)出：延遲期、對數(shù)生長期、靜止期、死亡期等生長史的特征；v對數(shù)生長期的菌種移植到與原培養(yǎng)基組成完全相同的新培養(yǎng)基中，就不會出現(xiàn)延遲期；v為了縮短延遲期，宜接種對數(shù)生長期（中期）的菌種；v為了獲得代謝產物，菌體尚未達到死亡期即行放罐。7.2 工業(yè)發(fā)酵過程的主要控制參數(shù) 微生物發(fā)酵的生產水平取決于微生物發(fā)酵的生產水平取決于生產菌種的特生產菌種的特性性和和發(fā)酵條件的控制發(fā)酵條件的控制。 了解發(fā)酵工藝條件對過程的影響和掌握反映了解發(fā)酵工藝條件對過程的影響和掌握反映

8、菌的生理代謝和發(fā)酵過程變化的規(guī)律，可以幫助菌的生理代謝和發(fā)酵過程變化的規(guī)律，可以幫助人們有效地控制微生物的生長和生產。人們有效地控制微生物的生長和生產。常規(guī)的發(fā)酵條件：常規(guī)的發(fā)酵條件：罐溫罐溫攪拌轉速攪拌轉速攪拌功率攪拌功率空氣流量空氣流量罐壓罐壓液位液位補料補料加糖、油或前體加糖、油或前體通氨速率以及補水等通氨速率以及補水等v測定發(fā)酵過程中測定發(fā)酵過程中數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，以便對此過程進行，以便對此過程進行有效的控制有效的控制v具體目的：過程變量與預期是否一致，決具體目的：過程變量與預期是否一致，決定種子罐移種時間與放罐時間，對不可測定種子罐移種時間與放罐時間，對不可測變量進行估計，手動或自動控制，計

9、算機變量進行估計，手動或自動控制，計算機控制，收集控制，收集數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)vpHpH、溶氧（、溶氧（DODO）、溶解）、溶解CO2CO2、氧化還原電位、氧化還原電位、尾氣尾氣O2O2和和CO2 CO2 含量、基質或產物濃度、代含量、基質或產物濃度、代謝中間物或前體濃度、菌濃等。謝中間物或前體濃度、菌濃等。v間接狀態(tài)參數(shù)：間接狀態(tài)參數(shù)：v比生長速率、攝氧率、釋放速率（比生長速率、攝氧率、釋放速率（CERCER）、）、呼吸商（呼吸商（RQRQ）、基質消耗速率和產物合成）、基質消耗速率和產物合成速率等。速率等。v物理測量物理測量：溫度、壓力、體積、流量等v物理化學物理化學：pH、溶氧、溶CO2、氧化還原電

10、位、氣相成分分析等v化學測量化學測量：基質、前體、產物等的濃度v生物生化生物生化：生物量、細胞形態(tài)、酶活性、胞內成分等v提供反映環(huán)境和細胞代謝生理變化的許多信息提供反映環(huán)境和細胞代謝生理變化的許多信息v直接參數(shù)：通過儀器或其它分析手段可以測得的參數(shù)，如溫度、pH、殘?zhí)堑?；v間接參數(shù)：將直接參數(shù)經過計算得到的參數(shù)，如攝氧率、KLa等。v 離線檢測離線檢測：不安裝在發(fā)酵罐內，人工取樣v 在線檢測在線檢測：自動測定，流動注射分析系統(tǒng)（FIA），（HPLC）或質普儀等v原位檢測原位檢測：直接與發(fā)酵液接觸，給出連續(xù)的響應信號，如溫度、壓力、pH、溶氧等，信號不受操作者干擾，直接輸入計算機v在線和原位檢測

11、必須用專門的傳感器（也叫電極或探頭）放入發(fā)酵系統(tǒng)，將發(fā)酵的一些信息傳遞出來，為發(fā)酵控制提供依據(jù)。轉換器類型轉換器類型檢測對象檢測對象生物學元件生物學元件檢測信號檢測信號安培計安培計葡萄糖葡萄糖氧化酶H2O2酒精乙醇氧化酶H2O2乳酸乳酸脫氫酶NADH葡萄糖Pseudo. FluorescensO2AMPAMP脫氫酶O2電位計電位計尿素脲酶NH4+GluE.coliCO2青霉素青霉素酶H+熱敏電阻熱敏電阻Vc抗壞血酸氧化酶熱量乙醇醇氧化酶熱量帶計算機數(shù)據(jù)采集與控制的反應器帶計算機數(shù)據(jù)采集與控制的反應器P188原理：化學或物理信號原理：化學或物理信號 電信號電信號 放大放大 記錄顯示儀記錄顯示儀

12、控制器（與設定參數(shù)比較）控制器（與設定參數(shù)比較） 發(fā)出調節(jié)信號發(fā)出調節(jié)信號 控制器動作控制器動作測定元件測定元件：如溫度計、壓力表、電流計、pH計，直接測定發(fā)酵過程各種參數(shù)，并輸出相應信號。控制部分：控制部分：將測定元件測出的各種信號與預先確定值進行比較，并輸出信號指令執(zhí)行元件進行調整控制。執(zhí)行元件執(zhí)行元件：接受控制部分的指令，開啟或關閉有關閥門、泵等調節(jié)控制機構，使有關參數(shù)達到預定位置。變量變量測量方法測量方法測量原理測量原理溫度溫度鉑電阻電阻隨溫度變化熱敏電阻電阻隨溫度變化壓力壓力隔膜直接感受連模壓敏電阻電阻隨壓力變化體積體積壓差傳感器靜壓差與液深度正比荷重傳感器傳感器電阻正比于荷重泡沫泡

13、沫電導或電容探頭與液面及電磁閥成回路氣體流量氣體流量熱質量流量計氣體帶走熱與流量成正比液體流量液體流量蠕動泵轉速與流量正比連攪拌轉速攪拌轉速頻率計數(shù)器頻率計數(shù)器光反射計數(shù)光反射計數(shù)轉速表轉速表感應電流與轉速正比感應電流與轉速正比pH玻璃電極玻璃電極電極對氫離子特異反應電極對氫離子特異反應溶氧溶氧復膜氧探頭復膜氧探頭氧在電極轉移產生電流氧在電極轉移產生電流溶溶CO2CO2探頭探頭通過擴散引起電解液通過擴散引起電解液pH變化變化粘度粘度旋轉黏度儀旋轉黏度儀剪應力剪應力/剪速黏度剪速黏度生物量濁度法生物量濁度法入射光細胞散射衰減間歇入射光細胞散射衰減間歇基質和代謝物基質和代謝物HPLC對各成分分析間

14、模對各成分分析間模細胞形態(tài)細胞形態(tài)射像顯微鏡射像顯微鏡顯微射像技術顯微射像技術發(fā)酵是純培養(yǎng)過程，無菌要求高，發(fā)酵是純培養(yǎng)過程，無菌要求高，對傳感器有特殊要求：對傳感器有特殊要求：l能經受高壓蒸汽滅菌；能經受高壓蒸汽滅菌；l結構不能存在滅菌不透的死角，以防染結構不能存在滅菌不透的死角，以防染菌（密封性好）；菌（密封性好）；l對測量參數(shù)要敏感，且能轉換成電信號。對測量參數(shù)要敏感，且能轉換成電信號。（響應快、靈敏）；（響應快、靈敏）；l性能要穩(wěn)定，受氣泡影響小。性能要穩(wěn)定，受氣泡影響小。幾種常用的在線檢測的傳感器幾種常用的在線檢測的傳感器 lpH電極電極l溶氧電極溶氧電極它們是基礎電極，以它們?yōu)樗鼈?/p>

15、是基礎電極，以它們?yōu)榛A可以制作各種離子電極基礎可以制作各種離子電極和酶電極和酶電極實例實例pH測量測量 傳統(tǒng)：傳統(tǒng)：pH試紙試紙優(yōu)點：方便，易操作。優(yōu)點：方便，易操作。缺點：主觀性較強；缺點：主觀性較強； 質量差異大，不同廠家不同批號質量差異大，不同廠家不同批號的的pH試紙測出的試紙測出的pH值差別有時甚至達值差別有時甚至達0.51?，F(xiàn)代：現(xiàn)代：pH電極電極溶氧電極溶氧電極v流速調整幅度大(從0.1ml/h-5L/h)，可變速蠕動泵，占空比可調整的開關控制。高效液相（高效液相（HPLC）分析代謝中間產物，通過中間代謝產物的分析代謝中間產物，通過中間代謝產物的測定，可以深入了解微生物代謝的流向

16、，測定，可以深入了解微生物代謝的流向，以此來分析代謝的情況，從而有的放矢的以此來分析代謝的情況，從而有的放矢的控制發(fā)酵過程。控制發(fā)酵過程。v物理參數(shù)：v化學參數(shù)：v生物參數(shù)：v溫度、v壓力、v攪拌轉速、v攪拌功率、v空氣流量、v粘度；vPH值、v基質濃度、v溶解氧濃度、v氧化還原電位、v產物的濃度、v廢氣中氧、v二氧化碳的含量；v菌體濃度、v菌絲形態(tài)微生物如同一個微小的容器，原料中的反應物透過微生物細胞周圍的細胞壁和細胞膜進入微生物體內，把反應物轉化為產物，接著這些產物又被釋放出來；微生物是生物反應過程的催化劑，催化原料轉化為有用的產品 。 微生物的生長現(xiàn)象與繁殖方式微生物的生長現(xiàn)象與繁殖方式

17、類類 別別生長特征生長特征繁殖方式繁殖方式細菌細菌個體增重和增大個體增重和增大分裂繁殖分裂繁殖放線菌、霉放線菌、霉菌菌菌絲伸長和分支菌絲伸長和分支霉菌霉菌-無性孢子、無性孢子、有性孢子有性孢子酵母菌酵母菌個體增重和增大個體增重和增大出芽生殖出芽生殖放線菌放線菌-無性孢子無性孢子v微生物的數(shù)量、狀態(tài)、代謝情況對產物的生物合成有著重要的影響。v菌體濃度（菌濃）：指單位體積的培養(yǎng)液中菌體的含量；v一般：前期菌濃增長快，中期菌濃基本恒定，補料會引起菌濃波動，這是衡量補料量適合與否的一個參數(shù)。v微生物生長的測定，通常測群體的重量或細胞數(shù)，而不是測細胞個體的重量或大小。 v生長測定的常用理化方法，分為測定

18、細胞數(shù)和細胞重量兩類。 v濁度計比濁法：測定稀的細胞懸液的透光量，間接測出細胞數(shù)；v計數(shù)器計數(shù)法：在顯微鏡下用血球計數(shù)器直接數(shù)出酵母菌或霉菌孢子數(shù)目，以及用細菌計數(shù)片直接測出細菌數(shù)。v細胞干重稱量法 直接測定單位體積培養(yǎng)物的細胞干重，由此代表菌體細胞物質總量v細胞堆積容積測量法 用錐形刻度管測量經離心的細胞沉淀物的容積 ，由此間接表示細胞重量 v細胞組成分析法 測定一種大分子的細胞組成(蛋白質、RNA、DNA等)，間接地算出細胞重量v營養(yǎng)物消耗分析法 測定培養(yǎng)基中不用于合成代謝產物的營養(yǎng)物（磷酸鹽、硫酸鹽等）的消耗，間接表示細胞重量的生長 v產物重量分析法 測定培養(yǎng)中途形成的二氧化碳，氫，ATP等產物，由此間接地換算出細胞重量的生長顯微鏡觀察v發(fā)酵液中各種營養(yǎng)物質的濃度，特別是碳氮比、無機鹽和維生素的濃度，會直接影響菌體的生長和代謝產物的積累。v如：半乳糖苷可使大腸桿菌-半乳糖苷酶的產量增加1000倍； 枯草桿菌既產淀粉酶，又產蛋白酶，提供葡萄糖，只產生蛋白酶。黑曲霉檸檬酸發(fā)酵v蔗糖濃度15%-18%，蔗糖同化率97%；v蔗糖濃度20%，只同化9