微生物細胞的破碎ppt課件

1、第三章、微生物細胞的破碎l微生物的代謝產物有的分泌到細胞或組織之外，微生物的代謝產物有的分泌到細胞或組織之外，稱為胞外產物。稱為胞外產物。( (例如細菌產生的堿性蛋白酶，霉例如細菌產生的堿性蛋白酶，霉菌產生的糖化酶等菌產生的糖化酶等) )l還有許多是存在于細胞內還有許多是存在于細胞內( (例如青霉素酰化酶，堿例如青霉素酰化酶，堿性磷酸酯酶等性磷酸酯酶等) )稱為胞內產物。稱為胞內產物。l對于胞外產物只需直接將發(fā)酵液預處置及過濾，對于胞外產物只需直接將發(fā)酵液預處置及過濾，獲得廓清的濾液，作為進一步純化的出發(fā)原液，獲得廓清的濾液，作為進一步純化的出發(fā)原液，l對于胞內產物，那么需首先搜集菌體進展細胞

2、破對于胞內產物，那么需首先搜集菌體進展細胞破碎，使代謝產物轉入液相中，然后，再進展細胞碎，使代謝產物轉入液相中，然后，再進展細胞碎片的分別。碎片的分別。 細胞壁的組成和構造細胞壁的組成和構造l 細胞破碎是為了破壞細胞外圍使細胞內含物釋放出來。微生物的細胞外圍通常包括細胞壁和細胞膜。 l 細胞膜使細胞內外堅持一定的濃度差，它主要由蛋白質和脂質組成，強度比較差，易受浸透壓沖擊而破碎。細胞破碎的主要阻力來自于細胞壁。細菌的細胞壁細菌的細胞壁l 幾乎一切細菌的細胞壁都是由鞏固的骨架肽聚糖組成，是由肽聚糖鏈借短肽交聯(lián)而成，使細胞具有一定的外形和強度。l短肽普通由四或五個氨基酸組成，如L丙氮酸D谷氨酸L賴

3、氨酸D丙氨酸。l肽聚糖鍵是N乙酰葡萄糖胺和N乙酰胞壁酸交替地經過l4糖苷鍵聯(lián)接而成。短肽接在N乙酰胞壁酸上，相鄰的短肽又交叉相聯(lián)，構成了網狀構造。革蘭氏陽性菌的細胞壁l革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚151550 nm50 nm，肽聚，肽聚糖占糖占4040一一9090，其他是多糖和磷壁酸，其他是多糖和磷壁酸，l 革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄1.51.52.0nm2.0nm，最外面還有一較厚的外壁層最外面還有一較厚的外壁層810 nm810 nm，外壁，外壁層主要由脂蛋白，脂多糖組成。層主要由脂蛋白，脂多糖組成。l 破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網狀構

4、造，破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網狀構造，其網構造的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存其網構造的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的膚鍵的數量和其交聯(lián)的程度，假設交聯(lián)程度在的膚鍵的數量和其交聯(lián)的程度，假設交聯(lián)程度大，那么網構培育致密。大，那么網構培育致密。酵母菌的細胞壁酵母菌的細胞壁l主要成分為葡聚糖與甘露聚糖以及蛋白質等，比主要成分為葡聚糖與甘露聚糖以及蛋白質等，比革蘭氏陽性菌稍厚，而且其厚度隨菌齡添加而添革蘭氏陽性菌稍厚，而且其厚度隨菌齡添加而添加。加。l細胞壁的最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構細胞壁的最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的外形成了細

5、胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的外形l覆蓋在細纖維上面的是一層糖蛋白，覆蓋在細纖維上面的是一層糖蛋白，l再外面是由再外面是由1 1，6 6磷酸二酯鍵共價銜接而成網狀磷酸二酯鍵共價銜接而成網狀構造的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的復合物，它構造的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的復合物，它可以共價銜接到網狀構造上，也可以不銜接?？梢怨矁r銜接到網狀構造上，也可以不銜接。真菌的細胞壁真菌的細胞壁l大多數真菌的多糖壁，主要存在三種聚合大多數真菌的多糖壁，主要存在三種聚合物，葡聚糖主要以物，葡聚糖主要以1313鍵銜接，鍵銜接，某些以某些以l6l6鍵銜接，幾丁質鍵銜接，幾丁質以微纖維形狀存在以微纖維形狀存在, ,糖蛋白。糖

6、蛋白。l真菌細胞壁的強度和聚合物的網狀構造有真菌細胞壁的強度和聚合物的網狀構造有關關l它還含有幾丁質或纖維素的纖維狀構造，它還含有幾丁質或纖維素的纖維狀構造，所以強度有所提高。所以強度有所提高。細胞壁的構造和細胞的破碎細胞壁的構造和細胞的破碎l破碎細胞，必需抑制的主要阻力是網狀構破碎細胞，必需抑制的主要阻力是網狀構造的共價鍵。造的共價鍵。l在用酶法或化學法來溶解細胞壁時，細胞在用酶法或化學法來溶解細胞壁時，細胞壁的構造和組成顯得特別重要，可用來作壁的構造和組成顯得特別重要，可用來作為選擇溶菌酶和化學方法的根據。為選擇溶菌酶和化學方法的根據。 微生物細胞的破碎技術機械方法球磨機 高壓勻漿器 X-

7、press法 超聲波破碎 非機械方法 酶解浸透壓沖擊凍結和融化枯燥法化學法l球磨機球磨機l 研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一同快速液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一同快速攪拌或研磨，使到達細胞的某種程度破碎。攪拌或研磨，使到達細胞的某種程度破碎。這些安裝的主要缺陷是在破碎期間樣品溫這些安裝的主要缺陷是在破碎期間樣品溫度迅速升高，經過用二氧化碳來冷卻容器度迅速升高，經過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分處理。可得到部分處理。球磨機球磨機l高壓勻漿器高壓勻漿器l 采用高壓勻漿器采用高壓勻漿器是大規(guī)模破碎細胞的是大規(guī)模破碎細胞的常用方法，利用

8、高壓常用方法，利用高壓迫使細胞懸浮液經過迫使細胞懸浮液經過針形閥，由于忽然減針形閥，由于忽然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)壓和高速沖擊撞擊環(huán)呵斥細胞破裂呵斥細胞破裂高壓勻漿法 l適用于酵母菌、大腸桿菌、宏大芽孢桿菌適用于酵母菌、大腸桿菌、宏大芽孢桿菌和黑曲霉等。不適用于高度分枝的微生物。和黑曲霉等。不適用于高度分枝的微生物。 X-press法法一種改良的高壓方法是將濃縮的菌體一種改良的高壓方法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至懸浮液冷卻至-25C至至-30 C構成冰晶構成冰晶體，利用體，利用500 MPa以上的高壓沖擊，以上的高壓沖擊，冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰

9、晶體的磨損，包埋在冰破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。中的微生物的變形所引起的。該法的優(yōu)點是適用的范圍廣，破碎率該法的優(yōu)點是適用的范圍廣，破碎率高，細胞碎片的粉碎程度低以及活性高，細胞碎片的粉碎程度低以及活性的保管率高，的保管率高，該法對冷凍該法對冷凍融解敏感的生化物質不融解敏感的生化物質不適用。適用。 超聲波法細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產生一個極為劇烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質中的懸浮細胞上呵斥了剪切應力，促使細胞內液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。對于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處置的效果不同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細胞比革蘭氏陽性菌細胞容

10、易破碎，對酵母菌的效果級差。該法不適于大規(guī)模操作，由于放大后，要輸入很高的能量來提供必要的冷卻，這是困難的。超聲波破碎儀酶解法l利用酶反響，分解破壞細胞壁上特殊的鍵，利用酶反響，分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而到達破壁的目的。從而到達破壁的目的。l優(yōu)點：專注性強，發(fā)生酶解的條件溫暖。優(yōu)點：專注性強，發(fā)生酶解的條件溫暖。l缺陷：酶水解費用較貴，普通只適用于小缺陷：酶水解費用較貴，普通只適用于小規(guī)模的實驗室研討。規(guī)模的實驗室研討。l溶菌酶是運用最多的酶，它能專注地分解溶菌酶是運用最多的酶，它能專注地分解細胞壁上糖蛋白分子的細胞壁上糖蛋白分子的-1-1，4 4糖苷鍵，使糖苷鍵，使脂多糖解離，經溶菌酶處

11、置后的細胞移至脂多糖解離，經溶菌酶處置后的細胞移至低滲溶液中使細胞破裂低滲溶液中使細胞破裂自溶作用自溶作用l是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是由是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是由微生物本身產生的。微生物本身產生的。l影響自溶過程的要素有溫度、時間、影響自溶過程的要素有溫度、時間、pHpH緩緩沖液濃度、細胞代謝途徑等。沖液濃度、細胞代謝途徑等。l自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但是，對不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白是，對不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質的變性，自溶后的細胞培育液過濾速度質的變性，自溶后的細胞培育液過濾速度也會降低。也會降低。 浸透壓沖擊l是

12、較溫暖的一種破碎方法，將細胞放在高是較溫暖的一種破碎方法，將細胞放在高浸透壓的介質中浸透壓的介質中( (如一定濃度的甘油或蔗糖如一定濃度的甘油或蔗糖溶液溶液) )，入到達平衡后，介質被忽然稀釋，入到達平衡后，介質被忽然稀釋，或者將細胞轉入水或緩沖液中，由于浸透或者將細胞轉入水或緩沖液中，由于浸透壓的忽然變化，水迅速進入細胞內，引起壓的忽然變化，水迅速進入細胞內，引起細胞壁的破裂。細胞壁的破裂。l浸透壓沖擊的方法僅對細胞壁較脆弱的菌，浸透壓沖擊的方法僅對細胞壁較脆弱的菌，或者細胞壁預先用酶處置，或合成受抑制或者細胞壁預先用酶處置，或合成受抑制而強度減弱時才是適宜的。而強度減弱時才是適宜的。 凍結

13、-融化法l將細胞放在低溫下忽然冷凍和室溫下融化，將細胞放在低溫下忽然冷凍和室溫下融化，反復多次而到達破壁作用。反復多次而到達破壁作用。l對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低即使反復循環(huán)多次也不但通常破碎率很低即使反復循環(huán)多次也不能提高收率。能提高收率。l另外，還能夠引起對凍融敏感的某些蛋白另外，還能夠引起對凍融敏感的某些蛋白質的變性。質的變性。枯燥法l可采用空氣枯燥，真空枯燥，噴霧枯燥和可采用空氣枯燥，真空枯燥，噴霧枯燥和冷凍枯燥等。冷凍枯燥等。l空氣枯燥主要適用于酵母菌。真空枯燥適空氣枯燥主要適用于酵母菌。真空枯燥適用于細菌的枯燥。冷凍枯燥

14、適用于較不穩(wěn)用于細菌的枯燥。冷凍枯燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質。定的生化物質。l枯燥法條件變化較猛烈，容易引起蛋白質枯燥法條件變化較猛烈，容易引起蛋白質或其它組織變性。或其它組織變性。化學法l用酸堿及外表活性劑處置，可以使蛋白質用酸堿及外表活性劑處置，可以使蛋白質水解，細胞溶解或使某些組分從細胞內滲水解，細胞溶解或使某些組分從細胞內滲漏出來。漏出來。l某些脂溶性溶劑也能作為化學處置的方法，某些脂溶性溶劑也能作為化學處置的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，這如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，這些試劑容易引起生化物質破壞，還會帶來些試劑容易引起生化物質破壞，還會帶來分別和回收化學物質的問題。分

15、別和回收化學物質的問題。 破碎方法的選擇l選擇適宜的破碎方法需求思索以下要素：選擇適宜的破碎方法需求思索以下要素：l細胞的數量；細胞的數量；l所需求的產物對破碎條件所需求的產物對破碎條件(溫度、化學試劑、溫度、化學試劑、酶等酶等)的敏感性；的敏感性；l要到達的破碎程度及破碎所必要的速度，要到達的破碎程度及破碎所必要的速度，l盡能夠采用最溫暖的方法；盡能夠采用最溫暖的方法；l具有大規(guī)模運用潛力的生化產品應選擇適具有大規(guī)模運用潛力的生化產品應選擇適宜于放大的破碎技術。宜于放大的破碎技術。 破碎率的評價破碎率的評價 l破碎率的評價破碎率的評價l細胞破碎率定義為被破碎細胞的數量占原始細胞細胞破碎率定義

16、為被破碎細胞的數量占原始細胞數量的百分比數，即：數量的百分比數，即：l Y(%)=(N0-N)/N0100lN0原始細胞數量原始細胞數量 lN經經t時間操作后保管下來的未損害完好細胞數時間操作后保管下來的未損害完好細胞數量量l 目前目前N0和和N主要經過下面的方法獲得主要經過下面的方法獲得 各種破碎方法的評述各種破碎方法的評述 l高壓均漿和珠磨兩種機械破碎方法，處置高壓均漿和珠磨兩種機械破碎方法，處置量大，速度非?？欤壳霸诠I(yè)生長上運量大，速度非常快，目前在工業(yè)生長上運用最廣泛。但在機械法破碎過程中，容易用最廣泛。但在機械法破碎過程中，容易產生大量的熱量，使料液溫度升高，而易產生大量的熱量，

17、使料液溫度升高，而易呵斥生化物質的破壞，特別是在超聲波處呵斥生化物質的破壞，特別是在超聲波處置時。因此，超聲波振蕩法主要適用于實置時。因此，超聲波振蕩法主要適用于實驗室或小規(guī)模的細胞破碎。驗室或小規(guī)模的細胞破碎。l 各種破碎方法的評述各種破碎方法的評述 l非機械法普通僅適用于小規(guī)模運用。浸透壓沖擊和凍結融解法都屬于較溫暖的方法，但破碎作用較弱它們常與酶解法結合起來運用，提高破碎效果。枯燥法屬于較猛烈的一種破碎方法，容易引起蛋白質或其它組分變性. 破碎方法的選擇根據破碎方法的選擇根據l處置量處置量l高壓勻漿和珠磨機處置量大，速度快，適用于工業(yè)消費高壓勻漿和珠磨機處置量大，速度快，適用于工業(yè)消費l產物對破碎條件溫度、化學試劑、酶等的敏感性以及產物對破碎條件溫度、化學試劑、酶等的敏感性以及產物在細胞中的位置產物在細胞中的位置l生化物質的穩(wěn)定性生化物質的穩(wěn)定性l細胞的數量和細胞壁的強度細胞的數量和細胞壁的強度l破碎程度破碎程度l提取分別的難易提取分別的難易l總之，適宜的細胞破碎條件應該從高的產物釋放率、低的總之，適宜的細胞破碎條件應該從高的產物釋放率、低的能耗和便于后續(xù)提取這三方面進展權衡。能耗和便于后續(xù)提取這三方面進展權