中草藥論文達(dá)肝清對小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究-寫手聯(lián)盟

1、中草藥論文|達(dá)肝清對小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究-寫手聯(lián)盟    達(dá)肝清是根據(jù)中醫(yī)基本理論及方劑組方原則提出的、以治療乙型肝炎病毒感染為主的自擬方,由三姐妹(Rabdosia ternifold)、葉下珠(Phyllanthus urinariaL. )、絞股藍(lán) (Gynostemma pentaphyllum( Thunb ) Makino. )、黃芪 (Astragalusmembracsaus(Fisch) Bunge)等中草藥制成,有解毒、利濕化瘀、益氣健脾、扶正護(hù)肝之功。體外研究表明,達(dá)肝清對2215細(xì)胞分泌HBsAg和HbeAg均具有一定的抑制

2、作用1。為探索其對正?；蛎庖咭种菩∈竺庖吖δ苡袩o調(diào)節(jié)作用,研究了達(dá)肝清對小鼠免疫功能的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。/ P# y8 1 w: D- Y        1材料與方法/ & I% M- P  D1 o4 w9 x        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠120只,雌雄兼用,體重(20±2)g,廣西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號:桂醫(yī)動(dòng)第11004號。8 u: , c  M9 D" Q# u      &#

3、160; 1.2藥物與主要試劑達(dá)肝清水煎劑,由廣西中醫(yī)學(xué)院中藥教研室制備(低壓濃縮至每毫升含3. 3 g生藥), 4冰箱保存,用時(shí)用蒸餾水配成所需濃度。MTT試劑盒(R D SYSTEMS,批號: 7808E4);刀豆蛋白A (ConA,美國Sigma公司,批號+ P5 G1 b( d, A- 9 x( t- W. j        1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 MultiskanMK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司); Forma 311 型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司); FJ-2008P型γ放射免疫計(jì)數(shù)器(西安國營二六二廠); 72

4、2型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠);AE260型電子天平(瑞士Mettler); B4i型離心機(jī)(美國Thermo公司)。3 f' n0 _# j! k3 R        1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法2-3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2×6組,每組10只。1組為正常對照,NS 0. 4mL·d-1·鼠-1,po,共10 d; 2組為達(dá)肝清對照,達(dá)肝清10 g·kg-1·d-1,po,共10 d; 36組用CTX造模, CTX60 mg&m

5、iddot;Kg-1·d-1,腹腔注射( ip),于實(shí)驗(yàn)的3, 5, 7 d給 3次; 46組分別加用不同劑量達(dá)肝清,分別為(5, 10, 20 g) ·kg-1·d-1,po。末次給藥后24 h內(nèi)檢測指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)分兩批進(jìn)行。3 b: A( o8 k7 f  h) f. 1 r        1.5免疫器官重量測定4 末次給藥后5 h脫頸椎處死小鼠,取完腹腔液后解剖小鼠取出胸腺和脾臟,于電子天平上稱重。免疫器官系數(shù)=免疫器官重量(mg)10 g體重。! Y" c

6、" q0 1 j( 6 Q8 ': W+ s        1.6血清溶血素測定5-6 于給藥第3天和第8天各組小鼠分別ip10% GRBC每 10 g體重0. 1 mL致敏,末次給藥后2 h摘眼球取血,室溫下放置1 h, 3 000 r·min-1離心10 min分離血清,經(jīng)5630 min水浴滅活補(bǔ)體后用溶血試驗(yàn)測定血清溶血素含量,用 722分光光度計(jì)于540 nm處讀取A值,以實(shí)驗(yàn)管A值與 50%溶血管A值之比作為溶血素值。每個(gè)標(biāo)本均行雙管測定,取平均OD值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1 ) * V) J" O/

7、 n9 R1 h:         1.7巨噬細(xì)胞活性測定7 末次給藥后5 h脫頸椎處死小鼠, ip注入5 mL冷Hank 液,輕揉腹部數(shù)分鐘后剖腹,無菌吸取腹腔液,裝入含肝素的離心管中, 2 000 r·min-1離心10 min,吸棄上清液,再用 10%NCS-RPMI 1640液5 mL重懸,共2次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每毫升5×106個(gè),加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100μL,每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔, 375% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h使巨噬細(xì)胞貼壁。然后用10% NCS-RPMI1640液洗3次,每孔

8、加 0. 072%中性紅100μL, 375% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用PBS (pH 7. 4)洗3次。每孔加脫色劑(v/v:無水乙醇/冰醋酸 11)100μL,室溫放置1 h后振蕩混勻,用酶標(biāo)儀于A530 nm 處測A值。結(jié)果以3個(gè)復(fù)孔的-x±s表示。4 " R1 y" b: h8 F! W! l+ W        1.8血清IL-2含量測定按上述方法制備血清,用125I-IL-2 RIA放射免疫法測定血清IL-2含量。操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。- ?1 s! G6 V; h4

9、 Q# V        1.9抗體形成細(xì)胞(AFC)測定用定量溶血分光光度法測定抗體形成細(xì)胞8-9。末次給藥后5 h脫頸椎處死小鼠,無菌操作取出脾臟,制成脾細(xì)胞備用。用時(shí)配成每毫升2×106脾細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率>95%。取脾細(xì)胞懸液、補(bǔ)體和0. 2% GRBC各1 mL混勻, 37水浴1 h,離心取上清,用722分光光度計(jì)于 540 nm處讀取A值,以實(shí)驗(yàn)管A值與50%溶血管A值之比作為AFC值。每個(gè)標(biāo)本均行雙管測定,取均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。( U+ y: I& o" K3 c( M3 V

10、0;       1.10T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測定(MTT法)3, 10-11 取上述制備的脾細(xì)胞制成每毫升5×106脾細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率>95%。取脾細(xì)胞懸液100μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔,加入終濃度為 5μg·mL的ConA液10μL(同時(shí)設(shè)不加ConA的對照孔), 置37, 5% CO2,相對濕度為100%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h,加10μLMTT溶液(5 mg·mL-1),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心

11、,棄上清,用PBS洗1次,加入30%DMSO 100μL,振蕩后靜置20 min,用酶標(biāo)儀于波長A570 nm處測A值,結(jié)果以3個(gè)復(fù)孔的 -x±s表示。7 D" i: j. / R1 ; r4 C% h6 Z8         1.11NK細(xì)胞活性測定(MTT法)3, 12-13 取上述制備好的脾細(xì)胞配成每毫升1×106細(xì)胞懸液作為效應(yīng)細(xì)胞,取對數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞配成每毫升1×105 懸液作為靶細(xì)胞,效、靶細(xì)胞各取100μL(效靶細(xì)胞的比例為 101

12、)至96孔培養(yǎng)板中,每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)不加靶細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞對照孔和不加效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞對照孔各2孔,置37, 5% CO2,相對濕度為100%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,每孔加入10μLMTT溶液(5 mg·mL-1),再培養(yǎng)4 h,離心,棄上清,用PBS洗1次,加入30% DMSO 100μL,振蕩后靜置20 min,用酶標(biāo)儀于波長A570 nm處測A值,結(jié)果以3 個(gè)復(fù)孔的-x±s表示NK細(xì)胞活性。NK細(xì)胞活性(% )=1 -實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞孔A值 /靶細(xì)胞孔OD值×100。( g &#

13、160;M3 f  F* T9 M. x        1.12統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量數(shù)據(jù)以-x±s表示,采用華西醫(yī)科大學(xué)的PEMS 3. 1 forW indows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),P值表示差異有無顯著性。/ ! k, o& g2 5 t- k0 |. g        2結(jié)果% F- L: m( K; C6 x        2.1達(dá)肝清對小鼠免疫器官重量的影響達(dá)肝清對小鼠免疫器官(胸腺、脾臟)重量的影響結(jié)果見表1。從表1可見,正

14、常對照組與達(dá)肝清組比較,胸腺指數(shù)和脾指數(shù)差異均無顯著性(P>0. 05);達(dá)肝清3個(gè)劑量組均能顯著提高CTX免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù),與CTX 組比較差異有顯著性或有高度顯著性(P<0. 05或P< 0. 01),表明達(dá)肝清對正常小鼠的免疫功能無明顯影響,而能對抗CTX對小鼠免疫器官負(fù)影響。從表1還可看到,雖然胸腺指數(shù)和脾指數(shù)都隨劑量的加大而有所提高,但3個(gè)劑量間比較差異均無顯著性(P>0. 05),表明在一定的劑量范圍內(nèi), 達(dá)肝清對小鼠免疫功能的影響隨劑量的加大而有所提高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4 K7 b& T. E9 . a6 S/ t 

15、60;     2.2    從表2可見,正常對照組與達(dá)肝清組比較,溶血素、抗體形成細(xì)胞和血清IL-2含量差異均無顯著性(P>0. 05);達(dá)肝清3個(gè)劑量組均能顯著提高CTX免疫抑制小鼠的溶血素、抗體形成細(xì)胞和血清IL-2含量,與CTX組比較差異有顯著性或有高度顯著性(P<0. 05或P<0. 01),表明達(dá)肝清對正常小鼠的溶血素產(chǎn)生、抗體形成細(xì)胞數(shù)和血清IL-2含量無明顯影響,而對免疫抑制小鼠的溶血素、抗體形成細(xì)胞和血清IL- 2含量有顯著的提升作用。3個(gè)劑量的達(dá)肝清均基本能將免疫抑制小鼠的免疫功能提升到正常水平,除小劑量達(dá)肝清組與正

16、常對照組比較差異有高度顯著性外(P<0. 01),大、中劑量達(dá)肝清組與正常對照組比較均差異無顯著性(P>0. 05)。從表2還可看到,雖然溶血素產(chǎn)生隨劑量的增加而有所提高,但大、中、小3個(gè)劑量間比較差異均無顯著性(P>0. 05), 和血清IL-2含量隨劑量的增加而提高比較明顯,小劑量達(dá)肝清組與中、大劑量達(dá)肝清組對抗體形成細(xì)胞數(shù)比較差異均有顯著性或有高度顯著性(P<0. 05或P<0. 01),但中、大劑量達(dá)肝清組組間比較差異均無顯著性(P>0. 05),表明在一定的劑量范圍內(nèi),達(dá)肝清對小鼠免疫功能的影響隨劑量的增加而有增高,但增到一定的劑量后,這種增加減緩

17、。0 z% F: u' M1 Z0 J/ I        2.3達(dá)肝清對小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、NK細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞活性的影響達(dá)肝清對小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、NK細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞活性的影響結(jié)果見表3。* K3 v8 G  i7 c/ p% g1 H        3討論1 F2 C  '8 P/ c4 t' 7 R- Q        乙型肝炎病毒(HBV)感染本身對肝細(xì)胞的直接破壞作用是有限的,肝細(xì)胞的損傷是

18、與宿主的免疫反應(yīng)有關(guān),機(jī)體抗病毒的免疫應(yīng)答既可清除HBV,又可使肝細(xì)胞受損而發(fā)生肝炎。HBV誘發(fā)的免疫應(yīng)答既有體液免疫應(yīng)答又有細(xì)胞免疫應(yīng)答,體液免疫應(yīng)答主要產(chǎn)生抗HBs抗體、抗前S抗體、抗 HBe抗體和抗HBc抗體等,前2種是保護(hù)性抗體,后2個(gè)為非保護(hù)性抗體。保護(hù)性抗體可以起到中和及清除病毒作用, 尤其在清除血液中的病毒起主要作用,對HBV感染具有保護(hù)性免疫作用。但病毒進(jìn)入細(xì)胞后,主要靠細(xì)胞免疫殺傷靶細(xì)胞以清除受感染細(xì)胞內(nèi)的病毒,同時(shí)也會(huì)造成肝細(xì)胞損傷而發(fā)生肝炎。一般認(rèn)為HBV感染后出現(xiàn)的肝組織慢性炎癥重要原因之一是由于機(jī)體細(xì)胞免疫功能低下14。NK細(xì)胞作為非常重要的固有免疫細(xì)胞,在抗病毒感染中起關(guān)鍵作用, 并可通過釋放細(xì)胞因子起到免疫調(diào)節(jié)的作用。有研究顯示, 外周血NK細(xì)胞數(shù)減少與乙型肝炎慢性化有關(guān)15。機(jī)體T 淋巴細(xì)胞分為兩個(gè)亞群,即CD4+和CD8+T細(xì)胞,它們數(shù)量、比值和功能的改變都可能影響著機(jī)體的免疫狀態(tài)。CD4+/ CD8+細(xì)胞的比值是監(jiān)視機(jī)體免疫功能,反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo),比值失衡可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂及一系列免疫病理改變16。資料表明17,慢性乙型肝炎患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)減少,而CD8+T細(xì)胞