實驗四植物抗逆生理

1、鹽脅迫對小麥抗逆生理指標的影響摘要：鹽脅迫是影響農作物產量及質量的主要非生物因素之一，鹽脅迫通過滲透脅迫和離子脅迫以及由此引起的營養(yǎng)不均衡影響植物的生長和發(fā)育,破壞植物的生理生化功能,最終導致植物細胞及植物體本身的死亡。因此,探究鹽脅迫對農作物的影響以及鹽害機理,提高農作物的耐鹽性,從而提高鹽漬土的農作物產量及質量,具有重要的理論和現實意義。土壤溶液中可溶性鹽含量的增加將導致溶液滲透壓增大,引起植物發(fā)生生理干早,從而抑制植物正常生長。鹽脅迫使植物光合速率下降、生長受抑制、衰老加速,其對植物的危害主要包括滲透脅迫和離子脅迫,且滲透脅迫是鹽脅迫下最早也是最明顯的影響因素。本實驗通過測定：葉綠素、脯

2、氨酸、膜透性、POD、可溶性糖、MDA。研究小麥幼苗在鹽脅迫的情況下生理的變化。前言在農業(yè)生產中，作物經常會遇到各種不良的環(huán)境條件，如干旱、洪澇、低溫、高溫、鹽漬以及病蟲侵染等，這些對植物產生傷害的環(huán)境，又稱為脅迫也就是植物的逆境。鹽分脅迫主要是由滲透脅迫和離子脅迫組成的在鹽分脅迫下植物的外部形態(tài)和內部的生理生化特性都發(fā)生了一系列的變化，有些變化是鹽脅迫傷害的結果，是植物對逆境條件的消極反應，有些變化則是植物對逆境的積極反應，有利于對不利環(huán)境條件的適應。鹽分對植物的傷害是多種多樣的。主要包括：（1）吸水困難：根吸收水分減少，木質部水勢下降，運入生長區(qū)的水分減少，因而抑制生長，同時也影響到對其它

3、離子的吸收。Na+造成土壤導水性能的降低，改變了土壤溶液的滲透勢，造成吸水困難，明顯降低了植物的葉面積、株高、干物質量，減少了禾本科植物的分蘗數和籽粒數等。（2）生物膜破壞：類囊體膜含有大量的糖脂和不飽和脂肪酸，與光化學反應密切相關。膜脂的不飽和度增加有利于類囊體膜光合特性的維持。鹽脅迫下，Na+可置換細胞膜結合的 Ca2+，膜結構遭到破壞，功能改變。細胞膜選擇透性遭到破壞，細胞內的鉀、磷和有機溶質外滲，胞外離子如鈉、氯大量進入細胞，造成胞內離子平衡破壞。研究證明 NaCl 脅迫對植物的傷害主要傷害了細胞的質膜，使膜脂發(fā)生過氧化，導致過氧化產物 MDA 增加，質膜透性加大，細胞內離子平衡失調，

4、代謝紊亂，生長受到抑制。（3）生理紊亂：鹽分過多會降低蛋白質的合成速率，相對加速儲藏蛋白質的水解，造成體內氨基酸的積累過多，產生過多的氧自由基和氨，對植物造成傷害。鹽分過多也抑制光合速率，葉綠體趨于分解，葉綠素被破壞，葉綠素和胡蘿卜素的生物合成受干擾，氣孔關閉，光合下降。總之，在鹽分脅迫下，植物會產生一些反應，以忍受或適應鹽的環(huán)境。1 實驗材料、試劑與設備1.1 實驗原材料小麥經過不同濃度的鹽溶液（0、0.2%、0.4%）處理24h后的新鮮小麥1.2 實驗試劑和儀器1.2.1 葉綠素含量測定 95%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸鈣粉；儀器：剪刀，分光光度計，電子天平，研缽，棕色容量瓶，漏斗

5、，濾紙，吸水紙，膠頭滴管。1.2.2 脯氨酸含量測定2.5%酸性茚三酮溶液的配置：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L磷酸中，攪拌加熱（70）溶解，貯于4冰箱中，2-3日有效；3磺基水楊酸配配制：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml；6mol/L磷酸：85%磷酸稀釋至原體積的2.3倍；10g/ml脯氨酸標準母液配制：精確稱取20mg脯氨酸，倒入小燒杯內，用少量蒸餾水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度（為100g/ml脯氨酸母液），再吸取該溶液10ml，加蒸餾水稀釋定容至100ml，即為10g/ml脯氨酸標準液；100g/ml脯氨酸母液:稱10mg

6、脯氨酸溶于少量的乙醇中，用蒸餾水定容至100ml；冰醋酸；甲苯。儀器：分光光度計；電子分析天平；離心機；小燒杯；普通試管；移液管；注射器；恒溫水浴鍋；漏斗；漏斗架；濾紙；剪刀；洗耳球。1.2.3 細胞膜透性測定蒸餾水，去離子水；儀器：電導儀，電子天平，三角瓶，吸水紙，剪刀，恒溫培養(yǎng)箱，真空泵。1.2.4 過氧化物酶（POD）活性的測定POD提取液；100mmol/LPH為7.0的磷酸緩沖液PBS；反應混合液：100mmol/L磷酸緩沖液50ml于燒杯中，加入鄰甲氧基苯酚28ul，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19ul，混合搖勻，保存于冰箱中。1.2.5 丙二

7、醛（MDA）含量的測定10三氯乙酸；0.6硫代巴比妥酸（TBA）溶液；石英砂；10三氯乙酸：稱取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml；0.6硫代巴比妥酸（用10三氯乙酸配制）：稱0.6707g TBA加10TCA溶解定容至100ml（4貯存）。儀器 ：離心機，離心管，分光光度計，電子分析天平，恒溫水浴，研缽，試管，移液管，試管架，移液管架，洗耳球，剪刀。1.2.6可溶性糖含量的測定（蒽酮法）1. 材料：植物葉片。2. 儀器設備：離心機，離心管，分光光度計，電子分析天平，恒溫水浴，研缽，試管，移液管，試管架，移液管架，活性炭，漏斗，剪刀，玻璃棒。3.試劑(1)濃硫酸；(2) 80 乙

8、醇。(3)葡萄糖標準溶液（ 100 g/mL ）：準確稱取 100 mg 分析純無水葡萄糖，溶于蒸餾水并定容至 100 mL ，使用時再稀釋 10 倍（ 100 g/mL ）。(4)蒽酮試劑：稱取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 濃硫酸（將 98% 濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩加入到蒸餾水中） 1000 mL 中，冷卻至室溫，貯于具塞棕色瓶內，冰箱保存，可使用 2 3 周。2 實驗設計將種植的小麥用不同濃度梯度的鹽溶液提前24小時預處理，鹽溶液的濃度分別為0、0.3%、0.6%，0梯度的作為對照，做三次重復。3 實驗步驟3.1葉綠素含量的測定1 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織），擦凈組織表面污物，

9、剪碎（去掉中脈），混勻；2 稱取剪碎的新鮮樣品 0.2g ，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23ml 95%乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置35min；3 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中； 4 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中,直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻；5 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內，以95%乙醇為空白，在波長663nm和645nm下測定吸光度。3.2脯氨酸含量的測定3.3

10、.1脯氨酸標準曲線的制作1 取6支試管，編號，按下表配制每管含量為012ug的脯氨酸標準液。加入表中試劑后，置于沸水浴中加熱20min。取出冷卻，各試管再加入4ml甲苯，振蕩30秒鐘，靜置片刻，使色素全部轉至甲苯溶液。試 劑管 號01234510g·ml-1脯氨酸標準液（ml）蒸餾水（ml）冰醋酸（ml）2.5酸性茚三酮（ml）02230.21.8230.41.6230.61.4230.81.2231.01.0232 用移液管輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度（A）值。3 標準曲線的繪制以脯氨酸含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，

11、繪制標準曲線。3.3.2 樣品的測定1 脯氨酸的提取稱取不同處理的植物葉片各0.5g，分別置大試管中，然后向各管分別加入5ml 3的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取過程中要經常搖動），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。2 測定吸取2ml提取液于帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸、2ml H2O、3ml 2.5酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱20min，溶液即呈紅色。冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30秒鐘，靜置片刻，取上層液至10ml(實際上只吸取了5ml，測定時只用了2ml)；用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度

12、（A）值。3.3POD酶活性的測定 1 取樣 取0.3g左右的葉片，放在冰涼的研缽下，加入POD提取液4ml，快速研磨，研磨完成后，直接倒入離心管中，放到4冰箱冷藏。（做3次重復）； 2 離心 調整離心機的轉速和時間，12000轉下離心6min，離心溫度在-44； 3 反應步 取上清液40微升（0.04ml）于試管中，加入3ml反應液，混勻，之后放在35水浴中保溫5min； 4 比色 在470nm下，用POD提取液作為調零液，測得數據。3.4膜透性的測定 1 選用18個三角瓶，分為三組，每組六個，第一組三角瓶中加入未用KNO3處理的小麥葉片，葉片蒸餾水沖洗干凈，然后用吸水紙吸干水分，用剪刀把葉

13、片剪成1cm的小段，每個瓶中準確稱量0.5g葉片，再往每個瓶中加入10ml去離子水，六個瓶中三個為A處理，三個為B處理；第二組的六個三角瓶中加入用0.3%梯度KNO3處理過的葉片0.5g，都加入10ml蒸餾水，分成A、B兩個處理；用0.6%梯度KNO3處理過的小麥葉片也是同上面的步驟一樣； 2 把所有的三角瓶抽真空20min； 3 測定每組中A處理的電導率；4 將每組B處理的三角瓶用保鮮膜封口，放入恒溫培養(yǎng)箱中80下處理15min，取出冷卻至室溫，測定他們的電導率；3.5 丙二醛（MDA）含量的測定1 提取采用硫代巴比妥酸顯色法。取葉片，洗凈擦干后去中脈。稱取0.5 g樣品，加5%三氯乙酸2

14、mL和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml 三氯乙酸進一步研磨，勻漿后4000 rpm，離心10min。2 顯色取上清液2 mL，加0.6% TBA 2 mL，混合后在100水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷卻后再離心一次。分別測定上清液在450nm、532 nm和600 nm處的吸光度值。3.6可溶性糖含量的測定（蒽酮法）3.6.1可溶性糖的提取 稱取0.5g的新鮮植物（青菜）葉片，于研缽中加80%酒精4ml，仔細研磨成勻漿，倒入離心管內，置于80水浴中不斷攪拌30min，離心10分鐘(5000轉/min)，收集上清液于10ml的刻度試管中，其殘渣加2ml80%酒精重復提1次，合并上清液。

15、在上清液中加0.5g活性炭，80水浴脫色30min,定容至10ml，過濾后取濾液(稀釋10倍或20倍后)測定。3.6.2顯色及比色 吸取上述糖提取液1mL， 放入一干潔的試管中，加蒽酮試劑5mL混合之，于沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻，然后于分光光度計上進行測定，波長為625nm，測得吸光度。從標準曲線上查得濾液中得糖含量（或經直線回歸公式計算），然后再行計算樣品中含糖百分數。3.6.3繪制標準曲線 取標準葡萄糖溶液將其稀釋成一系列不同濃度的溶液，濃度分別為每mL含糖0、5、10、20、40、60、80g。按上述方法分別測得其吸光度，然后繪制A625糖濃度曲線，或進行直線回歸求得直線方程。 試

16、劑（ml) 管號 1 2 3 4 5 6 葡萄糖標準液 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 80%酒精 1.0 0.95 0.9 0.8 0.7 0.6 蒽酮-硫酸試劑 5 5 5 5 5 5 葡萄糖濃度（ug/ml) 0 10 20 40 60 80 3.6.4計算方法可溶性糖含量% = C*V/(W*106)*100%  V為植物樣品稀釋后的體積（ml）-100ml C為提取液的含糖量（g/ml）-根據標準曲線計算W為植物組織鮮重量（g）-0.1g4 結果與分析4.1葉綠素含量的測定葉綠素含量測定的吸光值如下表1所示表1 提取液吸光度值重復一重復二重

17、復三0梯度663nm0.8240.6070.749645nm0.2990.2170.2680.2梯度663nm1.1430.9640.939645nm0.5720.4850.4700.4梯度663nm0.8441.0970.789645nm0.4040.5240.379將上述表格中的吸光值代入下面公式，計算出葉綠素含量：葉綠素a的含量 = 12.7OD663 - 2.69OD645 ；葉綠素b的含量 = 22.9OD645 - 4.86OD663 ；葉綠素a、b的總含量 = 8.02OD663 + 20.20OD645 ；葉綠素a含量如下表2：表2葉綠素a含量重復

18、一重復二重復三平均值0梯度9.667.138.798.53Aa0.2梯度12.9810.9410.6611.53Ab0.4梯度9.1012.529.0010.2Ab葉綠素A方差分析差異源SSdfMSFP-valueF crit組間1.85846720.9292330.2123920.8144765.143253組內26.2505364.375089總計28.1098通過方差分析可以看出葉綠素A之間不存在顯著性差異葉綠素b含量如下表3：表3 葉綠素b含量重復一重復二重復三平均值0梯度2.842.022.502.45Aa0.2梯度7.546.426.206.72Ab0.4梯度5.156.674.8

19、45.55Aab 葉綠素B方差分析差異源SSdfMSFP-valueF crit組間0.73348920.3667440.0693440.9337435.143253組內31.732865.2888總計32.466298通過方差分析F值大于0.05也是不存在顯著性差異葉綠素a、b總含量如下表4：表4 葉綠素a、b總含量重復一重復二重復三平均值0梯度14.939.2511.4211.87Aa0.2梯度20.7220.4317.0219.39Ab0.4梯度15.0019.3813.9816.12Ab 葉綠素AB總量含量方差分析：方差分析差異源SSdfMSFP-valueF crit組間12.705

20、6226.3528110.3342470.7284015.143253組內114.0381619.00636總計126.74388從上分析可以看出組內不存在顯著性差異（F值大于0.05.）上述葉綠素不同濃度鹽分情況下都不存在顯著性差異，可能是實驗過程中的失誤造成的。4.2脯氨酸含量的測定4.2.1 脯氨酸標準曲線繪制4.2.2 樣品的測定不同鹽濃度脅迫小麥的脯氨酸甲苯溶液在520nm波長下的吸光值如下表：表5 脯氨酸甲苯溶液在520nm波長下的吸光值重復一重復二重復三平均值0梯度0.1010.0790.1190.100Aa0.2梯度0.1210.1610.2860.189Bb0.4梯度0.18

21、90.1860.25930.222Bc根據上表所述，0梯度的脯氨酸甲苯溶液的吸光值低于0.6梯度的脯氨酸甲苯溶液的吸光值，0.6梯度的脯氨酸甲苯溶液的吸光值高于0.3梯度的脯氨酸甲苯溶液的吸光值，呈現上升的趨勢，三組之間差異很明顯。根據上表所述吸光值代入到脯氨酸標準曲線上查出樣品測定液中脯氨酸含量，按照下面的公式計算樣品中脯氨酸含量： 脯氨酸含量（ug/gFw）公式中：X 從標準曲線中查得的脯氨酸含量（ug）；表6 脯氨酸含量重復一重復二重復三平均值0梯度1.0440.8641.1921.033Aa0.2梯度1.2081.5362.5601.768Bb0.4梯度1.7661.7412.351.

22、952Cc方差分析差異源SSdfMSFP-valueF crit組間0.00911520.0045581.5252010.2913745.143253組內0.01792960.002988總計0.0270448根據上述數據方差分析可以看出數據之間無顯著差異4.3 細胞膜透性的測定 通過電導儀測定小麥葉片的電導率如下表：表7 小麥葉片的電導率重復一重復二重復三0梯度A2.232.022.31B49.749.549.40.2梯度A2.582.483.80B5350.351.50.4梯度A4.534.25.18B84.978.997.5計算 按下面公式計算相對電導度，以相對電導度的大小表示細胞膜受傷

23、害的程度。 相對電導度=S1/S2×100%；式中，S1為A管的電導率，S2為B管的電導率；得出相對電導度如下表：表8 小麥葉片相對電導度重復一重復二重復三0梯度 4.49%4.08%4.68%0.2梯度4.88%4.93%7.38%0.4梯度5.34%5.32%5.31%根據上表所示，細胞膜透性以相對電導度表示，通過上面電導率可以看出在隨著濃度上升，電導率是逐漸上升的。隨著電導率的上升，小麥幼苗的膜透性是升高的。由此可以看出小麥隨著膜透性的升高時對小麥生長是不利的。4.4 過氧化物（POD）酶活性測定通過實驗得出酶液在470nm波長下的吸光值如下表：表9 酶液在470nm下的吸光值

24、重復一重復二重復三0梯度0.6000.6020.8510.2梯度0.9390.7500.8360.4梯度0.6480.6380.668 根據上述表格中所示的吸光值代入下面這個公式，計算出過氧化物（POD）酶活性： 過氧化物（POD）酶活性（U/（gmin）=；式中A470為酶液在470nm波長下的吸光值；V1為樣品總體積（ml）；W為葉片的重量（g）；V2為測定時所取酶液的體積（ml）；t為反應時間；所得出過氧化物（POD）酶活性如下表：表10過氧化物（POD）酶活性+重復一重復二重復三0梯度304305.013431.1730.2梯度475.76380423.5730.4梯度328.3232

25、3.253338.453通過上表數據顯示：0.2梯度POD酶活性值是最高的，顯示比較明顯。重復一和重復二0梯度都小于0.4梯度，可以明顯看出鹽脅迫情況下隨著鹽度的升高POD值是上升的，但是0.2濃度梯度和0.4梯度比較，0.2梯度顯著高于0.4梯度。 方差分析差異源SSdfMSFP-valueF crit組間5712.03322856.0160.6684420.5469145.143253組內25635.8964272.648總計31347.928通過方差分析看出不存在顯著性差異。4.5丙二醛（MDA）含量的測定提取液在532nm、600nm、450nm下的吸光度值如表11所示：表11 提取液

26、的吸光度值NaCl溶液濃度1230532nm0.2700.3740.339600nm0.1140.1300.130450nm0.7050.9400.8530.2532nm0.3700.4590.428600nm0.1280.2170.134450nm0.9961.2301.2710.4532nm0.4020.5340.648600nm0.1670.2440.308450nm1.3231.4261.909根據公式計得出小麥葉片MDA的含量如表12所示：表12 MDA的含量NaCl溶液濃度1230 1.5592.6662.2160.22.5552.2283.0190.41.9842.7372.87

27、84.6可溶性糖含量的測定4.6.1標準曲線的制作波長為625nm的吸光度值：編號123456標準液量（ml）00.050.100.200.300.40吸光度值00.0100.0200.0510.0570.092圖2 可溶性糖的標準曲線如圖2所示，標準曲線公式為y=0.2219x-0.0005，R2值達到0.9749，達到了實驗多需的要求4.6.2樣品的測定提取液在波長為625nm下的吸光度值如表12所示：表13 波長為625nm的吸光度值NaCl溶液濃度12300.0070.0030.0180.20.0880.0920.1670.40.4470.3050.194根據公式計得出小麥葉片可溶性糖

28、的含量如表13所示：表14 可溶性糖的含量NaCl溶液濃度12300.0640.0300.1570.20.7530.7871.4240.43.8052.5981.654從表中可以看出隨著鹽分濃度的升高可溶性糖的含量是逐漸升高的，數據比較明顯。當在0.4濃度的情況下，增加值是最高的。討論：鹽脅迫是植物一系列的生理過程發(fā)生改變，抑制其生長發(fā)育。鹽敏感不同的植物表現出不同的生理變化。因而，研究植物生理過程的變化可反映出植物對鹽的適應性，揭示植物的抗鹽機理。在葉綠素含量來看在0.2梯度下鹽脅迫對于小麥幼苗的葉綠素的破壞均高于0梯度和0.4梯度。且對葉綠素b的破壞大于對葉綠素a的破壞。這可能與鹽脅迫過程中葉綠