含砷化物中藥及制劑的分子藥理學(xué)研究進(jìn)展

1、含砷化物中藥及制劑的分子藥理學(xué)研究進(jìn)展    【關(guān)鍵詞】  ,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)【摘要】 目的  綜述國(guó)內(nèi)外對(duì)含砷化物中藥（砒霜、雄黃等）及制劑的臨床應(yīng)用和分子藥理學(xué)研究，尤其是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究進(jìn)展。 方法  以國(guó)內(nèi)外有代表性的文獻(xiàn)為基礎(chǔ)進(jìn)行分析、整理和歸納。結(jié)果  砷劑抗腫瘤的分子機(jī)制主要是促使PML-RAR融合蛋白降解，調(diào)節(jié)凋亡調(diào)控基因和/或蛋白的表達(dá)，巰基是砷劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要化學(xué)感受器，砷劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路主要包括半胱氨酸蛋白酶家族依賴性凋亡通路和線粒體依賴性凋亡通路。 結(jié)論  含砷化物中

2、藥及制劑治療急性早幼粒細(xì)胞白血病療效顯著，深入研究其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，對(duì)于有效合理使用砷劑并擴(kuò)大其抗腫瘤的臨床應(yīng)用范圍有重大意義。     關(guān)鍵詞  三氧化二砷 雄黃 惡性血液病 細(xì)胞凋亡 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)      含砷化物中藥及其制劑的使用在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有悠久的歷史，近年來(lái)在治療急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）中取得顯著療效，在基礎(chǔ)研究方面也取得了較大的進(jìn)展。本文將綜述國(guó)內(nèi)外對(duì)含砷化物中藥（砒霜、雄黃等）及制劑的臨床應(yīng)用和分子藥理學(xué)研究

3、，尤其是對(duì)于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究進(jìn)展，現(xiàn)報(bào)告如下。     1 含砷化物中藥及制劑     含砷化合物的中藥礦物主要包括砒石（Arsenolite）、雄黃（Realgar）和雌黃。砒石主要成分是三氧化二砷（As 2 O 3 ），分為白砒（又稱砒霜，White Arsenic，為較純的As 2 O 3 ）和紅砒（含有少量As 2 S 3 ） 1 。雄黃主成分是硫化砷（As 2 S 2 或As 4 S 4 ）;雄黃易氧化為雌黃，雌、雄黃總成分區(qū)別在As/S比值，微量成分近似，雌黃主要成分為As 2 S 3 ，

4、與雄黃的性狀相似，但雄黃呈紅色或橘紅色，雌黃則為黃色1 。    含砒霜的制劑主要有亞砷酸鉀（三氧化二砷的堿溶液）、三氧化二砷注射液、癌靈一號(hào)（內(nèi)含砒石和輕粉，As 2 O 3 含量為1mg/ml，Hg 2 Cl 2 含量為0.01mg/ml）。中國(guó)藥典（2000版）收載的含雄黃中成藥有24種:七珍丸、小兒至寶丹、小兒驚風(fēng)散、小兒清熱片、牙痛一粒丸、牛黃抱龍丸、牛黃清心丸、牛黃解毒片、牛黃解毒丸、牛黃鎮(zhèn)驚丸、六應(yīng)丸、安宮牛黃丸、安宮牛黃散、紅靈散、醫(yī)癇丸、局方至寶散、阿魏化痞膏、純陽(yáng)正氣丸、珠黃吹喉散、梅花點(diǎn)舌丸、紫金錠、暑癥片、痧藥、小兒化毒散等，約占藥典成方總

5、數(shù)的5.3%。還有青黃散（由雄黃、青黛、太子參、丹參等藥組成）、復(fù)方青黛片（主成分為雄黃、青黛）、復(fù)方白血寧（由雄黃、黃芪、當(dāng)歸、苦參等藥組成）等。 2 功能主治和臨床應(yīng)用     砒霜味辛、酸，性熱，有劇毒，歸肺經(jīng)。外用蝕瘡去腐，可治癰疽惡瘡、瘰癘、痔瘡等;內(nèi)服劫痰平喘、劫瘧、止痢，可治含痰哮喘、瘧疾、痢疾 2 。雄黃味辛，性溫，有毒，歸肝、大腸經(jīng)。具有燥濕、祛風(fēng)、殺蟲(chóng)、解毒的功效。在成方中常作為輔助主藥發(fā)揮清熱解毒的功效而入藥，如安宮牛黃丸，牛黃解毒片。含雄黃復(fù)方還常外用治療皮膚病、小兒腮腺炎、乳癰、尖銳濕疣，療效顯著 2，3 。 

6、0;  近年來(lái)，砒霜和雄黃作為砷劑在治療惡性血液病中取得了突出、可喜的臨床療效。孫鴻德等應(yīng)用癌靈一號(hào)結(jié)合中醫(yī)辨證治療APL32例，完全緩解（CR）率達(dá)65.6%，部分緩解（PR）率12.5%，28.2%存活10年以上 4。張鵬等將癌靈一號(hào)簡(jiǎn)化為As 2 O 3 注射液，每日靜滴10ml，28天為1個(gè)療程，初治者30例，CR率73.3%，有效率90%;復(fù)發(fā)及難治42例，CR率53.3%，有效率64.2% 5 。Soignet等報(bào)道用As 2 O 3 處理12例復(fù)發(fā)APL，0.060.2mg/（kgd），1239天后11例獲CR 6 。湯孝優(yōu)等報(bào)道口服As 2 O 3 治療APL，每日服

7、用10mg或7.5mg，連用60天后，CR率分別為77.8%和62.5%，且毒副反應(yīng)不明顯 7 。其他中心應(yīng)用As 2 O 3 治療APL也取得類似良好療效，并初步證實(shí)了As 2 O 3 與其他化療藥物，包括全反式維甲酸（ATRA），無(wú)交叉耐藥性 8，9 ，提示As 2 O 3 與以一種不依賴于維甲酸調(diào)節(jié)途徑的方式發(fā)揮作用。    20世紀(jì)60年代起，周靄祥等使用青黃散治療慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）發(fā)現(xiàn)組方中雄黃比例越大，治療作用越強(qiáng)，總結(jié)治療CML86例，總緩解率88.4% 10 。90年代，向陽(yáng)等以復(fù)方青黛片治

8、療APL60例，CR率高達(dá)98.3% 11 。白月輝等證實(shí)雄黃是復(fù)方青黛片治療APL取得高緩解率的重要成分12 ，陸道培等總結(jié)用雄黃或純化雄黃治療APL66例，均獲完全緩解，認(rèn)為單用雄黃治療M 3 型白血病對(duì)初治、耐藥、復(fù)發(fā)和維持緩解都有確切療效，且純化雄黃較原產(chǎn)雄黃毒副反應(yīng)明顯減少 13 。楊新中等應(yīng)用復(fù)方白血寧1號(hào)治療急慢性白血病，療效良好 14 。唐由君應(yīng)用含有雄黃的中成藥六神丸、西黃丸、紫金錠治療急慢性白血病也獲得一定療效 15 。高學(xué)熙等用雄黃治療骨髓增生異常綜合征（MDS），發(fā)現(xiàn)對(duì)難治性貧血伴原始細(xì)胞增多型效果明顯優(yōu)于難治性貧血，認(rèn)為雄黃對(duì)惡性克隆增殖性疾病療效良好 16 。

9、60;    3 含砷化物中藥及制劑的分子藥理學(xué)研究進(jìn)展     臨床和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，砷劑可從不同方面作用于腫瘤，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡、分化或抑制其增殖。對(duì)含砷中藥及制劑的分子藥理學(xué)研究主要圍繞砷劑誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因/蛋白調(diào)控機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和作用靶點(diǎn)展開(kāi)。    3.1 促使PML-RAR融合蛋白降解 APL的特異性細(xì)胞遺傳標(biāo)志是染色體t（15;17）易位，導(dǎo)致PML基因和維甲酸（RA）受體（RAR）基因融合，表達(dá)PML-RAR融合蛋白。PML是一種磷酸蛋白質(zhì)，是線粒體（PML

10、oncogenic domain，POD）的組成成分，具有生長(zhǎng)抑制作用，表現(xiàn)為細(xì)胞周期特異性表達(dá)（S、G 2 、M期降低，G 1 期增高），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RAR被認(rèn)為是有利于骨髓細(xì)胞分化的。PML-RAR融合蛋白致使POD的結(jié)構(gòu)和功能受損，阻止了骨髓的分化和細(xì)胞凋亡，經(jīng)研究證實(shí)是APL發(fā)病的主要分子基礎(chǔ) 17，18 。鐘璐等研究表明，在不同誘導(dǎo)劑（ATRA、雄黃）刺激下，PML基因在蛋白水平參與細(xì)胞終末分化和誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡機(jī)制，PML蛋白發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞控制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用 19 。研究發(fā)現(xiàn)，As 2 O 3 作用于NB 4 ，MR-2細(xì)胞時(shí)，0.1mol/L As 2 O 3 即足以降解P

11、ML-RAR蛋白，蛋白的降解早于細(xì)胞凋亡 20，21 。經(jīng)As 2 O 3 治療的患者骨髓細(xì)胞的PML-RAR顯著減少，多數(shù)獲CR者其PML-RARmRNA轉(zhuǎn)陰 6 。朱軍等研究證實(shí)As 2 O 3 的攻擊點(diǎn)是以PML的氨基終端順序?yàn)槟繕?biāo)降解PML-RAR而不同于RA是以RAR為目標(biāo) 22 。As 2 O 3 和RA聯(lián)合應(yīng)用與對(duì)照組比較，延長(zhǎng)了RML-RAR轉(zhuǎn)基因鼠生存，共同的通路是降解是PML-RAR融合蛋白，這為As 2 O 3 和RA的臨床聯(lián)合用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù) 23 。3.2 調(diào)節(jié)凋亡調(diào)控基因和/或蛋白的表達(dá) 如果As 2 O 3 僅對(duì)PML-RAR融合蛋白起作用，則只能治療APL;但

12、研究發(fā)現(xiàn)，砷劑還可以對(duì)其惡性血液?。ㄈ鏑ML、骨髓瘤、B細(xì)胞白血病） 24，25 和實(shí)體瘤細(xì)胞（如肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌細(xì)胞等） 2630 ，以及其他增殖細(xì)胞（如血管平滑肌增殖細(xì)胞） 31 有殺傷作用。多種基因參與細(xì)胞凋亡調(diào)控，其中Bcl-2基因是細(xì)胞凋亡調(diào)控的最后共同通路之一。已發(fā)現(xiàn)NH 4 細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Bcl-x1及P 53 、C-myc基因大量表達(dá)。As 2 O 3 能降低NB 4 、NOP-1、NKH-1、LyH 7 細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，從mRNA到蛋白質(zhì)水平均有下調(diào)作用，且只有Bcl-2/Bax比例下降（這點(diǎn)比Bcl-2單獨(dú)下調(diào)更重要），促使細(xì)胞凋

13、亡 32 。陳思宇等研究發(fā)現(xiàn)，K562細(xì)胞低表達(dá)Bcl-2蛋白，硫化砷處理對(duì)K562細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)顯著增加，使Bcl-2/Bax比例下降，從而促使細(xì)胞凋亡 33。    CML以BCR/ABL融合基因?yàn)檫z傳學(xué)特征，該基因編碼BCR-ABL融合蛋白，該蛋白增強(qiáng)酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性，激活ras等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抗細(xì)胞凋亡，研究表明BCR-ABL融合蛋白是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)。As 2 O 3 可降低PTK活性，阻斷BCR-ABL融合蛋白的抗凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋

14、亡 34 。    3.3 巰基（-SH）是As 2 O 3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要化學(xué)感受器（chemosensor） 巰基是細(xì)胞重要的功能基因，砷劑易與巰基結(jié)合并使之氧化，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)的產(chǎn)生。新近的研究表明，若實(shí)體瘤（如神經(jīng)母細(xì)胞瘤）細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH，可使細(xì)胞內(nèi)巰基含量增高，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)重要蛋白的巰基不被砷劑結(jié)合）含量低于40nmol/mg蛋白，則對(duì)As 2 O 3 敏感;若高于40nmol/mg，則不能誘導(dǎo)其凋亡。所以細(xì)胞內(nèi)GSH含量可作為預(yù)測(cè)砷劑敏感性的指示劑。巰基還原劑二巰基蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）可有效抑制As 2 O

15、3 對(duì)APL誘導(dǎo)凋亡效應(yīng) 35 。伍鋼等的研究表明，As 2 O 3 誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SJ-N-SH凋亡過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)GSH含量明顯下降，處理72h后達(dá)最低點(diǎn)，且這種變化出現(xiàn)在細(xì)胞凋亡高峰（Bcl-2大量表達(dá)）發(fā)生之前 29 。日益增加的研究結(jié)果表明，巰基的氧化或交聯(lián)是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡重要的化學(xué)基因，含有二巰基基團(tuán)的蛋白質(zhì)可能是As 2 O 3 作 用的主要靶分子，故巰基被認(rèn)為是As 2 O 3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要化學(xué)感受器 23 。    3.4 半胱氨酸蛋白酶家族（Caspases）依賴性凋亡通路 有配體或受體激活的Caspases依賴性凋亡通路是化療藥物誘導(dǎo)

16、細(xì)胞凋亡的主要核心通路之一。配基與受體結(jié)合，激活Caspases-8，進(jìn)而激活Caspases-3和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等，如干擾素、腫瘤壞死因子等均經(jīng)由此通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 36，37 。在這程序激活過(guò)程中，有多藥耐藥性基因mdrl編碼的P-糖蛋白（P-gp）抑制Caspases-8和Caspases-3的激活，因而使腫瘤多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抗性38，39 。有研究發(fā)現(xiàn)砷劑誘導(dǎo)B-細(xì)胞白血病細(xì)胞株KO-Cl 44 和LyH 7 細(xì)胞凋亡與Caspases活化有關(guān)。在1.0mol

17、/L As 2 O 3 誘導(dǎo)NB 4 細(xì)胞凋亡時(shí)，Caspases-3被激活和降解PARP，同時(shí)Bcl-2下調(diào)。在2.0mol/As 2 O 3 誘導(dǎo)惡性淋巴瘤細(xì)胞凋亡時(shí)，同樣可見(jiàn)Caspases-3被激活和PARP降解 40 。Caspases酶抑制劑Z-VAD.frnk可阻斷As 2 O 3 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。說(shuō)明在砷劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，Caspases酶系的激活是必需的23 。張晨等研究發(fā)現(xiàn)雄黃能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，其線粒體膜APO2.7蛋白明顯表達(dá);也能誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞K562/ADM細(xì)胞凋亡，在48h后P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)下調(diào) 41 ，并發(fā)現(xiàn)硫化砷能增加細(xì)胞膜熱休克蛋白（HSP70）表達(dá) 42 ，這一結(jié)果提示As 2 O 3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路除了Caspases依賴性凋亡通路外，還有其他通路。    3.5 線粒體依賴性凋亡通路 線粒體依賴性凋亡通路是抗癌藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的另一核心通路。通過(guò)改變線粒體的跨膜電位等，導(dǎo)致細(xì)胞色素c（cytochrome-c，