石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用

1、石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用近io年來，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)越來越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領(lǐng)域，為了解病理狀態(tài)下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認(rèn)為，人類基因組并非人們想象的那樣穩(wěn)定，諸如基因重排、擴(kuò)增、缺 失，突變和DNA甲基化類型改變等時有發(fā)生，這些改變對于基因表達(dá)和調(diào)控，以及疾病過程的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸等方面均具有重要意義。醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學(xué)研究的材料來源。在石蠟切片 上進(jìn)行原位雜交或原位 PCR分析的分子生物學(xué)方法，是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的重要延伸。通過對DNA或mRNA分析亦可直接證實(shí)或補(bǔ)充免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。這些對形態(tài)學(xué)家較為熟悉的原位分子

2、生物學(xué)技術(shù)，本 節(jié) 不再贅述。Goelz（1985）和Dubeau等（1986 ）成功地從蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學(xué)研究的需要，結(jié)束了 DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細(xì)胞的歷史，而且可以廣泛地應(yīng)用于大宗病例的回顧性研究，對腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的探討，診斷與鑒別診斷研究和患者預(yù)后評估等方 面均具有重要價(jià)值。本節(jié)重點(diǎn)討論石蠟包埋組織 DNA提取的方法學(xué)及其潛在的應(yīng)用前景。一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法從石蠟包埋組織中提取 DNA的基本步驟，是在常規(guī) DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而來。Goelz等（1985 ）最先提出的石蠟包埋組織 DNA提取技術(shù)（表18-

3、5 ），是用機(jī)械的方法破碎組織，切除多余的 石蠟，直接進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K（ 1mg/ml ）的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。Dubeau等（1986 ）在上述方法上作了改進(jìn)。首先通過組織切片用二甲苯脫蠟，保證了組織的完全破碎，使 細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜 交的降解的DNA小片段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，從而提高了 DNA質(zhì)量，適于做Southern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990

4、）對上述兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法所取得DNA之點(diǎn)雜交結(jié)果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步驟1.切除多余石蠟，暴露組織2 .將組織切碎（最大徑 <0.5mm ），稱重；3 .溶于TE9提取液（組織<50mg/5ml,50500mg/10ml ），高速混懸23min ;于48。放置24h，其制備 見表18-6 ;4 .再次混懸組織，加入蛋白酶K至終濃度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h ;5 用等體積酚-氯仿溶液抽提3次；6. 2.5倍體積乙醇沉淀DNA7. -70 C放置24h8 . 9000 Xg 離心 1h9 .沉淀

5、物用70%乙醇洗1次10 .干燥，TE （pH7.2 ）溶解.表18-6 TE9 DNA提取液的制備500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmoo/LNaCl1%SDS500 g g/ml蛋白酶KPH8.05 gm組織切片常規(guī)脫蠟、水化第一次溶液A孵育（去上清）第二次溶液A孵育（留上清）氯仿-異戊醇抽提RNA酶和蛋白酶消化酚抽提沉淀(卻除未螺旋化 DNA )J透析圖18-6 石蠟包埋組織 DNA提取流程(Drbeau等，1986)溶液A2XSSC100卩g蛋白酶K/ml1% SDS不同類型的基因分析所要求的DNA質(zhì)量長數(shù)量不同。Southern印跡雜交分析需要1015 大片段D

6、NA (> 20kb )，因?yàn)殡s交前要進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化和凝膠分離不同片段長度的DNA。故DNA提取要求高，小片段 DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR )則可在相對粗制的小片段DNA樣本上進(jìn)行，分析所需的 DNA很少，0.5甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多，除上述兩種方法外，還有更簡便的直接水煮法(Sle - bos,et al, 1990 ; Smit, et al. 1988 )、蛋白酶消化法(Impraim et al. 1987 ; Brice, et al. 1989)。這些方法不經(jīng)過酚-氯仿-異戊醇抽提、DNA純化等步驟， 直接將

7、組織放在去離子水中煮沸10min或在蛋白酶K緩沖液中消化4h，DNA即可釋放出來。此提取物可直接用作模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，但是，我們發(fā)現(xiàn)直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，擴(kuò)增率較低，且重復(fù)性不好。這可能是由于DNA附著的蛋白質(zhì)去除不凈而影響DNA變性和引物的結(jié)合，亦可能是由于標(biāo)本中殘留的固定劑等成分對Taq DNA多聚酶的抑制所致。、影響DNA提取質(zhì)量的因素1固定劑對 DNA 的影響固定劑的類型直接影響提取 DNA 的質(zhì)量。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的中性緩 沖福爾馬林固定的標(biāo)本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Warford等（1988 ）對甲醛固定過程中DNA變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)核

8、酸對甲醛反應(yīng)性可分為兩個階段：早期出現(xiàn)堿基快速可逆性羥甲基化； 數(shù)天后堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)。DNA提取過程中的蛋白酶 K消化，酚/氯仿抽提和純化等步驟，可以消除由于固定所造成的 DNA 某些理化性質(zhì)改變。bramwell等（1988 ）發(fā)現(xiàn)，甲醛和戊二醛固定可使得 DNA產(chǎn)量降低，醋酸甲醇（MAA ）可導(dǎo)致DN A明顯降解。Michel '運(yùn)輸保存液或PBS存放組織雖提取 DNA純度高，但產(chǎn)量明顯降低。Dubeau等也觀 察到含苦味酸（ Bouin 氏液）和含氯化汞的固定液（ Zenker,Bs ）處理標(biāo)本不能獲得完整的 DNA。乙醇被認(rèn)為是保存核酸的最佳固定劑。W

9、u等（1990 ）用無水乙醇固定標(biāo)本 48h，最長達(dá)2年，均可得到中量的高分子 DNA。每mm3乙醇固定標(biāo)本平均 DNA產(chǎn)量為26.6屈高于新鮮標(biāo)本（19.4 g/mm3）。 經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，乙醇固定組織 DNA 均顯示由于重復(fù) DNA 序列存在所產(chǎn)生的特征性衛(wèi)星帶，說明 DNA 被完成消化。 Southern 印跡雜交結(jié)果與冰凍組織一致。Sato等（1990 ）用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好無損。其基本方法為：將組織放至 4 'C丙酮浸透，移至-20'C過夜。然而再用丙酮分別在 4 °和室溫脫水各15min， 苯甲酸透明

10、兩次，每次 15min，最后60 C真空浸蠟2 3h，石蠟包埋。結(jié)果顯示，每 10mg AMex法處理 的濕重組織提高分子量 DNA71.4± 14.53 gg，與新鮮組織產(chǎn)量相當(dāng)（70.4 ±13.76 gg。酶切、電泳和雜交反 應(yīng)亦相同于新鮮組織。提示 AMex 法是一種多用途組織處理技術(shù)，可以克服由于 DNA 降解、高分子量 DN A 減少和內(nèi)切酶不完全消化所產(chǎn)生的電泳類型改變，是一種理想的DNA 保存方法，特別適用于對形態(tài)學(xué)、免疫表型和基因改變的相關(guān)性分析。2固定時間對 DNA 的影響固定過程中所發(fā)生的組織反應(yīng)至今尚未被完全更理解，雖然理論上講室溫 下福爾馬林與 D

11、NA 幾乎不發(fā)生反應(yīng)， 但已發(fā)現(xiàn)堿基與組蛋白之間的甲基交聯(lián)。 這種福爾馬林介導(dǎo)的甲基化 直接影響 DNA 提取的效率。如果事實(shí)果真如此，那么固定的時間是一個重要的變異因素。然而，Goelz 等沒有發(fā)現(xiàn)固定時間對 DNA 提取質(zhì)量的明顯影響。 Dubeau 等認(rèn)為組織固定時間太短或太長均會導(dǎo)致 DNA 的降解。該作者對固定 12h 到 5天不同時間間隔標(biāo)本的 DNA 提取顯示，隨著固定時間的延長，可螺旋化 （Spoolable ）的高分子量 DNA 明顯減少。固定 5 天后可螺旋化 DNA 提取率僅有 8%。 Warford 等也發(fā)現(xiàn) 單細(xì)胞懸液經(jīng) 30min 福爾馬林固定后， DNA 產(chǎn)量減少

12、到 30% ，由此可見，不同標(biāo)本對不同固定劑所需的 最佳固定時間應(yīng)摸索選定。根據(jù) Dubeau 等經(jīng)驗(yàn)，常規(guī)組織固定應(yīng)在 12h 以上至 110 之內(nèi)。3固定溫度等其他因素對 DNA 的影響核酸與固定劑的反應(yīng)由反應(yīng)成分、濃度、酸鹼度以及溫度等因 素的調(diào)節(jié) ，其中溫度效應(yīng)顯得特別重要。 室溫下 DNA 雙股螺旋鏈表現(xiàn)為兩條由氫鍵連接在互補(bǔ)多聚核苷 酸；加熱到65 C時，氫鍵開始斷裂；約 90°時，產(chǎn)生兩條單鏈分子。在此變性狀態(tài)下，甲醛與酸反應(yīng)很快， 通過羥甲基化作用可抑制 DNA 冷卻后的再復(fù)性。最近， Koshiba 等發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定過程中的 DNA 降解，是由于固定溫度高， pH

13、 低以及甲酸的存在 所致。通過應(yīng)用緩沖福爾馬林和低溫下固定（4C），可以明顯改善 DNA保存。酸性環(huán)境中 DNA 的降解已有過深入的研究。一般認(rèn)為，強(qiáng)酸可導(dǎo)致 DNA 的完全解聚，而弱酸也能引 起一些結(jié)構(gòu)的改變。當(dāng) pH 達(dá)到 2.5 以下時，幾乎所有的堿基之間氫鍵解離，使 DNA 雙鏈斷裂而產(chǎn)生不可 逆的變性；隨后出現(xiàn) N-糖苷鍵水解，使嘌吟殘基游離；最后，多聚核苷之磷酯鍵緩慢水解，僅殘留具有完 整嘧啶的多聚脫氧核糖短臂。上述改變亦受溫度或離子強(qiáng)度的影響。加入鹽或降低溫度可穩(wěn)定氫鍵，因而 可防止酸性條件下的 DNA 變性。然而，即使福爾馬林被氫氧化鈉中和，在室溫下 DNA 亦發(fā)生降解，提示

14、福爾馬林本身即可降解 DNA。福爾馬林中DNA降解的機(jī)理及其預(yù)防有待于進(jìn)一步研究。4組織處理過程對 DNA 的影響我們發(fā)現(xiàn)， 從常規(guī)組織處理的蠟塊中提取的 DNA ，其大部分分子量在 100bplOOObp之間，主要分布于1001500bp，僅約1/3的組織所提取 DNA>20kb。這除與固定劑、固 定時間等因素有關(guān)外，可能的原因還有：組織從外科切除到固定之間的時間長短不一。當(dāng)組織未固定或 固定不充分時， 核酸酶可自由作用； 不同腫瘤中核酸酶的水平不一， 其在固定前或固定后均不發(fā)揮作用； 蠟塊貯存的時間長短不一。 雖然從不同貯存時間的蠟塊中提取的 DNA 大小無絕對區(qū)別， 但新近的蠟塊比

15、 貯存 10 年以上的標(biāo)本所獲得的 DNA 分子量大。可能蠟塊中仍存在導(dǎo)致 DNA 降解的因素。組織的浸蠟和包埋溫度過高或時間過長，均可導(dǎo)致 DNA 變性，而產(chǎn)生單鏈 DNA 片段。單鏈 DNA 不 能被限制性內(nèi)切酶所消化，可導(dǎo)致電泳時泳動速率變慢。三、提高 DNA 提取質(zhì)量的方法1蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織標(biāo)本中未能提出完整的高分子量DNA 的重要原因之一，是應(yīng)用了固定不充分的組織。因此，在 DNA 提取前應(yīng)檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結(jié)構(gòu)不清，大片出 血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或?qū)乃啦糠智腥ズ笤儆谩１M可能地選用新 近標(biāo)本，緩沖福爾馬林、丙酮和乙醇固

16、定者最佳。2DNA 提取方法學(xué)的改善為了提高石蠟包埋組織DNA 提取的質(zhì)量和效益， 人們從不同方面進(jìn)行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化時間和 DNA純化等問題上取得了進(jìn)展。 DNA提取液主要 含SDS和蛋白酶K的TE緩沖液。固定和包埋組織由于化學(xué)修飾作用，使得DAN與蛋白質(zhì)不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時間：SDS可增至1%2%，蛋白酶K200500gg/ml，最 高可達(dá)1mg/ml ;作用時間一般為24天，最長可達(dá)7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不時震搖，使酶 與組織充分接觸。 Koshiba 等發(fā)現(xiàn)， 利用 Goelz 等和 Dubeau 等提出的 DN

17、A 提取方法， 不能夠得到令人滿 意的完整DNA。尿素和胍（guanidine ）是DNA自然和人工交聯(lián)最有力的剝脫劑，2-巰基乙醇可干擾二硫鍵，促進(jìn)蛋白變性。作者對 DNA 提取液進(jìn)行了改良，加入高濃度（ 4mol/L ）尿素和 2-巰基乙醇。應(yīng)用此 緩沖液，有效地從包埋組織中獲得高質(zhì)量DNA。DNA釋放率對于不同的組織類型是有差異的，取決于組織細(xì)胞密度和細(xì)胞外間質(zhì)的多少。對于細(xì)胞豐富、含有很少間質(zhì)的組織（例如脾臟），通過24h 孵育 80%以上 DNA 可釋放出來；相同量的 DNA 釋放對于富含致密間質(zhì)的子宮肌瘤則需要 6 天時間；轉(zhuǎn)移性畸胎瘤含中等細(xì)胞密度和疏松的間質(zhì)， DNA 釋放率亦

18、為中等。由此可見，對不同類型的組織 DNA 提取，蛋 白酶K的孵育時間可作適當(dāng)調(diào)整，以求最大量地獲取大分子DNA。此外，對于Dubeau等提出的DNA提取過程中分次消化步驟的必要性，也有人提出異議。因?yàn)榈汀⒅蟹肿恿康暮怂岽嬖趯ο拗菩詢?nèi)切酶的消化 和雜交不起作用。Dubeau等發(fā)現(xiàn)，不適于進(jìn)行酶切反應(yīng)和雜交研究的化學(xué)修飾的DNA，可通過攪起完整的 DNA 而被動除去，因而強(qiáng)調(diào)了螺旋化( spooling )在 DNA 純化中的重要性。該作者還發(fā)現(xiàn)延長組織 固定時間的影響之一就是減少了可螺旋化 DNA 的量，雜交分析顯示，螺旋化 DNA 雜交信號強(qiáng)，而未螺旋 化 DNA 信號減弱。因此，增加 DN

19、A 螺旋化可提高提取 DNA 質(zhì)量和雜交效率。但是， Moerkert 等認(rèn)為未 螺旋化 DNA 不影響進(jìn)行點(diǎn)雜交分析。3避免 DNA 機(jī)械性損傷福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅(jiān)韌，很難達(dá)到勻漿的效果。經(jīng)常的做法是將組織切成35薄片，使每一細(xì)胞都被切開。但是，我們認(rèn)為切片太薄，容易過多地將DNA切斷， 影響高分子量DNA的獲得率。最好是采用1520gm的厚切片。高濃度蛋白酶K消化24天，使能達(dá)到 細(xì)胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并盡可能避免機(jī)械性勻漿過程造成的DNA 剪切。此外， 在 NDA 釋放出來以后的提取過程中， 應(yīng)盡可能輕柔操作， 避免過多地移管。若必需移管時應(yīng)選 用大口吸管。盡可

20、能避免人為的 DNA剪切。純化DNA用TE (pH8.0 )溶解放4。保存即可，若短期不用 時應(yīng)-20。凍存，但切忌反復(fù)凍融，以免 DNA降解。四、石蠟包埋組織 DNA 分析的方法學(xué)由于 DNA 提取方法的改善和 DNA 質(zhì)量的提高，幾乎所有基因分析的技術(shù)均可用于石蠟包埋組織，但 目前分子病理學(xué)研究的常用方法是點(diǎn)雜交、 Southern 印跡雜交和多聚酶鏈反應(yīng)( PCR )。1 點(diǎn)雜交 鑒于包埋組織 DNA 有一定程度的降解，因而點(diǎn)雜交被認(rèn)為是一種簡便、快速和實(shí)用的 方法，特別適用于較大樣本的篩選。Dyall - smith等(1988 )采用未經(jīng)抽提的蛋白酶消化產(chǎn)物直接點(diǎn)膜，進(jìn)行點(diǎn)雜交分析，

21、在 3 周內(nèi)對 200 多病例進(jìn)行篩選，對陽性病例和很難解釋的弱陽性斑點(diǎn)，再進(jìn)行原位雜 交等方法作進(jìn)一步證實(shí)。2Southern 印跡雜交 Southern 印跡雜交是經(jīng)典的基因分析技術(shù)，已被廣泛地用于基因突變，擴(kuò)增、 重排和丟失等許多方面的研究。石蠟包埋組織的 Southern 印跡雜交分析有以下幾個方面值得注意：(1 )當(dāng)所分析的酶切片段長為 300500bp時，包埋組織DNA雜交信號強(qiáng)度只有相同量標(biāo)準(zhǔn) DNA 的10%85%。信號強(qiáng)度與原始 DNA大小呈正相關(guān)，最小片段 DNA產(chǎn)生最弱的信號。(2) 包埋組織 DNA 所致的非特異性背景雜交比標(biāo)準(zhǔn)DNA 為明顯。這種背景雜交的產(chǎn)生可能是由

22、于不包含到分析基因中兩個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的小片段DNA 存在。(3) 由于背景雜交明顯使得信號模糊，信/噪比縮小。根據(jù) Goelz 的經(jīng)驗(yàn)，約有 25%石蠟包埋組織不 適于作 Southern 印跡雜交。4 ）某些限制性酶切片段的電泳速度比標(biāo)準(zhǔn) DNA 稍遲緩?？赡艿脑蚴?DNA 直接或間接的化學(xué)改 變使某些限制性酶切位點(diǎn)失活和 /或單鏈 DNA 存在。（5 ）由于小片段 DNA 的存在，故用作雜交分析的 DNA 量應(yīng)適當(dāng)增加，以增強(qiáng)雜交信號。3PCR 分析 PCR 技術(shù)是近年來分子生物學(xué)技術(shù)的典范， 已被廣泛地用于分子病理學(xué)的各個領(lǐng)域。 此 技術(shù)不但特異性好和敏感性高，而且簡便、快速、

23、模板 DNA 要求不高，特別適于石蠟包埋 DNA 的分析。用于 PCR 擴(kuò)增的 DNA 提取比較簡單， 既使少量 DNA 樣品亦能產(chǎn)生大量特異性 DNA 拷貝。 已被成功 地用于各代木乃伊 DNA的分析，小至1mm2的HE染色切片提取的DNA亦可獲得滿意的擴(kuò)增，并可用于 診斷。但是，為了提高 PCR 的敏感性和可重復(fù)性，模板 DNA 應(yīng)盡可能地純化，除去提取物中某些抑制 P CR 反應(yīng)的成份。此外，切片過程中要注意防止污染，以免出現(xiàn)假陽性。最近， Davis 等（ 1 993 ）對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)型多態(tài)性（ SSCP ）分析，可以提高 PCR 敏感性 5 倍以上。SSCP分析是應(yīng)用單鏈

24、DNA在非變性聚丙酰胺凝膠上電泳，根據(jù)序列的不同所產(chǎn)生的構(gòu)型差異來 分析 PCr 產(chǎn)物。此分析能檢測出小到一個堿基的差異，因而可被廣泛地用于研究點(diǎn)突變和基因多態(tài)性。此外，在包埋組織的DNA提取中往往發(fā)現(xiàn)有 RNA的存在。這些未加任何保護(hù)而免受降解的 RNA，不 可能是完整的序列。 然而， 此發(fā)現(xiàn)提示用福爾馬林固定的組織亦可作為 Northern 印跡雜交分析的可能材料 來源。五、分子病理學(xué)研究中的應(yīng)用1基因重排分析與淋巴瘤的診斷分子生物學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用，目前僅限于淋巴瘤/白血病。淋巴瘤以具有特異性抗原受體基因重排的單一性細(xì)胞增殖為特征。因此，克隆性免疫球蛋白（lg）和T-細(xì)胞受體（TC

25、R）基因重排的檢出可作為淋巴瘤診斷的重要指標(biāo)，這在國外許多實(shí)驗(yàn)室已成為常規(guī)診斷技術(shù)。Southern 印跡雜交和 PCR 都已被成功地用于基因重排分析。此技術(shù)在下列病變的診斷和鑒別診斷中特別有意義：惡性淋巴瘤與反應(yīng)性淋巴組織增生的鑒別。后者為多克隆性細(xì)胞增生，不能檢出或擴(kuò)增出克隆性基因重排序列；T和B細(xì)胞性腫瘤的區(qū)分：PCR3基因重排支持T細(xì)胞源性，而lg重鏈基因則為 B 細(xì)胞源性。然而，一部分病例顯示 lg 和 TCR 基因雙重排。在這種情況下，要結(jié)合其他基因分析。若同 時伴有l(wèi)g輕鏈（K或人）基因重排則支持B細(xì)胞腫瘤；同時伴有TCRr或TCRs基因重排則為T細(xì)胞腫瘤。 另外，也可結(jié)合免疫分

26、型。雙基因重排的腫瘤往往一種基因?yàn)椴煌耆嘏?、不伴有相?yīng)的抗原受體表達(dá)， 故免疫表型上往往是單一的。 T細(xì)胞性淋巴瘤的診斷，T細(xì)胞腫瘤形態(tài)變化多端、免疫表型上無克隆性 標(biāo)記，故對此類淋巴瘤均有必要進(jìn)行基因分型。T細(xì)胞優(yōu)勢性B細(xì)胞淋巴瘤。這種腫瘤在形態(tài)和免疫表型上很難建立診斷。殘留病變監(jiān)測和復(fù)發(fā)的早期診斷。此技術(shù)還可用于識別骨髓的累及、治療或骨髓移 植后殘余病變的檢測，以及形態(tài)學(xué)上不能察覺的早期復(fù)發(fā)的診斷。</P< p>某些淋巴瘤 /白血病所伴有的特異性染色體易位是另一種類型的基因重排標(biāo)記。例如濾泡型淋巴瘤中常出現(xiàn)的t (14 : 18)易位，Burkitt氏淋巴瘤的t ( 8

27、 : 14八t (8 : 2 )和仁8 : 22)易位，以及慢?；蚣绷馨籽?病中常見的 t( 9： 33)易位。因上述基因重排在淋巴瘤中出現(xiàn)頻率不高，故診斷應(yīng)用價(jià)值不大。2癌基因與抗癌基因的研究分子生物學(xué)在腫瘤病理學(xué)中另一熱點(diǎn)是癌基因和抗癌基因的研究。自從1981 年 Weinberg 等首先報(bào)道人癌基因分離成功以來， 至今已有 50 多種癌基因被發(fā)現(xiàn)， 這些基因普遍存在 于各種生物細(xì)胞中，對于細(xì)胞的生長和分化起著重要作用。在正常情況下，其表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控；病理狀 態(tài)下，癌基因活化，表達(dá)失控，使細(xì)胞原有的正常生物學(xué)性狀發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。據(jù)報(bào)道，癌 基因的結(jié)構(gòu)和功能改變見于造血系統(tǒng)、乳

28、腺、粘膜鱗狀上皮、前列腺、肺、腎、消化道、膀胱、卵巢、消 化腺、神經(jīng)系統(tǒng)和軟組織等腫瘤。另一類基因稱抗癌基因或抑癌基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有p53、Rb、DCC、WTi和NFi等。其蛋白產(chǎn)物的功能是阻滯癌基因所編碼多肽的活性。因此，如果抗癌基因發(fā)生突變或功能喪失，異常的癌基因產(chǎn)物表達(dá)失 控，而誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤。此現(xiàn)象為見于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜、結(jié)腸、食管等各部位的腫瘤。目前，對人類腫瘤中癌基因和抗癌基因的檢測，已經(jīng)在腫瘤的分類、發(fā)病機(jī)理、腫瘤生物學(xué)行為和預(yù) 后的關(guān)系等方面與腫瘤臨床密切結(jié)合起來，并正在逐漸地應(yīng)用于腫瘤的診斷、鑒別診斷和治療。( 1)癌變機(jī)理的研究:癌基因活化和抗癌基因失活在人類腫

29、瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。已有大 量證據(jù)表明，至少需要兩種以上的癌基因活化的協(xié)同作用才能使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。目前研究發(fā)現(xiàn)絕 大多數(shù)腫瘤有一種以上的癌基因過度表達(dá)，一種癌基因?qū)Π屑?xì)胞的永生化起重要作用，而另一種則促進(jìn)細(xì) 胞的永生化。(2) 腫瘤生物學(xué)待業(yè)和預(yù)后的研究:某些癌基因突變及其產(chǎn)物的過度表達(dá)與癌細(xì)胞的分化和惡性程度有關(guān)。目前研究最多的是 c -jrbB - 2與乳腺癌的關(guān)系。許良中等(1992 )發(fā)現(xiàn)，浸潤性導(dǎo)管癌中 c - e rbB - 2陽性表達(dá)率達(dá)67%以上，單純癌陽性率為26.5%，而全部乳癌良性病變皆陰性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，c -erbB 過度表達(dá)的乳腺癌預(yù)后不良，Sc

30、himmelpenning 等(1992 )也報(bào)告伴有c -erbB 擴(kuò)增的導(dǎo)管內(nèi)癌易于發(fā)生周圍浸潤。此外， ras P21 在乳腺癌中的表達(dá)也有上述趨勢。(3) 輔助診斷和鑒別診斷: bc1-2 基因已被用于濾泡型淋巴瘤與反應(yīng)性濾泡增生的鑒別診斷，前者陽 性表達(dá)率在 80% 以上，而后者幾乎為陰性； ras 癌基因突變或過度表達(dá)有助于甲狀腺乳頭狀癌、乳腺導(dǎo)管 癌、結(jié)腸腺癌等腫瘤的診斷；小細(xì)胞肺癌常伴有 n - myc突變。(4) 癌細(xì)胞的組織發(fā)生：paget氏病可分乳腺外(EPD )和乳腺內(nèi)(MPD )兩種。有關(guān)paget細(xì)胞 的起源問題仍有爭議。 許良中(1993 )觀察了 c -erbB - 2和p53在77例EPD和10例MPD中的表達(dá)， 認(rèn)為 MPD 中的 paget 細(xì)胞是來源于腺癌細(xì)胞而不是表皮的角質(zhì)層細(xì)胞。 EPP 中的 paget 細(xì)胞也來源于腺 癌細(xì)胞，但這種腺癌細(xì)胞與 MPD 中的腺癌細(xì)胞不