破壁及提取方法對蜂花粉營養(yǎng)及保健成分提取的影響

1、破壁及提取方法對蜂花粉營養(yǎng)及保健成分提取的影響摘 要：本文以茶花粉為原料，利用熱水法、纖維素 酶法、堿性蛋白酶法和雙酶法（即纖維素酶和堿性蛋白酶聯(lián) 合處理） 4 種方法對花粉進行破壁處理，采用溫水、溫水超 聲波、酸法、酸法超聲波、乙醇、乙醇超聲波、溫水乙醇、 酸法乙醇 8 種方法對破壁后的花粉進行提取，研究破壁及提 取方法對蜂花粉營養(yǎng)及保健成分提取的影響。關(guān)鍵詞：茶花蜂花粉 破壁 纖維素酶 堿性蛋白酶 營養(yǎng) 成分花粉是指裸子植物和被子植物的雄性配體 1 ，它包含著 孕育一個植物新生命所需的營養(yǎng)成分2 。蜂花粉是蜜蜂采集植物的花粉加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花粉形成的 不規(guī)則扁圓形團狀物 3

2、 ，包括 22 種氨基酸、 14 種維生素和 30 多種微量元素以及多種活性蛋白、核酸、激素、黃酮類化 合物及其他的活性物質(zhì) 4 。從成分上來看，蜂花粉中蛋白質(zhì) 為7%35%,碳水化合物為 40%50%,脂肪為5%10%5。 蜂花粉作為營養(yǎng)型、功能型、保健型食品原料日益受到重視6 。花粉的細胞壁非常堅韌,具有耐酸、耐堿、耐溫、耐壓 等特性,不僅影響蜂花粉營養(yǎng)成分的吸收利用,也阻止了蜂 花粉提取時營養(yǎng)物質(zhì)的釋放,成為限制蜂花粉的深層開發(fā)利用的一個關(guān)鍵技術(shù)難題 7相關(guān)研究表明，通過對花粉進行破壁處理，可以提高花 粉的營養(yǎng)利用效率 8 。近年，花粉破壁的研究成為蜂花粉研 究的熱點問題，人們相繼報道了

3、超聲波破壁法9 、酵母發(fā)酵法10 、酶解破壁法 11和滲透壓破壁法 12，13等方法，但 針對各種花粉破壁方法對花粉內(nèi)容物的提取及其營養(yǎng)保健 成分的影響則缺乏系統(tǒng)研究。目前，在生產(chǎn)中常用的花粉破 壁方法是熱水破壁及酶解破壁，其中酶解常用纖維素酶、蛋 白酶及復(fù)合酶等 3 ，如郝曉亮等 14 采用復(fù)合纖維素酶對松 花粉的破壁進行了研究，楊曉萍等15 發(fā)現(xiàn)由蛋白酶、果膠酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶能有效釋放花粉內(nèi)溶物，董捷等 3，6研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶有利于花粉萌發(fā)孔的打開。本文 的主要目的是比較常用破壁方法（熱水破壁法、蛋白酶水解 法、纖維素酶水解法及復(fù)合酶水解法）對蜂花粉營養(yǎng)保健成 分提取的影響，為蜂

4、花粉的精深加工提供理論參考。1 材料與方法1.1 原料及藥品茶花粉（含水量12%,粉碎過60目篩，-20C保存?zhèn)溆茫? 分析純氫氧化鈉、無水乙醇、無水乙醚、濃硫酸、鹽酸、硼 酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等（國藥 集團化學(xué)試劑有限公司） ；纖維素酶和堿性蛋白酶（諾維信 （中國）生物技術(shù)有限公司） 。1.2 儀器設(shè)備HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 （上海精宏實驗設(shè)備有限公司） ；LA120S型分析天平和BS223S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；LXJ-IIB型低速大容量離心機 （上海安亭 科學(xué)儀器廠）；FE-20臺式酸度測定儀（梅特勒-托利多儀器（上 海）有限公司）；W

5、CJ-802磁力加熱攪拌器（國華電器有限公 司）； 7200 可見分光光度計 （尤尼可分析儀器設(shè)備有限公司） ； FW80 高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器設(shè)備有限公司） ； 101-3B型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市實驗儀器總廠）；8100弗斯凱氏定氮儀（北京中儀友信科技有限公司） 。1.3 花粉的破壁處理（1） 加熱破壁處理。稱取花粉 40g，按料水比1 : 5加 水，加熱煮沸，保持 30min， 4000r/min 離心 10min ，收集上 清液和沉淀。（2） 纖維素酶破壁處理。稱取花粉40g，按料水比1 :5加入pH4.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。按花粉稱取量15% 的比例加入纖維素酶，在

6、 55 C下，酶解5h , 4000r/min離心 10min，分別收集上清液和沉淀。（3） 堿性蛋白酶破壁處理。稱取花粉40g,按料水比1:5 加入 pH8.0 的磷酸二氫鈉 -磷酸氫二鈉緩沖液。按花粉稱取 量1%的比例加入堿性蛋白酶， 在55 C下，酶解3h ,4000r/min 離心10min，分別收集上清液和沉淀。(4) 雙酶聯(lián)合破壁處理。稱取花粉40g，按料水比1 :5加水，調(diào)pH值到pH4.5，按花粉稱取量15%的比例加入纖 維素酶，在55C下，酶解5h，將溶液的pH調(diào)至8.0，按花 粉稱取量1%的比例加入堿性蛋白酶，在 55 C下，繼續(xù)酶解3h, 4000r/min離心10min

7、，分別收集上清液和沉淀。1.4花粉營養(yǎng)保健成分的提取方法 以各種破壁處理后所得的沉淀進行提取，收集提取液并和破壁上清液合并，測定各項指標。提取方法如下：(1)溫水提取。按料水比 1: 5加水，加熱至50C，保持30min , 4000r/min離心10min，收集提取液。(2)溫水超聲波提取。按料水比1:5加水，加熱至50C,超聲波提取 30min , 4000r/min離心10min，收集提取液。(3)酸法提取。按料水比1: 5加入pH3.7的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，提取30min , 4000r/min離心10min，收集提取液。( 4)酸法超聲波提取。按料水比 1: 5 加入 pH3.

8、7 的檸 檬酸 -磷酸氫二鈉緩沖液，超聲波提取 30min ， 4000r/min 離 心 10min ，收集提取液。( 5)乙醇提取。按料水比 1 : 5 加入無水乙醇， 提取 30min ， 4000r/min離心10min ,將提取液和破壁上清液合并， 收集提 取液。6)乙醇超聲波提取。按料水比 1 : 5 加入無水乙醇， 超聲波提取 30min , 4000r/min離心10min，收集提取液。(7) 溫水乙醇提取。按料水比 1: 5加水，加熱至50C 提取30min后，4000r/min離心10min，將沉淀按料水比 1： 5加入無水乙醇，繼續(xù)提取 30min， 4000r/min

9、離心 10min， 收集提取液。(8) 酸法乙醇提取。按料水比1： 5加入pH3.7的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液提取 30min ， 4000r/min 離心 10min ， 將沉淀按料水比 1： 5 加入無水乙醇，繼續(xù)提取 30min， 4000r/min離心10min，收集提取液。1.5測定方法( 1)干重的測定。直接干燥法，參見 GB 5009.3-2010 食品中水分的測定 。( 2)總糖的測定。酸水解后用3， 5-二硝基水楊酸比色法測定 17 。(3) 總脂肪的測定：索氏提取法，參見GB 5512-1985 糧食、油料檢驗粗脂肪測定法 。(4) 蛋白質(zhì)的測定。 凱氏定氮法， 參見 GB

10、/T 5009.5-2010 食品中蛋白質(zhì)的測定 。(5) 總酚的測定。福林酚比色法，參見GB/T 8313-2008 福林酚法測定花粉總酚含量 。2 結(jié)果與分析2.1 破壁及提取方法對花粉可溶性成分總提取得率的影以提取物干重為指標計算可溶性成分總提取得率，考察 破壁及提取方法對花粉提取的影響，結(jié)果表明，無論用何種 提取方法，采用堿性蛋白酶、纖維素酶或者雙酶聯(lián)合破壁， 總提取得率都明顯高于用熱水法破壁，說明纖維素酶及蛋白 酶破壁都能大幅度增加花粉可溶性成分提取得率。此外，對 比水相和醇相可溶性成分提取得率發(fā)現(xiàn)，用水相溶劑（溫水 或酸性溶液）比用乙醇獲得的提取得率高，說明花粉中水溶 性成分的含量

11、高于醇溶性物質(zhì)；對比超聲波及未用超聲波的 試驗組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲波對可溶性成分總提取得率沒有影響； 不論對于何種破壁方法，用溫水乙醇和酸法乙醇提取所獲的 總提取得率高于單獨用水相溶劑或乙醇提取，說明花粉含有 醇溶性和水溶性兩類可溶性物質(zhì)，用水和乙醇分別進行兩次 提取可提高可溶性物質(zhì)的提取得率。破壁及提取方法對花粉 可溶性成分總提取得率的影響見表 1。2.2 破壁及提取方法對花粉糖類物質(zhì)提取的影響以總糖提取得率為指標，考察破壁及提取方法對花粉糖 類物質(zhì)提取的影響，結(jié)果表明，無論用何種提取方法，采用 纖維素酶破壁或者將纖維素酶和堿性蛋白酶聯(lián)合進行雙酶 破壁，它們的提取得率最高。用纖維素酶處理和雙酶處

12、理的 糖類物質(zhì)提取得率差不多，這說明纖維素酶對糖類物質(zhì)提取 具有重要促進作用，而蛋白酶的作用不明顯。對比各種提取 方法獲得的提取得率發(fā)現(xiàn)，不論對于何種破壁方法，用水相溶劑（溫水或酸性溶液）比用乙醇為溶劑的提取得率高，說 明用水相溶劑更有利于花粉糖類物質(zhì)的提?。粚Ρ瘸暡?未用超聲波的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲波對花粉糖類成分的提取 沒有影響；此外，用溫水乙醇和酸法乙醇提取獲得的糖類物 質(zhì)提取得率并不比單獨用溫水或酸性溶液提取得率高，說明 花粉中糖類物質(zhì)僅用水相溶劑就可以充分提取。破壁及提取 方法對花粉糖類物質(zhì)提取的影響見表2。2.3 破壁及提取方法對花粉蛋白質(zhì)提取的影響 利用凱氏定氮法測定提取出的蛋

13、白質(zhì)含量，結(jié)果表明， 無論用何種提取方法，用纖維素酶處理或堿性蛋白酶單獨處 理，提取得率都高于用熱水處理，這說明纖維素酶和堿性蛋 白酶對花粉蛋白質(zhì)的提取具有促進作用。將纖維素酶和堿性 蛋白酶聯(lián)合進行雙酶破壁，提取得率最高，說明雙酶聯(lián)合破 壁比單酶處理更有利于花粉蛋白質(zhì)的提取。對比各種提取方 法的蛋白質(zhì)提取得率發(fā)現(xiàn)，不論用何種方法對花粉進行破壁， 提取方法對蛋白質(zhì)提取的影響不大，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能 是蛋白質(zhì)是水溶性物質(zhì)，在破壁時就大量溶解在破壁液中， 而破壁沉淀中含量較少，因此在用溶劑進行提取所獲得的蛋 白質(zhì)并不多。破壁及提取方法對花粉蛋白質(zhì)提取的影響見表 3。2.4 破壁及提取方法對花粉脂肪

14、提取的影響 測定提取物中花粉脂肪含量，計算脂肪提取得率，結(jié)果 表明，無論用何種提取方法，將纖維素酶和堿性蛋白酶聯(lián)合 進行雙酶破壁，它們的提取得率最高。用纖維素酶處理或堿 性蛋白酶單獨處理，提取得率都高于用熱水處理。該結(jié)果說 明纖維素酶和堿性蛋白酶處理能促進花粉脂肪的提取，且雙 酶聯(lián)合破壁比單酶處理的提取得率更高。對比各種提取方法 發(fā)現(xiàn)，不論對于何種破壁方法，用水相溶劑（溫水或酸性溶 液）比用乙醇為溶劑的提取得率低，說明用乙醇為溶劑比用 水相溶劑更有利于花粉脂肪提取；用溫水乙醇和酸法乙醇提 取獲得的脂肪提取得率并不比單獨用乙醇提取所獲得的得 率高，說明用乙醇和水相溶劑進行倆次提取沒有增效作用。

15、此外，對比超聲波及未用超聲波的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲波對 花粉脂肪提取具有促進作用。破壁及提取方法對花粉脂肪提 取的影響見表 4。2.5 破壁及提取方法對酚類物質(zhì)提取的影響 測定提取物中總酚含量， 計算總酚提取得率， 結(jié)果表明， 對于酚類物質(zhì)的提取，無論用何種提取方法，用纖維素酶處 理或堿性蛋白酶單獨處理，提取得率都高于用熱水處理，將 纖維素酶和堿性蛋白酶聯(lián)合進行雙酶破壁，它們的提取得率 最高。這說明用纖維素酶和堿性蛋白酶處理花粉可促進酚類 物質(zhì)的提取，而雙酶聯(lián)合破壁對酚類物質(zhì)提取具有增效作用。 對比各種提取方法的總酚提取得率發(fā)現(xiàn)，不論對于何種破壁 方法，用乙醇提取法和乙醇超聲提取所獲的總粉提取得率都 明顯高于酸法超聲、酸法提取、溫水超聲和溫水提取法的提 取得率。該結(jié)果說明乙醇比水相溶劑更適合提取花粉中的酚 類物質(zhì)。此外，用溫水乙醇和酸法乙醇提取獲得的總酚提取 得率并不比單獨用乙醇提取所獲得的得率高，說明用乙醇和 水相溶劑進行兩階段提取沒有增效作用。破壁及提取方法對 花粉酚類物質(zhì)提取的影響見表 5 。3 結(jié)論與熱水破壁法相比，采用堿性蛋