SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、SDS PAG E測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、前言聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡(jiǎn)稱PA GE,就是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)得一種常用電泳技術(shù)。 聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺與甲 叉雙丙烯酰胺聚合而成 ,聚合過(guò)程由自由基催化完成。催化聚合得常用方法有兩種：化學(xué)聚合法與光聚合法?；瘜W(xué)聚合以過(guò)硫酸銨(APS )為催化劑，以四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。在聚合過(guò)程中,TEMED 催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基 ,后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合 ,同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)， 從而形成三維網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)。PAGE 根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng) ,分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中

2、緩沖液 pH 值及凝膠濃度相同 ,帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷與分子篩效應(yīng)。 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成 分,pH,凝膠濃度及電位梯度得不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅 有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng) ,還具有濃縮效應(yīng) ,因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。 不連續(xù)體系由電極緩沖液、 濃縮膠及分離膠所組 成。濃縮膠就是由AP催化聚合而成得大孔膠，凝膠緩沖液為P H 6、 7得Tr is-HC 1。分離膠就是由A P催化聚合而成得小孔膠，凝膠緩沖液為pH 8、9 Tri s -HCl.電極緩沖液就是pH8、3 Tris甘氨酸緩沖液.2種孔徑得凝膠、2種緩沖體系、3種P H值使不連續(xù)體系形成了

3、凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分得不連續(xù)性，這就是樣品濃縮得主要因素 .S DS就是陰離子去污劑，作為變性劑與助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)與分子間得氫鍵 ,使分子去折疊，破壞蛋白分子得二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇 ,二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間得二硫鍵斷裂。在樣品與凝膠中加入還原劑與 SDS 后，分子被解聚成多肽鏈， 解聚后得氨基酸側(cè)鏈與S D S結(jié)合成蛋白S DS膠束，所帶得負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白原有得電荷量 ,這樣就消除了不同分子間得電荷差異與結(jié)構(gòu)差異。SDS PA GE 一般采用得就是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng) 相比,能夠有較高得分辨率 .濃縮膠得作用就是有堆積作用，凝膠濃度較小 ,

4、孔徑較大，把較稀得樣品加在濃縮膠上， 經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠得遷移作用而被濃縮至一個(gè) 狹窄得區(qū)帶。當(dāng)樣品液與濃縮膠選 TRIS /HCI緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后,H C I解離成氯離子，甘氨酸解離出少量得甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子 最快,甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大 超過(guò)蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)， 而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比 ,因而產(chǎn)生較高得電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白與甘氨酸根離子迅速移動(dòng),形成一穩(wěn)定得界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層此鑒定方法中，蛋白質(zhì)得遷移率主要取決于它得相對(duì)分子質(zhì)量， 而與所帶電荷與分子形狀無(wú)

5、關(guān) .聚丙烯酰胺凝膠電泳作用原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ,具有分子篩效應(yīng)它有兩種形式 :非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Nati V e PAGE)及SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS P A G E);非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳得過(guò)程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)， 并依據(jù)蛋白質(zhì)得分子量大小、 蛋白質(zhì)得形狀及 其所附帶得電荷量而逐漸呈梯度分開。而S DS P AGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量得不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由sh api ro于196 7年建立，她們發(fā)現(xiàn)在樣 品介質(zhì)與丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑與強(qiáng)還原劑( SDS 即十二 烷基硫酸鈉)后 ,蛋白質(zhì)亞基得電泳遷移率主要取決于亞基分子量得大小

6、(可以忽略電荷因素 )。、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)S D S -P A GE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量得原理.2、掌握垂直板電泳得操作方法。3、運(yùn)用S D S PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。三、實(shí)驗(yàn)原理、電泳帶電顆粒在電場(chǎng)作用下 ,向著與其電荷相反得電極移動(dòng)得現(xiàn)象。在一定得電場(chǎng)強(qiáng)度下 , 分子在凝膠介質(zhì)中得遷移速率取決于分子得大 小、構(gòu)型與帶電量得大小 .2、 PAG E聚丙烯酰胺凝膠(P AG)就是由單體丙烯酰胺(Acr)與交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bi S )在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)與引發(fā)劑過(guò)硫酸銨(A P )得作用下聚合交聯(lián)而成得三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得凝膠。以此凝膠作為支持介質(zhì)得電泳稱為 P AG E

7、.PAGE具有電泳與分子篩得雙重作用。PAG機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，改變Acr濃度或Acr 與 Bis 得比例可以得到不同孔徑得凝膠。PAGE分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液 pH 值與凝膠中得相同、帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電 荷與分子篩效應(yīng)。 不連續(xù)系統(tǒng)中帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效 應(yīng)、分子篩效應(yīng)， 還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率 均較前者佳。3、SDS PA G E基本原理S D S P AGE就是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS與含有巰基乙醇得樣品處理液， SDS 就是一種很強(qiáng)得陰離子表面活性劑，它可以斷 開分子內(nèi)與分子間得氫鍵 ,

8、破壞蛋白質(zhì)分子得二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)得四級(jí)結(jié)構(gòu).使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子.解聚后得側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷得蛋白質(zhì)一S DS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合 SDS 陰離子后，所帶負(fù)電荷得量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了它 原有得凈電荷 ,從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷得差異。蛋白質(zhì)得電泳遷移率主要決定于亞基得相對(duì)分子質(zhì)量。 而與其所帶電荷 得性質(zhì)無(wú)關(guān)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)得分子量在 1 7, 00016 5 ,00 0之間時(shí)，蛋白質(zhì)一SD S復(fù)合物得電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量得對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系lgMW = K bm將已知分子量得標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在 SD S PAG E中得電泳遷移率

9、對(duì)分子量得對(duì)數(shù)作圖， 即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 只要測(cè)得未知分子量得 蛋白質(zhì)在相同條件下得電泳遷移率 ,就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量 .四、實(shí)驗(yàn)器材與材料試劑儀器:垂直板型電泳槽；直流穩(wěn)壓電源；50或10 0訕微量注射器、 玻璃板、水浴鍋，染色槽；燒杯 ;吸量管 ;常頭滴管等。原料:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)按照每種蛋白0、5-1mgml 1 樣品 溶解液配制可配制成單一蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液， 也可配成混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) 液試劑：(1 )分離膠緩沖液(T ris H C 1緩沖液PH8、9):取1 m ol / L鹽酸4 8mL,T r is 3 6、3 g，用無(wú)離子水溶解后定容至100m L;(2) 濃縮膠緩沖液

10、(Tri S-HCI緩沖液 PH 6、7):取1mol/L鹽酸4 8mL , T r is 5、98 g，用無(wú)離子水溶解后定容至 10 0 mL；(3) 3 0 %分離膠貯液 :配制方法與連續(xù)體系相同，稱丙烯酰胺(Acr) 3 0 g及N, N'-甲叉雙丙烯酰胺(B is)0、8g,溶于重蒸水中,最后定容至 100m 1 ,過(guò)濾后置棕色試劑瓶 中,4 保存;(4) 10 %濃縮膠貯液:稱 A C r 10 g及Bis 0、5g,溶于重蒸水 中,最后定容至 1 0 0mL ,過(guò)濾后置棕色試劑瓶中 ,4 貯存；(5 )10% S DS溶液:S DS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解；

11、(6) 1%TE M ED;(7) 10%過(guò)硫酸銨(A P ):現(xiàn)用現(xiàn)配;(8) 電泳緩沖液(Tris 甘氨酸緩沖液P H8、3):稱取Tris 6、0g,甘氨酸28、8g, S D S 1、0g ,用無(wú)離子水溶解后定容 至1L;(9 )樣品溶解液：取SD S 10 0 mg,巰基乙醇0、1 m L,甘油1 m L,溴酚藍(lán)2mg,0、2 m o 1 /L,p H 7、2磷酸緩沖液0、5mL,加重蒸水至1 0 mL (遇液體樣品濃度增加一倍配制)。用來(lái)溶解標(biāo)準(zhǔn) 蛋白質(zhì)及待測(cè)固體；(10)染色液：0、25g考馬斯亮藍(lán) G 250，加入4 5 4mL 50 %甲醇溶液與46 mL冰乙酸即可；(1 1

12、)脫色液:75 m L冰乙酸，875mL重蒸水與5 0 mL甲醇混勻。五、實(shí)驗(yàn)操作1、制膠玻板得清洗用海綿與洗滌劑輕柔地清洗，嚴(yán)禁使用刷子與顆粒狀得去污粉與 洗衣粉，完全沖洗干凈后烘干.2、垂直板電泳槽01沖 ft與課3、凝膠得制備分離膠得制備配制 12%分離膠。在燒杯中依次加入重蒸水 3、35ml, 分離膠緩 沖液(1、5mol /L Tr i s HC 1, pH 8、8) 2、5 ml , 10% SDS 0、1 m 1，凝膠儲(chǔ)備液4、0 m 1,10 %過(guò)硫酸銨50ul與TE ME D 10ul.由于A P與TEME D相遇后凝膠即開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液， 用移液槍抽取凝膠液加

13、至長(zhǎng)、 短玻璃板間得窄縫內(nèi)， 留出梳齒得齒高加1cm得空間停止灌膠，小心覆蓋一層蒸餾水，37 C 烘箱下聚合 （約30 min） 。待分離膠聚合完全后， 除去覆蓋得蒸餾水。濃縮膠得制備配制5%濃縮膠。在燒杯中依次加入重蒸水 2、9 2ml,濃縮膠緩沖液(0、5 m o 1 /L Tr i s HCl,pH6、8) 1、2 5m1, 10% SD S 0、05m 1，凝膠儲(chǔ)備液0、8m1 ,10 % 過(guò)硫酸銨25ul與TEMED 1 0ul。由于AP與TEMED相遇后凝膠即開始聚合 所以應(yīng)立即 混勻混合液 ,用移液槍抽取凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間得窄縫內(nèi) ,灌滿后小心插入梳齒，避免混入氣泡，3 7

14、 C烘箱下聚合（約30 m in）。4 、蛋白質(zhì)樣品得處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品得處理低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒：兔磷酸化酶B M W = 9 7,400牛血清白蛋白牛碳酸酐胰蛋MW=66,200 ?酶M W= 3 1, 000?白酶抑制劑MW二2 0 ,10 0雞蛋清溶菌酶MW=14,4O0 ?開封后，沸水浴中加熱3 5 m in后上樣。樣液得準(zhǔn)備用移液槍小心吸取處理好得血清5 0 ul至1、5 m l得離心管中,再加入50ul上樣緩沖液，混勻后沸水浴中加熱3 mi n,取出冷卻后 加樣。5 、加樣用移液器分別取51樣品液小心將樣品加到凝膠凹形樣品槽 底部。6、電泳將電泳儀得正負(fù)極與電泳槽正負(fù)極相連接，

15、 打開電泳儀開關(guān)， 設(shè) 置電壓為20 0 V,電泳6 0m in s,此時(shí)溴酚藍(lán)染料達(dá)到凝膠底部,停止電泳 ,關(guān)閉電源 .7 、染色與脫色電泳結(jié)束后 ,取下玻板，在自來(lái)水下用特制板撬開短玻璃板 ,從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記 ,在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。加入染色液染色60 mi n s,再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰 ,即可計(jì)算相對(duì)遷移率。8 、結(jié)果處理量出加樣端距細(xì)銅絲間得距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心 與加樣端得距離(cm )，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率m R:_ 蛋白質(zhì)樣品遷移距離（cm） R =浪酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離（fin）六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理1、實(shí)驗(yàn)

16、現(xiàn)象：脫色結(jié)束后，經(jīng)觀察可知，點(diǎn)有mak e r得孔跑出來(lái)得有5個(gè)清晰筆直得條帶，遷移率由低到高排列這5個(gè)條帶分別就是分別就是兔磷酸化酶B、牛血清白蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶菌酶。點(diǎn)有血清蛋白得點(diǎn)樣孔跑出得結(jié)果在分離膠與濃縮膠交界處出現(xiàn)一大團(tuán)成分未知著色團(tuán)，經(jīng)老師講解并且上網(wǎng)查閱資料得知這種現(xiàn)象可能就是所謂得“鬼帶”現(xiàn)象.“鬼帶”就就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜得蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）得一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要由于還原劑在加熱得過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離得蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合與亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要

17、比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同得免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)得抗體作用。處理辦法為：在加熱煮沸后,再添加適量得DTT或Be t a巰基乙醇，以補(bǔ)充不足得還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑得氧化.除此之外還觀察到存在“拖尾現(xiàn)象”。這主要就是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起得.處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)脴悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。5、4 5 cm2、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理：遷移距離(cm)2、182、7 83、124、035、09遷移率m0、400、5 10、570、740、93MW9 7 4Ig MW4

18、、994、824、494、304、16溴酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離:待測(cè)樣品遷移距離：5、18 c m由公式:1 g MW=K b m可得:當(dāng)m=5I g MW= 5、55 1 61、 5 8 67m18/5、4 5= 0、95 時(shí),lg MW =5、2 7,則:MW 10 9 6 5因此待測(cè)樣品得相對(duì)分子質(zhì)量約為1 0 9 65.七、思考題、在上樣緩沖液中 SDS 、巰基乙醇、甘油及溴酚藍(lán)得作用分別就是什么 ?答：SD S使蛋白質(zhì)變性，用于確定蛋白分子量得聚丙烯酰胺凝膠電泳，也可以用于核酸抽提操作中破壞細(xì)胞壁及裂解核酸蛋白復(fù)合 物，在乳液聚合反應(yīng)中 ,可充當(dāng)兩相溶液得乳化劑 ;巰基乙醇用于打開二硫

19、鍵得 ,使蛋白質(zhì)得四級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞；甘油使樣品處于下面，不易飄起 ,并有保護(hù)作用 ;溴酚藍(lán)用于顯色。2、在S DS-PAGE中，分離膠中得TEM ED與A P得作用就是什么?答:過(guò)硫酸銨(A P)為催化劑，四甲基乙二胺(T E MED )為加速劑。在聚合過(guò)程中，T EME D催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合 ,同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián),從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。3、樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘答：樣品液在沸水中加熱以除掉混在其中得一些小亞基 ,以免影響跑膠效果。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、不就是所有得蛋白質(zhì)都能用SD S -凝膠電泳法測(cè)定其分子量，已發(fā)現(xiàn)

20、有些蛋白質(zhì)用這種方法測(cè)出得分子量就是不可靠得。 包括: 電荷異?；驑?gòu) 象異常得蛋白質(zhì) ,帶有較大輔基得蛋白質(zhì) (如 某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1,它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例得SDS,仍不能完全掩蓋其原 有正電荷得影響，它得分子量就是 2 1 ,00 0,但SDS凝膠電泳測(cè) 定得結(jié)果卻就是3 5, 0 0 0。因此，最好至少用兩種方法來(lái)測(cè)定未 知樣品得分子量 ,互相驗(yàn)證。2、有許多蛋白質(zhì)，就是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如a-胰凝乳蛋白酶）組成得，它們?cè)?SDS與巰基乙醇得作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì),SDS -凝膠電泳測(cè)定得只就是它們得亞基或單條肽鏈得分子量 ,而不就是完整分子得分子量。為了得到更全面得資料, 還必須用其它方法測(cè)定其分子量及分子 中肽鏈得數(shù)目等，與SDS-凝膠電泳得結(jié)果互相