仙鶴草鞣質(zhì)成分的抗腫瘤作用研究.

1、黑龍江醫(yī)藥 Heil ongjiangMedicine Journal Vol 124No 112011? 29?仙鶴草鞣質(zhì)成分的抗腫瘤作用研究宛春雷,金哲雄哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院（哈爾濱 150076摘要 目的:研究仙鶴草提取物中鞣質(zhì)成分抗腫瘤作用，為臨床應(yīng)用提供基 礎(chǔ)。方法：用70%丙酮提取過(guò)濾濃縮仙鶴草粉末，再對(duì)提取液進(jìn)行正丁醇，乙酸乙酯 進(jìn)行多次萃取,得到溶于乙酸乙酯層的鞣質(zhì)和溶于正丁醇層的鞣質(zhì) ,并用AB -8型大 孔樹脂純化精致得其鞣質(zhì)成分。HepG2腫瘤細(xì)胞和BE L -7402腫瘤細(xì)胞進(jìn)行M TT于BE L -7402細(xì)胞72h后,細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖作用被抑制,，但在250卩g/mL

2、和300卩g/mL寸抑制率無(wú)明顯的增加,各劑量組OD , （P <0105 ,其I C 50為891277卩g/mL h ,并隨著藥物濃度的增大而增強(qiáng)，作用明顯,但在卩各劑量組OD 值與空白性組相比，均具有顯著性差異（P為W關(guān)鍵詞：中圖分類號(hào):文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào)：1006-2882(201101-029-03Study on An titu mor Acti on of Tannin Co mpo siti on in Agri m oniaYu a n C hu n lei, et a lPha rm a cy C ollege of H a rbi n C om m erce U

3、 n ivers i tyAbstract:Objecti ve:To study the tannin comp ositi on of extracti on of Agri m onia an titu mor acti on and p r ovide experi m en 2tal bassisf or cli ni cal app licati om 1M ethods:extract and filter Agri m on ia po wder with 70%acet one, the n extract Agri m onia ex 2tract with the Et

4、O Ac and n -Bu OH orga n -s oluti on many ti m es 1Obta in tannin co mp ositi on diss olve Et O Ac and diss olve n -Bu OH, the n p urificati on and depu rate t w o orga n -s oluti on with AB -8macr opor ous res in 1At last, Choose extracti ons of Et OAc's313供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果

5、見表1。表1加樣回收率試驗(yàn)（n =6 （序號(hào) 00301取樣量(g 0130750131120130970131910131790131504討論本文供試品溶液的制備參考了中國(guó)藥典2005年版I樣品中加入量含量(mg (mg212451212721212611213297213210212998212102121021210212102121021210實(shí)測(cè)值(mg 414404149041471415304152141510回收率(% 9812199196971109814798102100115平均回收率( RS D (%98165111993110供試品含量測(cè)定取復(fù)方頸康丸按照313供試

6、品溶液的制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果見表2。表2青藤堿含量測(cè)定結(jié)果樣品序號(hào)003010030200303部青風(fēng)藤項(xiàng)下青藤堿含量測(cè)定中供試品溶液的制備方法。曾比較了用甲醇提取 和用70%乙醇提取對(duì)青藤堿含量的影響，二種方法青藤堿含量相同，且都能分離完 全，為了減少甲醇的毒性影響，采用了用70%乙醇提取的方法。在流動(dòng)相的選擇中 曾用乙腈-磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行分離，分離效果和峰型都不如本文的乙腈-水-二乙 胺系統(tǒng)。本文在超聲提取中，比較了 20、25、30m in三種提取時(shí)間，結(jié)果表明，超聲處理25m in,青藤堿可以提取完全,所以采用25m in作為超聲提取的時(shí)間。黃芪的薄

7、層色譜鑒別中采用101大孔吸附樹脂層析，有效減低了薄層色譜的背景干擾。參考文獻(xiàn)1 國(guó)家藥典委員會(huì)1中國(guó)藥典，1部S 1北京:化學(xué)工業(yè)出版青藤堿mg/g713017142071115RS D (% 115111261173社,2005:15412張鈺泉,反相高效液相色譜法測(cè)定青風(fēng)藤中青藤堿的含量J 1黑龍江醫(yī)藥，2002, 15(4 13陳發(fā)奎1常用中草藥有效成分含量測(cè)定M1北京:人民衛(wèi)生出版社，199713741收稿日期:2010-11-01? 30?黑龍江醫(yī)藥 Heil 0ngjiangMedicine Journal Vol 124No 112011depu rated tannin co

8、mpo siti on t o make M TT p har maco experi m ent on Hep G2tu mor cells and BE L -7402tu mor cells t o study the an titu mor acti on of the tannin comp ositi on in Agri m onia 1Results:After the extracti on of Et O Ac of the deffere nt concentra 2ti on effecti on on BE L -7402tu mor cells 72hours, t

9、he in crease acti on of tu mor cells is in hibited, with the in creaseme nt of the concen trati on, acti on is obvi ous, but concen trati on in250 卩 g/mLa nd 300 卩 g/mL,the in hibiti on rati o does not in crease obvi 2ously 1every dose gr oup ' s OD value compare with blank gr oup, A ll of the m

10、 have obvi ous differenee 1(P <0105 , the I C 50is 89277 卩 g/mL After the extracti on of Et OAc of the deffere nt concen trati on effecti on on Hep G2tu mor cells 72hours, the in 2crease acti on of tu mor cells is in hibited, with the in crease ment of the concen trati on, acti on is obvi ous, bu

11、t concentrati on n250 卩 g/mLand 300 卩 g/mL,the inhibiti on rati o'sOD value compare with blank gr oup,does not in crease obvi ously 1every dose gr oup卩 g/mLA ll of the m have obvi ous differe nee 1(P <0105 , the I C 50is 127185。Key words:Agri m onia; an titu morM TT鞣質(zhì)又稱單寧1(Tannin ,是一類比較復(fù)雜的多酚類

12、化合物。鞣質(zhì)是可再生的天然有機(jī)化合物，廣泛分布于植物的葉、皮、木、果、根皮內(nèi)，并且影響著這些 植物性物料的性質(zhì)和應(yīng)用。除在苔蘚植物中很少存在外 ，廣泛存在于植物界，約70%以上的中草藥中含有鞣質(zhì)類化合物。多含于木本植物內(nèi)，,學(xué)工業(yè)屬于樹木提取物育更新,永續(xù)不斷、貫眾、地榆、柯子、仙鶴草、。鞣質(zhì)在過(guò)去常作為雜質(zhì)除去，但目前的研究證明鞣質(zhì)有一系列的生理活性，引起 了國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、食品、化工、環(huán)境等學(xué)科領(lǐng)域均有學(xué)者從 不同角度開展了鞣質(zhì)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究,尤其是醫(yī)藥領(lǐng)域,鞣質(zhì)具有很強(qiáng)的抗腫瘤活 性2。其抗癌機(jī)理或是與抑制致癌因素有關(guān)，或是直接作用于腫瘤細(xì)胞，或是發(fā)揮 綜合的作用，鞣

13、質(zhì)具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，選擇性高、活性強(qiáng)、毒副作用小且使用面廣 其潛在的用途十分廣闊，是一種很有潛力的抗癌天然藥物，有賴于今后的研究和開 發(fā)。仙鶴草3(A gri m onia pilosa Ledeb 1為薔薇科多年生草本植物龍牙草的全草，異名脫力草、馬鞭草、龍牙草、石打穿等，始載于滇南草本。主要成分含有仙(A、鶴草素、仙鶴草內(nèi)酯、鞣質(zhì)、甾醇、有機(jī)酸、酚性成分、皂苷、仙鶴草酚B、C、D、VC、VK等?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，仙鶴草具有收斂止血、截疽、止 痢、解毒,主要用于咳血、吐血、崩漏下血、瘧疾、血痢、脫力勞傷、癰腫瘡毒、 陰癢帶下等。仙鶴草資源豐富，臨床應(yīng)用廣泛。為充分利用仙鶴草藥用資源提供理

14、論依據(jù),我們對(duì)仙鶴草的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)1個(gè)新化合物，并對(duì)仙鶴草3種提取物進(jìn)行了抗菌活性試驗(yàn)4。1材料111實(shí)驗(yàn)對(duì)象人肝癌細(xì)胞株BE L -7402細(xì)胞購(gòu)自Shanghai Cell Bank, China。人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞是由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)。均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DM EM培養(yǎng)液中，置于CO 2培養(yǎng)箱(溫度37C,體積分?jǐn)?shù)為0105的CO 2,相對(duì)濕度為 95%培養(yǎng)。2、3d傳代一次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。112藥物及試劑DM E M （I nvitr ogen Cor porati on ;注射用鹽酸多柔比星（ADM ,浙江海正藥業(yè) 股份有限公司；胎

15、牛血清（B I L LAB ;胰酶、Rnase A、DM S O、HEPES、Triti onX -100（SC I E NTI F I CRESE ARCH SPEC I A L ; F LUO -3/AM（聯(lián)科生物;DCFH -DA （碧云天。1（, 70%丙酮，用組織破碎，抽濾，合并濾液，濃縮，再用乙酸乙酯和飽和正丁醇萃 取，濃縮,干燥,即得丙酮提取物乙酸乙酯和正丁醇萃取層粉末。（2乙酸乙酯層和正丁醇層精制品的制備大孔吸附樹脂柱的安裝及處理取 AB -8型大孔高分子吸附樹脂250g,添加乙 醇浸泡,超聲處理30m in濾去乙醇液，添加蒸餾水浸泡，超聲處理30m in,濾去水液, 反復(fù)處理

16、3次后，以水浸液裝入玻柱（30mm, H 500mm內(nèi),以水洗滌后備用。精制品的制備稱取乙酸乙酯層 3g,加水20mL溶解后,添加95%乙醇60mL, 攪勻,置冰箱（28°C放置過(guò)夜,次日,離心（4000r pm, 5m in ,濾過(guò),濾液置于薄膜蒸 發(fā)儀上減壓加熱回收乙醇，濃縮,均得約115g粉末,添加水30mL,溶解,將水溶液通 過(guò)已處理的備用 AB -8型大孔吸附樹脂柱（30mm, H 500mm以流速20mL /min動(dòng) 態(tài)吸附。吸附完畢后，樹脂柱以水（約1500mL淋洗樹脂柱。淋洗后，以60%乙醇脫 洗樹脂柱（脫洗流速20mL /min ,收集乙醇洗脫液約500mL,減壓加

17、熱回收乙醇，干燥, 即得精制后的乙酸乙酯層粉末1117g，正丁醇層粉末1105g。2方法及結(jié)果211 M TT法檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響21111試驗(yàn)方法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于 96孔板中，細(xì)胞濃度為1X10個(gè)/mL,每孔加100卩L培養(yǎng)液，24h后加入不同濃度的乙酸乙酯和正丁醇層，使其終濃度分別為50、100、150、200、250和300卩g/mL陽(yáng)性對(duì)照組加阿霉素，終濃度為10卩g/mL空白對(duì)照組加相同體積的培養(yǎng)液。置于37C , 5%C O 2培養(yǎng)箱中。72h后，倒去培基和藥液后，分別加入100卩L、015mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h,然后吸去上清液,每孔加入二甲基亞砜1

18、50卩L,輕輕振蕩以使溴代噻唑藍(lán)完全 溶解,約5m in后在620n m波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度（OD值。用如下公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計(jì)算I C 50。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（% =1- >100%黑龍江醫(yī)藥 Heil ongjiangMedicine Journal Vol 124No 112011? 31?雙黃連注射液無(wú)菌檢查的方法驗(yàn)證趙亞麗,吳英黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院（牡丹江157041摘 要 目的:主要是建立一種適合于雙黃連注射液進(jìn)行無(wú)菌檢查的方法。方 法:薄膜過(guò)濾法與直接接種法。結(jié)果:可照薄膜過(guò)濾檢查法的檢查條件進(jìn)行雙黃連注射液的無(wú)菌檢查。文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):

19、-2882-03關(guān)鍵詞:雙黃連注射液；無(wú)菌檢查；方法驗(yàn)證中圖分類號(hào):R92711Verificati on ofMethod of I Ase psis Testet a lH ei of A gr icu ltu ra l Eco n om y (M u da n jia n g, 157041Abstract:Oestablish a right method of Shua nghua nglia n in jecti on ase p sis test 1M ethods:p ercolated thr ough me mbra nee and ino culated directly

20、1Results:Shua nghua nglia n in jecti on ase p sis test can be con ducted accordi ng t o the method of p ercolat ing though me mbrance 1Key words:Shua nghua nglia n injecti on; ase p sis test; method Verificati on1前言抗呼吸道病毒和流感病毒的作用，為全國(guó)中醫(yī)醫(yī)院急診治療必備的藥品之一，也 是目前人們用于治療感冒的常用藥。為保證藥品的檢驗(yàn)質(zhì)量，我國(guó)藥典明確規(guī)定對(duì)所用的無(wú)菌表7-2乙酸乙酯

21、層對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用（x ±組別空白組阿霉素乙酸乙酯層乙酸乙酯層乙酸乙酯層乙酸乙酯層乙酸乙酯層乙 酸乙酯層劑量（卩g/mL孔數(shù)-10501001502002503001212666666OD值 01335 ±102101096 ±1007301291 ±1030301203 ±1015301133 ±1009301090 ±1010301072 ±1004301066 ±10033雙黃連注射液是以金銀花、黃苓、連翹提取物制成的純中藥?kù)o脈水針劑，有清熱解毒、清宣風(fēng)熱的功效，有較強(qiáng)的21112 乙酸乙酯層對(duì)BE L -7402細(xì)胞增殖的影響由表7-1可見,不同濃度的乙酸乙酯層作用于 BE L -7402細(xì)胞72h后,細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖作用被抑制，并隨著藥物濃度的增大而增強(qiáng)，作用較明顯,但在250卩g/mL和300卩g/mL時(shí)抑制率無(wú)明顯的增加,各劑量組OD值與空白組相比,均具有顯著性差異（P <0105 ,其I C 50為891277卩g/mL 21113 乙酸乙酯層對(duì) HepG2細(xì)胞增殖的影響如表7-2所示,不同濃度的乙酸乙酯層作用于 HepG2細(xì)胞72h后,細(xì)胞的生長(zhǎng) 增殖作用被抑制,