淺論傷寒沙門(mén)菌調(diào)節(jié)因子UhpA的功能研究

1、淺論傷寒沙門(mén)菌調(diào)節(jié)因子UhpA的功能研究                 作者：李君輝 羅哲 謝新民 李安平， 杜鴻 生秀梅 黃新祥【摘要】  目的： 探討傷寒沙門(mén)菌調(diào)節(jié)因子UhpA的功能。方法： 用載體pBAD介導(dǎo)回補(bǔ)uhpA至傷寒沙門(mén)菌uhpA基因缺陷變異株，用qRTPCR觀察cysM和treB基因表達(dá)，用表達(dá)載體pET22b原核表達(dá)UhpA蛋白，用凝膠阻滯試驗(yàn)觀察UhpA蛋白與cysM和treB啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段的結(jié)合。結(jié)果：

2、成功構(gòu)建pBADuhpA重組質(zhì)粒，在uhpA缺陷變異株中回補(bǔ)uhpA基因后，cysM和treB的表達(dá)明顯恢復(fù)，但UhpAHis6蛋白與cysM和treB的啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段無(wú)明顯結(jié)合。結(jié)論: 傷寒沙門(mén)菌UhpA在高滲應(yīng)激條件下能促進(jìn)硫代謝及海藻糖代謝相關(guān)基因表達(dá)，且可能為間接作用。 【關(guān)鍵詞】  傷寒沙門(mén)菌； UhpA； 凝膠阻滯； 基因表達(dá)調(diào)節(jié)Abstract  Objective: To explore the function of the regulator UhpA in Salmonella enterica serovar Typhi. Methods： A

3、 recombinant plasmid pBADuhpA containing the uhpA gene with its own promoter was transferred into the uhpA deleted mutant of S.entericar serovar Typhi. qRTPCR was performed to observe the expression of cysM and treB. UhpA protein was expressed by a recombinant plasmid pET22buhpA in E.coli. The gel s

4、hift assays was performed to explore the combination between UhpA and the promoter region of cysM and treB.Results: Recombinant plasmid pBADuhpA was successfully constructed. After complementing uhpA gene in the uhpA deleted mutant, the expression of cysM and treB was obviously restored. Gel shift a

5、ssays showed that UhpA protein could not bind the promote region of cysM and treB. Conclusion: At upshift high osmotic treatment, the UhpA may promote the expression of genes involved in the metabolism of sulfur and trehalose indirectly.Key words  Salmonella enterica serovar Typhi; UhpA; gel sh

6、ift assay; gene expression regulation   傷寒沙門(mén)菌（Salmonella enterica serovar Typhi）是沙門(mén)菌屬中一種人類嚴(yán)重的腸道致病菌，已成為一種重要的原核生物基因表達(dá)與信息調(diào)控研究的模式菌1。沙門(mén)氏菌在感染的過(guò)程中，必須適應(yīng)新環(huán)境（滲透壓、酸性環(huán)境、巨噬細(xì)胞吞噬、抗菌肽等），對(duì)不同環(huán)境的調(diào)節(jié)主要由細(xì)菌多種雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（twocomponent regulatory system)來(lái)介導(dǎo)2。目前在沙門(mén)氏菌和埃希菌（Escherichia coli）中已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)。   UhpB

7、/UhpA作為一種雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UhpT的表達(dá)，從而有助于細(xì)菌利用外界環(huán)境中的6磷酸葡萄糖作為碳源或能量來(lái)源3。我們最近的基因芯片相關(guān)分析表明，uhpA基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激條件下相對(duì)于野生株有一系列基因的表達(dá)發(fā)生了明顯的下調(diào)，而且這些基因大多與硫代謝相關(guān)。這提示在高滲應(yīng)激條件，uhpA基因可能參與硫代謝途徑的調(diào)控45。為了深入地研究UhpA的功能，我們?cè)趗hpA基因缺陷變異株中回補(bǔ)uhpA基因，通過(guò)qRTPCR觀察其對(duì)下調(diào)基因表達(dá)的影響，同時(shí)表達(dá)UhpA蛋白，通過(guò)凝膠阻滯試驗(yàn)，分析UhpA對(duì)于硫代謝途徑的相關(guān)基因是直接還是間接調(diào)控。   1  材

8、料與方法   1.1  材料1.1.1  菌株和質(zhì)粒   菌株：傷寒沙門(mén)菌野生株GIFU10007，uhpA-（傷寒沙門(mén)菌野生株GIFU10007剔除uhpA基因），uhpA-（pBAD）（uhpA-含pBAD/g 質(zhì)粒），uhpA-（pBADuhpA）（uhpA-含pBADuhpA）、大腸埃希菌E.coli DH5，E.coli TG1，E.coli JM109，E.coli JM109（pET22buhpA）（E.coli JM109含pET22buhpA）    質(zhì)粒：pBAD/gIII，

9、pET22b（兩質(zhì)粒用于蛋白表達(dá)，Amp抗性），pBADuhpA（pBAD/g含uhpA基因及其啟動(dòng)子區(qū)域），pET22buhpA（pET22b含uhpA基因）1.1.2  主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamH ，Sal，Nco，T4 DNA連接酶，ExTaq，pfuTaq，無(wú)RNA酶的DNA酶，TA克隆試劑盒均為T(mén)aKaRa（大連）公司產(chǎn)品；瓊脂糖，膠回收試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品；蛋白純化系統(tǒng)，總RNA提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript（Invitrogen公司）；GSM緩沖液根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)配制6。1.1.3  主要儀器&#

10、160;PCR擴(kuò)增儀2700(ABI)；凝膠成像系統(tǒng)Gene Genius Bioimaging System(BioRad)； 電轉(zhuǎn)化儀Gene Pulsero II(BioRad)；核酸檢測(cè)儀Spectrophotometer ND1000（NanoDrop）；熒光定量PCR儀（Corbett）；垂直平板電泳儀（BioRad）。1.1.4  引物合成 本文所用引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物序列見(jiàn)表1。表1  引物序列（略）1.2  方法1.2.1  uhpA缺陷變異株中回補(bǔ)uhpA基因分別在uhpA基因上、下游設(shè)計(jì)引物Fa與Fb并在

11、5端加Nde, Xho酶切位點(diǎn)，以傷寒沙門(mén)菌野生株基因組DNA為模板，用高保真DNA聚合酶pfu擴(kuò)增目的基因，將純化后的PCR產(chǎn)物與載體pBAD/g同時(shí)用Nde, Xho雙酶切，酶切產(chǎn)物用酚仿-乙醇法純化后用T4 DNA連接酶22過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物用熱休克法轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TG1，篩選疑似陽(yáng)性克隆并用Nde, Xho雙酶切和PCR分析鑒定，并經(jīng)基因序列分析驗(yàn)證（由上海英駿生物技術(shù)公司完成）。將構(gòu)建成功的重組載體pBADuhpA轉(zhuǎn)入uhpA缺陷變異株，將其命名為uhpA回補(bǔ)株uhpA-(pBADuhpA），同時(shí)將空pBAD/g載體導(dǎo)入uhpA缺陷變異株作為對(duì)照株uhpA-（pBAD）。1.2.2

12、  細(xì)菌培養(yǎng)及總RNA提取 挑取S.Typhi GIFU10007，uhpA-（pBADuhpA）和uhpA-（pBAD）單菌落接種于1 ml等滲LB培養(yǎng)液中，37振蕩（250 r/min）培養(yǎng)過(guò)夜，以1100分別轉(zhuǎn)接于20 ml等滲LB培養(yǎng)液中，LB培養(yǎng)液中均加入了0.2%的L阿拉伯糖，37振蕩（250 r/min）培養(yǎng)4  h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再加入終濃度為300 mmol/L的NaCl培養(yǎng)30 min。冰上放置15 min后離心（4 000 r/min，10 min，4）收集菌體。用總RNA提取試劑盒提取細(xì)菌總RNA，并用無(wú)RNA酶的DNA酶（37 20 min

13、，80 15 min）消化殘量DNA。用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度，同時(shí)取1 l進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析RNA的質(zhì)量。-70保存RNA備用。1.2.3  qRTPCR 采用上述方法提取和處理細(xì)菌總RNA，取4  g總RNA，用N8隨機(jī)引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。從篩選的差異表達(dá)基因中，選取2個(gè)差異基因，用特異性引物進(jìn)行qRTPCR，觀察基因表達(dá)。qRTPCR采用SYBR Green并按文獻(xiàn)6進(jìn)行，用基因組DNA梯度稀釋制作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)樣品測(cè)定的初步結(jié)果確定標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍。采用基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度cysM為265 bp，treB為290

14、 bp，序列信息見(jiàn)表1。         1.2.4  UhpA蛋白的表達(dá)純化 分別在uhpA基因上、下游引物的5端加上Nde和Xho酶切位點(diǎn)，去除基因本身的終止子，利用載體上His6后面的終止子，使表達(dá)的UhpA蛋白C末端帶有His6標(biāo)簽。以傷寒沙門(mén)菌野生株基因組DNA為模板，用高保真DNA聚合酶pfu擴(kuò)增目的片段，將純化后的PCR產(chǎn)物與回補(bǔ)載體pET22b同時(shí)用Nde，Xho雙酶切，酶切產(chǎn)物用酚仿-乙醇法純化后，用T4 DNA連接酶22過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物用熱休克法轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TG1。提取

15、疑似陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，用Nde，Xho雙酶切和PCR分析鑒定，并經(jīng)DNA序列分析驗(yàn)證（由上海英駿生物技術(shù)公司完成）。將構(gòu)建成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌JM109。挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化株單菌落接種于1 ml等滲LB培養(yǎng)液中，37振蕩（250 r/min）培養(yǎng)過(guò)夜，以1100分別轉(zhuǎn)接于20 ml等滲LB培養(yǎng)液中，37振蕩（250 r/min）培養(yǎng)4 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。加入終濃度為0.01 mmol/L的IPTG，26振蕩（250 r/min）培養(yǎng)8 h，離心（4 000 r/min，10 min，4）收集菌體，加入裂解液并用超聲破菌，取上清用鎳柱按產(chǎn)品說(shuō)明純化UhpA蛋白。1.2.5  凝膠阻滯試

16、驗(yàn) 據(jù)NCBI公布的傷寒沙門(mén)菌Ty2基因組序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物cysD，treB，設(shè)計(jì)引物位置為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約250 bp，下游約50 bp，總長(zhǎng)度約300 bp，以傷寒沙門(mén)菌GIFU10007為模板，擴(kuò)增出cysD基因以及treB基因啟動(dòng)子區(qū)域。用酚仿乙醇法純化PCR產(chǎn)物，取12 g PCR產(chǎn)物與不同濃度的UhpA蛋白混合，加入相應(yīng)體積的GSM緩沖液，使三者反應(yīng)總體積為20 l，30孵育15 min。選取198 bp的真核生物PCR產(chǎn)物作為陰性對(duì)照，8%的丙烯酰胺膠電泳分離條帶，溴化乙啶染色8。   2  結(jié)果    2.1&

17、#160; uhpA回補(bǔ)株的構(gòu)建   為進(jìn)一步研究UhpA功能，本研究在uhpA缺陷變異株中回補(bǔ)uhpA基因，以傷寒沙門(mén)菌野生株基因組DNA為模板，用特異引物擴(kuò)增目的片段，全長(zhǎng)841 bp，包括uhpA的啟動(dòng)子，編碼區(qū)域及終止子。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pBAD/g定向連接，構(gòu)建成pBADuhpA重組質(zhì)粒。DNA序列分析顯示重組區(qū)域無(wú)堿基突變，表明pBADuhpA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)而將pBADuhpA重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBAD/g分別導(dǎo)入uhpA缺陷變異株，構(gòu)建成uhpA回補(bǔ)株和對(duì)照株。   2.2  qRTPCR分析cysM和treB基因的表

18、達(dá)   本研究選取半胱氨酸合成酶編碼基因cysM和6磷酸海藻糖水解酶編碼基因treB作為代表，用qRTPCR觀察分析UhpA對(duì)硫代謝與海藻糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。標(biāo)準(zhǔn)曲線以cysM為例（圖1）。結(jié)果顯示高滲應(yīng)激30 min后，傷寒沙門(mén)菌uhpA缺陷株的cysM和treB的表達(dá)明顯低于野生株，在回補(bǔ)株中兩者的表達(dá)水平有明顯恢復(fù)，而對(duì)照株中則無(wú)此現(xiàn)象（圖2）。   2.3  UhpA蛋白表達(dá)   為了進(jìn)一步研究UhpA對(duì)硫代謝及海藻糖相關(guān)基因是直接調(diào)控還是間接調(diào)控，本文設(shè)計(jì)凝膠阻滯試驗(yàn)，以分析UhpA能否與cysM和tre

19、B的啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段結(jié)合，因此首先需通過(guò)原核表達(dá)獲取UhpA蛋白。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET22buhpA轉(zhuǎn)入大腸埃希菌JM109，加入終濃度為0.01 mmol/L IPTG，26誘導(dǎo)表達(dá)UhpA蛋白，經(jīng)SDSPAG電泳分析顯示（圖3），表達(dá)的UhpA蛋白部分為可溶性，由于設(shè)計(jì)表達(dá)的蛋白C末端帶有組氨酸（His6）標(biāo)簽，因此通過(guò)鎳柱純化獲得了可溶性UhpA蛋白。2.4  凝膠阻滯試驗(yàn)結(jié)果   為了觀察UhpA能否與硫代謝及海藻糖相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段結(jié)合，本研究采用凝膠阻滯試驗(yàn)，將treB啟動(dòng)子區(qū)域的PCR產(chǎn)物和cysD啟動(dòng)子區(qū)域的PCR產(chǎn)物分別

20、與不同濃度的UhpA蛋白以及作為對(duì)照用的適量的來(lái)自于真核生物DNA片段，在GSM緩沖液中30孵育15 min后進(jìn)行非變性PAG電泳，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，UhpA蛋白與treB，cysD啟動(dòng)子區(qū)域無(wú)明顯結(jié)合。結(jié)果提示，UhpA對(duì)treB，cysD等基因的調(diào)控可能為間接作用。3  討論   傷寒沙門(mén)菌是一種經(jīng)消化道感染的重要人類致病菌，可造成全身系統(tǒng)性感染。UhpB/UhpA雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)是沙門(mén)菌的一種十分重要的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UhpT的表達(dá)，而有助于利用外界環(huán)境中的6磷酸葡萄糖作為碳源或能量來(lái)源3?；虮磉_(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門(mén)菌在高滲應(yīng)激15 min后，uh

21、pA與uhpB基因表達(dá)有明顯上調(diào)7，推測(cè)UhpA在高滲應(yīng)激條件下或能參與對(duì)其他基因的表達(dá)調(diào)控。   我們最近在制備傷寒沙門(mén)菌uhpA基因缺陷變異株后，利用傷寒沙門(mén)菌基因組芯片分析uhpA基因缺陷變異株與野生株在高滲應(yīng)激30 min后的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)兩者之間只有21個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)差異，且這些基因在uhpA基因缺陷變異株中相對(duì)于野生株全部表現(xiàn)為下調(diào)，其中cysJ，cysD，cysP，cysW，cysU，cysA，cysC，cysK，cysH，sopD這10個(gè)基因下調(diào)最為明顯。令人驚奇的是，細(xì)菌利用外界環(huán)境中的無(wú)機(jī)硫參與半胱氨酸生物合成途徑的基因全部下調(diào)，它們是cysJ，cysD，cysP， cysW，