理化因素對(duì)微生物的影響;細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象與生化反應(yīng)

1、 基礎(chǔ)部微生物學(xué)教研室基礎(chǔ)部微生物學(xué)教研室教學(xué)目標(biāo) 1.了解細(xì)菌代謝產(chǎn)物的生化檢查方法。2.熟悉常見(jiàn)的物理化學(xué)因素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。3.熟悉細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感試驗(yàn)方法與步驟。4.掌握細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象。教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)：重點(diǎn)：細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象。難點(diǎn)：藥敏試驗(yàn)的判斷，細(xì)菌常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物并分析其生化反應(yīng)現(xiàn)象的意義【材料】 血液瓊脂平板培養(yǎng)基、滅菌棉拭、接種環(huán)、酒精燈。紫外線燈、 2.5碘酒、75乙醇、1龍膽紫、2紅汞、1:1000新潔爾滅、無(wú)菌濾紙片、葡萄球菌培養(yǎng)液、大腸埃希菌培養(yǎng)液、瓊脂平板、無(wú)齒小鑷子。 抗生素紙片(青、鏈、氯、慶大霉素、磺胺等)。教學(xué)基本內(nèi)容：一、觀看錄像

2、：消毒滅菌二、 講解紫外線殺菌的原理，抗生素敏感實(shí)驗(yàn)的原理與操作三、操作講解與示范：觀察細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象。檢查細(xì)菌常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物并分析其生化反應(yīng)現(xiàn)象的意義。四、學(xué)生動(dòng)手操作 一、觀看錄像：消毒滅菌二、消毒滅菌試驗(yàn) 講解紫外線殺菌的原理；抗生素敏感實(shí)驗(yàn)的原理與操作消毒與滅菌方法消毒與滅菌方法v 加熱滅菌加熱滅菌 干熱滅菌干熱滅菌 濕熱滅菌濕熱滅菌v 過(guò)濾除菌過(guò)濾除菌v 輻射滅菌輻射滅菌 放射線輻照滅菌放射線輻照滅菌 紫外線滅菌紫外線滅菌v 化學(xué)藥品滅菌化學(xué)藥品滅菌干熱滅菌干熱滅菌v干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的

3、。凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。v細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。固緩慢。v因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（高（160170），時(shí)間要長(zhǎng)（），時(shí)間要長(zhǎng)（12h），但），但干熱滅菌溫度不能超過(guò)干熱滅菌溫度不能超過(guò)180，否則，包器皿，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒燃燒。微孔濾膜過(guò)濾除菌微孔濾膜過(guò)

4、濾除菌 過(guò)濾除菌是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的過(guò)濾除菌是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。微孔濾膜過(guò)濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入。微孔濾膜過(guò)濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒人口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除器將各種微生物阻留在

5、微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過(guò)濾除菌。一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過(guò)濾除菌。（一）煮沸與高壓滅菌法【原理】 高溫對(duì)細(xì)菌有明顯的致死作用，主要機(jī)制是凝固菌體蛋白質(zhì)，也可能與細(xì)菌DNA單螺旋斷裂、細(xì)菌細(xì)胞膜功能受損及菌體內(nèi)電解質(zhì)濃縮有關(guān)。濕熱滅菌法所需溫度比干熱法為低，時(shí)間較短。尤其是高壓蒸氣滅菌，因增加壓力而

6、提高沸點(diǎn)，滅菌效果最佳。有芽胞的細(xì)菌由于對(duì)熱的抵抗力比無(wú)芽胞細(xì)菌強(qiáng)，所以只有采用高壓蒸氣滅菌法才能將芽胞徹底殺滅。【材料】瓊脂平板兩塊、肉湯管兩支、大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌肉湯培養(yǎng)物?！痉椒ā?取瓊脂平板兩塊，用記號(hào)筆分別在二平板底部玻面上，注明大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌，并分別將二塊平板底玻璃面劃分三等份，于每塊平板的三等份上分別注明對(duì)照、加熱100 10min及加熱121 20min。 取肉湯管二支，分別注明加熱100 l0min及加熱121 20min，用毛細(xì)吸管吸取大腸埃希菌肉湯培養(yǎng)物，于上述二支肉湯管中各加入菌液一滴?；靹?，再用接種環(huán)于二支肉湯管的任何一管中取一環(huán)菌液接種于大腸埃希菌平

7、板的對(duì)照處，然后分別將肉湯管加熱100 l0min及加熱121 20min(高壓蒸氣15磅、20min)，再各取一接種環(huán)分別接種于平板的相應(yīng)部位?？莶菅堪麠U菌以同法試驗(yàn)。 將二塊瓊脂平板接種物置37培養(yǎng)24小時(shí)，比較培養(yǎng)基上二種細(xì)菌的生長(zhǎng)情況?！窘Y(jié)果觀察】（填表）表: 煮沸和高壓滅菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌名稱(chēng) 100 10分鐘 121 20分鐘 未加熱(對(duì)照)枯草芽胞桿菌大腸埃希菌（二）紫外線殺菌法【原理】波長(zhǎng)265266nm的紫外線因與DNA吸收光譜-致而有明顯的殺菌作用。其機(jī)制是使細(xì)菌DNA相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而破壞DNA構(gòu)型，干擾其正常復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。紫外線殺菌力雖強(qiáng)，但穿透力弱，故只

8、能用于實(shí)驗(yàn)室、病房或手術(shù)室內(nèi)空氣及物體表面的消毒滅菌。另外，殺菌波長(zhǎng)的紫外線對(duì)人體皮膚、眼睛等有損傷作用，應(yīng)注意防護(hù)?！静牧稀看竽c埃希菌培養(yǎng)物、瓊脂平板、接種環(huán)、酒精燈、紫外線燈?！痉椒ā恳詼缇臃N環(huán)挑取大腸埃希菌培養(yǎng)物，于瓊脂平板上作來(lái)回密集劃線接種。半啟皿蓋(將皿蓋遮住涂面的12)，置于紫外線燈下lm以?xún)?nèi)接受照射30分鐘。蓋上皿蓋，于37培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。 【結(jié)果觀察】（填空） 平板上用黑紙遮蓋部分 菌生長(zhǎng)，未遮蓋部分 菌生長(zhǎng)。這說(shuō)明紫外線具有 作用，但 力弱。（三）化學(xué)消毒法1、皮膚消毒試驗(yàn)【原理】乙醇可使菌體蛋白脫水凝固或與菌體蛋白、酶蛋白等結(jié)合而使之變性失活。7075 乙醇在1

9、530秒即將細(xì)菌殺死。但95的乙醇消毒效果反不如7075為好，因高濃度乙醇使菌體蛋白表面迅速凝固，影響乙醇繼續(xù)進(jìn)入菌體內(nèi)發(fā)揮作用。2.5的碘酒可使菌體酶蛋白中的硫氫基(-SH)改變，使酶失去活性，導(dǎo)致機(jī)能障礙而死亡?！静牧稀科胀ō傊桨逡粋€(gè)、2.5碘酒、75乙醇?！痉椒ā咳∑胀ō傊桨逡粋€(gè)，用蠟筆在平板背面玻璃上劃成五等分，并貼上標(biāo)簽；兩人用手在培養(yǎng)基上各涂一格，然后用2.5碘酒、75乙醇消毒手指后再各涂另一格，留一格作對(duì)照，蓋好平板，置37溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】（填表） 皮膚消毒試驗(yàn)結(jié)果37 24h培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)情況 結(jié)果解釋消毒前手指皮膚消毒后手指皮膚對(duì)照(不接種)2、 化學(xué)消

10、毒劑對(duì)細(xì)菌的影響【原理】有些化學(xué)藥品濃度高時(shí)能殺滅病原微生物，稱(chēng)為化學(xué)消毒劑；濃度低時(shí)能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，稱(chēng)為防腐劑。由于化學(xué)消毒劑對(duì)人體細(xì)胞往往具有毒性作用，故只能外用。不同細(xì)菌對(duì)不同的化學(xué)消毒劑具有不同的敏感性?！静牧稀?龍膽紫、2碘酒、2紅汞、1:1000新潔爾滅、無(wú)菌濾紙片、葡萄球菌培養(yǎng)液、大腸埃希菌培養(yǎng)液、瓊脂平板、無(wú)齒小鑷子?！痉椒ā咳…傊桨鍍蓧K，分別在其底部注明葡萄球菌及大腸埃希菌。同時(shí)將每塊平皿底部玻璃面劃分4等分，并分別標(biāo)明龍膽紫、碘酒、紅汞、新潔爾滅。(操作方法與藥敏試驗(yàn)相似)三、抗生素的抗菌試驗(yàn)(藥敏試驗(yàn)，紙片法)【原理】抗生素主要是指某些微生物(大多數(shù)為放線菌和真菌、極少

11、數(shù)為細(xì)菌)在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的一種合成代謝產(chǎn)物。此種有機(jī)化合物具有抗生物作用，能抑制或殺滅某些生物細(xì)胞，主要是一些微生物和腫瘤細(xì)胞。一種抗生素只對(duì)一定種類(lèi)的生物細(xì)胞具有選擇性拮抗作用，這種作用范圍稱(chēng)為抗菌譜?？股氐目咕囼?yàn)(藥敏試驗(yàn))是指在體外測(cè)定藥物抑制或殺死細(xì)菌能力的試。 為正確使用抗生素，臨床上常在分離致病細(xì)為正確使用抗生素，臨床上常在分離致病細(xì)菌的同時(shí)做藥物敏感試驗(yàn)，以了解該細(xì)菌對(duì)常用菌的同時(shí)做藥物敏感試驗(yàn)，以了解該細(xì)菌對(duì)常用各種抗生素的敏感性。提高治療的針對(duì)性。同時(shí)各種抗生素的敏感性。提高治療的針對(duì)性。同時(shí)，減少患者的痛苦，減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。，減少患者的痛苦，減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)

12、。 藥敏試驗(yàn)的常用方法：藥敏試驗(yàn)的常用方法：紙片法紙片法【方法】取瓊脂平板培養(yǎng)基二塊，于其底部玻璃上用標(biāo)簽紙注明本人所接種的菌株名稱(chēng)（或?qū)⑵桨宓撞恳韵灩P劃為六等分，分別在靠近邊緣處注明青、鏈、氯、慶大等字樣）。以滅菌接種環(huán)挑取菌液，在培養(yǎng)基表面作密集劃線接種。將鑷子火焰滅菌，待冷后再取各藥物紙片，分別牢貼于種有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面相應(yīng)位置，每次貼片后鑷子均應(yīng)經(jīng)火焰燒灼滅菌。每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm，并分別作好標(biāo)記。 在直徑90mm的平板上均勻擺放藥敏紙片的樣板37孵育1824h后，分別測(cè)量各紙片抑菌環(huán)直徑(包括紙片在內(nèi))(mm)，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌

13、明顯生長(zhǎng)為限。判定其敏感度?！静牧稀拷瘘S色葡萄球菌、大腸埃希菌、瓊脂平板培養(yǎng)基?？股丶埰?青、鏈、氯、慶大霉素、磺胺等)、尖頭鑷子、酒精燈、接種環(huán)?！痉椒ā咳…傊桨迮囵B(yǎng)基二塊，于其底部玻璃上用標(biāo)簽紙注明本人所接種的菌株名稱(chēng)（或?qū)⑵桨宓撞恳韵灩P劃為六等分，分別在靠近邊緣處注明青、鏈、氯、慶大等字樣。 操作：操作： 1） 抗生素敏感試驗(yàn)（普通平板 2塊/3人） 2）抗生素紙片(青霉素、鏈霉素、慶大霉素、黃連素 1套/6人) 3）大腸桿菌、敏感金葡菌培養(yǎng)物（1支/6人）藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果判斷參考標(biāo)準(zhǔn)：抗菌藥物抗菌藥物 抑抑 菌菌 圈圈 直直 徑徑（mm）耐藥中度敏感敏感青霉素10101213鏈霉素10101415其它抗生素10101516敏感：表示常規(guī)劑量的藥物在