乙型肝炎病毒X基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

1、第34卷第3期Vol.34No.3南華大學(xué)學(xué)報(bào) 醫(yī)學(xué)版乙型肝炎病毒X基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)王 靜,蔣永林,李金麗,蔡恒玲,萬艷平(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所,湖南衡陽421001)TM(+)-HBx。用梭華-Sofast基因轉(zhuǎn)染試劑將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,細(xì)胞裂解液經(jīng)SDS-PAGE及轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜后做Westernblotting,鑒定目的蛋白。結(jié)果 雙酶切pcDNA3.1(+)-HBx后,瓊脂糖電泳可分別見到大小約為5.4kb和465bp片斷,說明X亞克隆入pcDNA3.1(+),經(jīng)序列測(cè)定其含有完整的X基因片段;Westernblotting結(jié)果顯示pcDNA3.1(+)-H

2、Bx能在THP-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)X蛋白。結(jié)論 成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx,并能在THP-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)X蛋白。關(guān)鍵詞:乙肝病毒(HBV); X基因; X蛋白; 真核表達(dá)中圖分類號(hào):R373.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1672-7444(2006)03-0320-04ConstructionandExpressionofEukaryoticVectorforHBVXWANGJing,JINGYong-lin,LIJin-li,etal(InstituteofPathogenicBiology,NanhuaUniversity,Hengyang,Hunan4210

3、01,China)Abstract:Objective ThisstudywasdesignedtoconstructandexpresstheeukaryoticexpressionvectorofHBVXgeneforexploringthecontributionofXgenetothechronichepatitisandthehepatocellular. Methods XgenewithEcoR andHind endoenzymesiteswasobtainedbyusingPCR,andsubclonedintopcDNA3.1(+)vector.Afteridentifie

4、dbyrestrictiveenzymesdigestionandsequencing,reconstructedplasmidwastransfectedintoTHP-1cells.ExpressionofXwereassayedinTHP-1celllysatebyWestern-blotting. Results ThetargetgeneXfragmentabout465bpwasobtained.InTHP-1cell,thepcDNA3.1(+)-HBxplasmidexpressedXpro-teinwithmolecularweightof17kDabyWestern-blo

5、tting. Conclusion EukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+)-HBxwasconstructedsuccessfullyandXproteinwasexpressedinTHP-1cell.KeyWords: HBV; Xgene; Xprotein; eukaryoticexpression.人類乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)屬于嗜肝DNA病毒科,能引起急、慢性肝炎(acute,chronichepatitis)、肝硬化(cirrhosis)和肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)1,2有4

6、個(gè)開放閱讀框(openreadingframe,ORF),包括包膜基因編碼區(qū)(含pre-s1,pre-s2和s基因編碼區(qū)),pc基因和c基因編碼區(qū),p基因編碼區(qū),x基因編碼區(qū)1,3。HBVDNA具。其中HBx基因是HBVDNA中基金項(xiàng)目:湖南省衛(wèi)生廳資助課題(編號(hào):B2005084).通訊作者:萬艷平,教授,碩士生導(dǎo)師,E-mail:YanpingWan.最小的一個(gè),編碼基因位于13741838核苷酸之間,全長(zhǎng)465bp,它所編碼的X蛋白由154個(gè)氨基酸組成。HBx基因是HBV復(fù)制和擴(kuò)散所必需的基因,在乙肝慢性化和HCC的發(fā)生中具有重要作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)X蛋白是一種反式激活因子,其本身不能與雙鏈D

7、NA直接結(jié)合,而是通過蛋白與蛋白之間的相互作用來行使功能,可以通過參與不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路,在細(xì)胞的分裂增殖、細(xì)胞凋亡、乙型肝炎慢性化和腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮不同4,5的作用。為了進(jìn)一步研究X基因的生物學(xué)功能、分子生物學(xué)特性以及乙肝病毒感染后的細(xì)胞免疫,作者構(gòu)建了HBVX基因的真核表達(dá)載體,并在體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。CTGTG-3 ;引物2:5 -CGCTTAGGCAGAGGGGAAA-3 。在25 L反應(yīng)體系中加入2.5 L10 反應(yīng)緩沖液,0.5 L1mmol LdNTP,HBVDNA模板1.0 L,兩引物各0.5 L,Taq酶0.2 L,MgCl21.8 L,補(bǔ)水至25 L。反應(yīng)條件為

8、:94 預(yù)變性5min;94 60s,60 60s,72 60s,35個(gè)循環(huán);72 終延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。(3)載體pcDNA3.1(+)-HBx構(gòu)建:將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pcDNA3.1(+)用EcoR 和Hind 雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳,回收約500bp目的基因片段與5.4kb的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒片段,用T4連接酶連接,構(gòu)建載體pcDNA3.1(+)-HBx,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 ,選取氨芐抗性克隆并用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,經(jīng)EcoR 和Hind 雙酶切后,用瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)含有目的基因片段,并將陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。1.2.2 重

9、組質(zhì)粒的瞬時(shí)表達(dá)及鑒定 (1)細(xì)胞培養(yǎng):THP-1細(xì)胞用RPMI164010%小牛血清,于37 、5%CO2條件下培養(yǎng),轉(zhuǎn)染前24h加入佛波酯(PMA),使其終濃度為25ng mL,誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞,再進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞分布應(yīng)占平皿的50%80%。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:按梭華-Sofast基因轉(zhuǎn)染試劑說明書將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,同時(shí)作pcDNA3.1(+)及空白對(duì)照組。(3)Westernblotting鑒定:轉(zhuǎn)染后48h收獲細(xì)胞并裂解細(xì)胞內(nèi)總蛋白,取20 L處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至NC膜,5g L脫脂奶封閉1h,加入1 2000

10、稀釋后的一抗孵育1h,PBST洗膜,然后與1 4000二抗孵育1h,PBST洗膜后加入發(fā)光底物孵育1min,暗室中用X光片曝光、顯影、定影。TM1 材料與方法1.1 材料 乙肝病人血清由南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院傳染科提供。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和DH5 由本室保存,THP-1細(xì)胞由南華大學(xué)心血管研究所惠贈(zèng)。dNTP、Taq酶、T4連接酶、EcoR 、Hind 、100bpDNAMarker購自上海生物工程公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于華美生物工程公司。鼠抗人HBVX一抗、佛波酯(PMA)購于晶美生物工程公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購于博士德公司。Westernbl

11、otting所用發(fā)光底物購于Amersham公司。梭華-Sofast基因轉(zhuǎn)染試劑購于廈門太陽馬生物工程有限公司,RPMI1640購于Gibco公司,引物合成由上海生物工程公司提供。1.2 方法1.2.1 X基因真核載體的構(gòu)建 (1)血清HBVDNA抽提:100 L血清加入300 LTES液(10mmol LTris-HCl,pH8.0,5mmol LEDTA,0.5%SDS,50 gProteaseK)混勻,60 消化1h,等體積苯酚 氯仿及氯仿抽提各一次,上清加入2倍體積無水乙醇及1 10體積3mol L醋酸鈉(pH4.8)沉淀病毒DNA,再以70%乙醇漂洗一次,并溶于20 L滅菌雙蒸水中。

12、(2)PCR擴(kuò)增X基因:根據(jù)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫公布的HBVX序列(PubmedNC_003977),設(shè)計(jì)引物,分別在上游引物和下游引物5 端添加限制性內(nèi)切酶EcoR 和Hind 酶切位點(diǎn)。引物1:5 -GTTAAGCTTATGGCTGCTAGGTM2 結(jié) 果2.1 X基因真核載體的構(gòu)建2.1.1 PCR擴(kuò)增X基因 進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖電泳顯示約500bp處可見一明顯條帶,見圖1。2.1.2 HBx基因表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx的雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx經(jīng)Hind 、EcoRI雙酶切,可以切出2個(gè)片段,大片段遷移率與pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒遷移率的遷移率接近

13、,小片段位于核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量約500bp處,與目的基因大小一致,見圖2。測(cè)序結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBx含有完整的正確的X基因片段。圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果Marker上。每年因HBV感染致死的人數(shù)有100萬左右。HBVX基因編碼的X蛋白具有多種生物學(xué)功能,如反式激活作用,可激活多種病毒和細(xì)胞基因,包括RAS、NF- B、FasL、STAT-3及MAKP JAK途徑等,在HCC的發(fā)病過程中起核心作用6,71;或通過影響正常的細(xì)胞周期,干擾DNA的8修復(fù)及調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖、分化和凋亡等。另外,Lee等發(fā)現(xiàn)HBx可直接與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (trans-forminggrowt

14、hfactorbeta,TGF- )信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的蛋白質(zhì)Smad4發(fā)生相互作用,促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位,后者同AP-1轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1(activator圖2 pcDNA3.1(+)-X的雙酶切protein,AP-1)、ATF2、TFE3等協(xié)同作用后可以調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄,增強(qiáng)TNF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),這部分說明X蛋白可以影響宿主的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了X基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx,利用載體上無組織特異性的啟動(dòng)子CMV指導(dǎo)HBx的表達(dá),為進(jìn)一步研究HBx對(duì)宿主的免疫功能奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。由于乙肝病毒感染的宿主專一性很強(qiáng),只感染人及少數(shù)幾種靈長(zhǎng)類動(dòng)物,因此,大大限制了人類對(duì)這類病毒

15、性疾病的研究和防治。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),能將感興趣的基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中穩(wěn)定、持續(xù)地表達(dá),在體外細(xì)胞水平上了解X基因的表達(dá)調(diào)控,并分析其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能。pcDNA3.1(+)是一常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,載體上巨細(xì)胞瘤病毒(CMV)是一表達(dá)效率較高的啟動(dòng)子,帶有原核和真核復(fù)制起始序列,以及抗氨芐青霉素(AmpR)和新霉素(NeoR)抗性基因篩選標(biāo)志和一系列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞所需的表達(dá)調(diào)控元件。文獻(xiàn)中研究HBx所用的細(xì)胞株大多是2.2 真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx在THP-1巨噬細(xì)胞中的表達(dá) 將pcDNA3.1(+)-HBx和pcDNA3.1(+)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞

16、,轉(zhuǎn)染后48h用鼠抗人HBVX一抗做Westernblotting分析,pcDNA3.1(+)-HBx轉(zhuǎn)染組在17kDa處出現(xiàn)了陽性反應(yīng)帶,而在pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組與THP-1巨噬細(xì)胞對(duì)照組相應(yīng)泳道則沒有陽性反應(yīng)帶,見圖3。表明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx可以在真核細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。3 討 論乙型肝炎是嚴(yán)重威脅人類健康的世界性傳染病。據(jù)WHO報(bào)道,世界上已有20億人被乙型肝HepG2、HLF、CCL213細(xì)胞以及小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)和原代成纖維細(xì)胞等,至今未見X基因轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)將pcDNA3.1(+)-HBx轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞并進(jìn)行表

17、達(dá),下一步作者將探索HBVX蛋白在肝癌發(fā)生中的致病作用及其分子機(jī)制。參考文獻(xiàn):1 ArbuthnotP,KewM.HepatitisBvirusandhepatocellularcarcino-maJ.IntJExpPathol,2001,82(2):77-100.andhepatitisBvirus:aprospectivestudyof22707meninTaiwanJ.Lancet,1981,2:1129-1133.3 ChisariFV.Viruses,immunityandcancer:lessonsfromhepatitisBJ.AmJPathol,2000,156:1117-11

18、32.acofactorofsurvivininapoptosissuppressionJ.EMBOJ,2003,22(11):2729-2740.ofenhancerIandXpromoterinhepatitisBvirusmoreefficientlythanp73alphaJ.WorldJGastroenterol,2002,8(6):1094-1097.hepatocellularcarcinomaanditsrelationshipwithFas FasLsystemJ.WorldJGastroenterol,2003,9(12):2671-2675.inhibitsFas-med

19、iatedapoptosisandisassociatedwithup-regu-lationoftheSAPK JNKpathwayJ.JBiolChem,2001,276(11):8328-8340.8 LeeDK,ParkSH,YiY,etal.ThehepatitisBvirusencodedon-co-proteinpXamplifiesTGF- familysignalingthroughdirectinteractionwithSmad4:potentialmechanismofhepatitisBvirus-inducedliverfibrosisJ.GenesDev,2001

20、,15(4):455-466.(收稿日期:2006-04-23)(上接第319頁)1激。但姜黃素對(duì)心血管系統(tǒng)的作用主要集中在降脂724參考文獻(xiàn):1 NaitoM,WuX,NomuraH,etal.Theprotectiveeffectsoftetra-hydrocurcuminonoxidativestressincholesterol-fedrabbitsJ.JAtherosclerThromb,2002,9(5):243-250.extractsupplementationreducesoxidativestressandattenuatesaort-icfattystreakdevelo

21、pmentinrabbitsJ.ArteriosclerThrombVascBiol,2002,22(7):1225-1231.3 ZhangW,LiuD,WoX,etal.Effectsofcurcumalongaonprolif-erationofculturedbovinesmoothmusclecellsandonexpressionoflowdensitylipoproteinreceptorincellsJ.ChinMedJ(Engl),1999,112(4):308-311.4 Ramirez-TortosaMC,MesaMD,AguileraMC,etal.Oralad-ministrationofaturmericextractinhibitsLDLoxidationandhashy-pocholesterolemiceffectsinrabbitswithexperimentalatherosclerosisJ.Atherosclerosis,1999,147(2):371-378.5 QuilesJL,AguileraC,MesaMD,etal.Anethanolicaqueousex-tractofcurcumalongadecreasesthesusceptibilityoflivermicr