乙型肝炎病毒大蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子

1、原 文：The Hepatitis B Virus Large Surface Protein (LHBs Is aTranscriptional Activator作 者：EBERHARD HILDT, GESINE SAHER, VOLKER BRUSS, and PETER HANSHOFSCHNEIDER作者單位：1 Department of Virus Research, Max-Planck-Institut furBiochemie, Am Klopferspitz 18a, D-82152 Martinsried, Germany;2 Department of Medica

2、l Microbiology, University of Gottingen,Kreuzbergring 57, D-37075 Gottingen, Germany發(fā)表刊物：VIROLOGY 225, 235239 (1996 ARTICLE NO. 0594以下為中文翻譯稿：乙型肝炎病毒大表面蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子摘要：已有報(bào)道稱C端截短的乙型肝炎病毒中表面蛋白（MHBst ）能作為轉(zhuǎn)錄激活子起作用，該功能依賴于MHBst N端PreS2結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)定位。在野生型MHBs中，PreS2結(jié)構(gòu)域翻譯時(shí)轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）腔。最近有報(bào)道顯示，HBV大表面蛋白（LHBs）的PreS2結(jié)構(gòu)域在翻譯完

3、成后先停留在ER膜的胞質(zhì)面。LHBs是否與MHBst 具一樣的轉(zhuǎn)錄激活功能？我們發(fā)現(xiàn)，與MHBst 相似，LHBs也確實(shí)能激活一系列啟動(dòng)子元件。有證據(jù)表明LHBs能PKC-依賴地活化AP-1和NF-B。PKC下游的c-Raf-1激酶的功能是AP-1和NF-B依賴LHBs活化的先決條件，因?yàn)閷-Raf-1激酶的抑制能消除AP-1和NF-B的LHBs-依賴的轉(zhuǎn)錄水平的活化。HBV 表面抗原基因由一個(gè)單獨(dú)的ORF 組成。該ORF 被分割成三個(gè)分別起始于三個(gè)同框ATG 密碼子的編碼區(qū)preS1、preS2、s，相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)镻reS1、PreS2、S。第一個(gè)ATG 翻譯起始合成大的肝炎表面抗原（

4、LHBs），包括PreS1、PreS2和S；第二個(gè)ATG 起始合成中表面蛋白（MHBs，包括PreS2和S）；第三個(gè)ATG 起始合成小表面蛋白（SHBs，包括S）。三個(gè)HBV 表面蛋白都是組成膜蛋白。MHBs 具單糖基化和雙糖基化兩種形式，糖基化發(fā)生在PreS2的第4個(gè)氨基酸和S 的第146個(gè)氨基酸；LHBs和SHBs 都是單糖基化，糖基化發(fā)生在S 的第146個(gè)氨基酸。令人驚訝的是，LHBs也是單糖基化，盡管它也含有第二個(gè)糖基化位點(diǎn)（PreS2的aa4）。最近的研究工作顯示，LHBs的PreS1- PreS2定位于細(xì)胞質(zhì)而不在翻譯時(shí)轉(zhuǎn)移跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（1-3）。該定位使得PreS2 aa4的糖基

5、化位點(diǎn)不能與糖基轉(zhuǎn)移酶靠近。只有一部分的LHBs 的PreS1- PreS2在病毒組裝時(shí)通過分泌途徑在翻譯后轉(zhuǎn)移跨膜。在病毒顆粒中，有一部分的LHBs 的PreS1- PreS2出現(xiàn)在病毒表面。MHBs 和SHBs 以亞病毒顆粒的形式被分泌，而LHBs 的分泌則需要MHBs 和SHBs 的共表達(dá)。由MHBs 和SHBs 引發(fā)的LHBs 的超過量生產(chǎn)導(dǎo)致所有蛋白質(zhì)滯留在細(xì)胞內(nèi)（4-6）。當(dāng)preS2/s基因3端截短時(shí)（至少跨膜結(jié)構(gòu)域3的編碼區(qū)被刪除），所獲得的MHBs 衍生物具轉(zhuǎn)錄激活功能（7-9）。與全長MHBs 不同，該轉(zhuǎn)錄激活子既不能被分泌也不被糖基化（10）。最近報(bào)道顯示PreS2結(jié)構(gòu)域

6、足夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活功能。結(jié)構(gòu)蛋白MHBs與轉(zhuǎn)錄激活子MHBst 產(chǎn)生功能差異的原因在于N端PreS2結(jié)構(gòu)域定位的不同：在MHBs中，PreS2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（10，12）；而在MHBst 中，PreS2定位于胞質(zhì)（11）。該定位使得與胞質(zhì)內(nèi)的結(jié)合伴侶相互作用成為可能。與PKC的直接相互作用對于觸發(fā)HepG2 cells (1.0x106 細(xì)胞。pSVLM-S -能在不產(chǎn)生MHBs和SHBs的情況下表達(dá)LHBs蛋白，從而可以在沒有HBV蛋白影響的條件下考察LHBs-依賴的轉(zhuǎn)錄激活。當(dāng)-pSVLM S 與報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染時(shí)，我們觀察到對CAT報(bào)告基因7至9倍的誘導(dǎo)效應(yīng)。該誘導(dǎo)效應(yīng)與pSVMHBst76

7、(編碼aa76以后被截短的MHBst 蛋白（10）轉(zhuǎn)染后的轉(zhuǎn)錄活化效應(yīng)相近。等量的pUC19作為陰性對照同時(shí)共轉(zhuǎn)染(Fig.1a。一系列最近限度的啟動(dòng)子(2xNF-B或3xAP-1和SV40早期啟動(dòng)子都能被LHBs所活化。這說明結(jié)構(gòu)蛋白LHBs是一個(gè)具多效性的轉(zhuǎn)錄激活子?，F(xiàn)在的問題在于，L蛋白在MHBs和SHBs存在時(shí)是否仍然具有轉(zhuǎn)錄激活功能。于是用上述報(bào)告基因與同時(shí)表達(dá)LHBs、MHBs和SHBs的pSVLHBs(1共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。與轉(zhuǎn)染pSVLM-S -的細(xì)胞相比，稍有降低但仍有6至7倍的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)被觀察到(Fig.1b。輕微的降低也許反映LHBs合成的減少。 FIG.1.LHBs

8、具轉(zhuǎn)錄激活功能。(a CAT 分析：報(bào)告質(zhì)粒pSV2-CAT, p3xAP-1-CAT, or p2xNF-kB-CAT和表達(dá)質(zhì)粒pSVLM-S-(編碼LHBs,pSVMHBst76(編碼MHBst76,或pUC19（陰性對照）共轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞。其中的倍數(shù)取自四次獨(dú)立轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均值，以對照載體為參照。(b CAT 分析：報(bào)告質(zhì)粒pSV2-CAT, p3xAP-1-CAT, or p2xNF-kB-CAT和表達(dá)質(zhì)粒pSVLHBs (編碼LHBs, MHBs, and SHBs,pSVMHBst76(編碼MHBst76, or pUC19（陰性對照）共轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞。其中的倍數(shù)取自四

9、次獨(dú)立轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均值，以對照載體為參照。 FIG. 2. LHBs 的轉(zhuǎn)錄激活功能依賴PKC and c-Raf-1 kinase 。CAT 分析：pSVLM-S-與報(bào)告基因p3xAP-1-CAT or p2xNF-kB-CAT共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。pSVMHBst76共轉(zhuǎn)染作陽性對照；pUC19共轉(zhuǎn)染作陰性對照。其中的倍數(shù)取自四次獨(dú)立轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均值，以對照載體為參照。(a細(xì)胞培養(yǎng)液中含0.1 m M H7以抑制PKC或者將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前暴露于200 ng/ml TPA 30hr以將細(xì)胞培養(yǎng)液中的PKC耗盡。 (b pHCR13.1（編碼c-Raf-1激酶陰性突變體）、pSVL M-S-,

10、或 pSVMHBst76 與報(bào)告基因p2xNF-kB-CAT或p3xAP-1-CAT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。作為對照，用pMNC與報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。研究表明，MHBst 依賴的轉(zhuǎn)錄激活是由PKC依賴的c-Raf-1/MAP2-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化所介導(dǎo)(Hildt et al., submitted。LHBs-依賴的轉(zhuǎn)錄激活是否也由相同的信號傳導(dǎo)途徑所觸發(fā)？首先在PKC抑制因子H7存在時(shí)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：當(dāng)培養(yǎng)液中含0.1mM H7時(shí)，報(bào)告基因p3xAP-1-CAT或p2xNF-kB-CAT LHBs依賴的活t76化完全消失(Fig.2a；以前報(bào)道的報(bào)告基因MHBs依賴的活化作用被抑制的現(xiàn)象(Hildt

11、 et al., submitted for publication也有被觀察到。（克隆載體pUC19轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對照。）因?yàn)镠7不具完全的PKC特異性，又在轉(zhuǎn)染前30小時(shí)內(nèi)通過連續(xù)的TPA刺激(100ng/ml耗盡培養(yǎng)液中所有的PKC。在這樣的條件下，LHBs-t76依賴的和MHBs-依賴的NF-kB- (7倍于對照 和AP-1- (9倍于對照報(bào)告基因的活化都被抑制（1.3-到1.5-倍于對照）。這些結(jié)果表明，LHBs-依賴的轉(zhuǎn)錄活化可由PKC的活化所介導(dǎo)(Fig.2a。在MHBst 表達(dá)細(xì)胞中，c-Raf-1激酶的功能對于觸發(fā)AP-1和NF-kB的活化十分重要(Hildt et al.

12、, submitted for publication。為了調(diào)查AP-1和NF-kB的LHBs-依賴的轉(zhuǎn)錄活化是否也由c-Raf-1激酶的活化所介導(dǎo)，1.5g表達(dá)質(zhì)粒pSVLM -S - 、報(bào)告基因p3xAP-1-CAT(1g或p2xNF-kB-CAT(1.5g與1.5g pHCR13.1（編碼c-Raf-1激酶陰性突變體）(14一起共轉(zhuǎn)染1.0x106 HepG2細(xì)胞。c-Raf-1激酶陰性突變體的共表達(dá)導(dǎo)致AP-1（1.7倍）和NF-kB（1.4倍）的LHBs-t76依賴的活化完全喪失(Fig.2b。陽性對照轉(zhuǎn)錄因子的MHBs依賴的活化也完全消失。在對照實(shí)驗(yàn)中（pHCR13.1被克隆載體p

13、MNC所代替）LHBs- or MHBst76 -依賴的轉(zhuǎn)錄因子的活化仍然有被觀察到。但AP-1和NF-kB的LHBs-依賴的活化作用的抑制是否是由pHCR13.1的非特異性毒性所致呢？用pHCR13.1和報(bào)告質(zhì)粒p2xNF-kB-CAT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入H2O （終濃度為500M）刺激細(xì)胞。結(jié)果顯示， H2O 22依賴的NF-kB的活化不被c-Raf-1激酶陰性突變體的共表達(dá)所影響。因此，LHBs-依賴的轉(zhuǎn)錄活化由c-Raf-1激酶所介導(dǎo)。但是，用c-Raf-1激酶表達(dá)質(zhì)粒pMNC-c-raf代替pHCR13.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提高細(xì)胞內(nèi)源c-Raf-1激酶水平并不能顯著增強(qiáng)報(bào)告基因的LHBs- o

14、r MHBs t76-依賴的活化水平。綜上所述，內(nèi)源c-Raf-1激酶的水平并不能限制性觸發(fā)AP-1或 NF-kB的LHBs-依賴的活化。總言之，本研究發(fā)現(xiàn)LHBs確實(shí)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，并且LHBs-依賴的轉(zhuǎn)錄t 活化，與MHBs依賴的轉(zhuǎn)錄激活一樣，由PKC依賴的c-Raf-1/MAP2-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化所介導(dǎo)。相同的靶物質(zhì)（即AP-1 或NF-b）被活化；和c-Raf-1激酶能是由PreS2區(qū)域的細(xì)胞質(zhì)定位所產(chǎn)生的。轉(zhuǎn)錄激活似乎并不是由引起細(xì)胞內(nèi)分子水平增高的LHBs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留所引起。30 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-Cysteine）條件下的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明

15、這樣的條件對于轉(zhuǎn)錄激活功能并沒有顯著影響（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。體內(nèi)LHBs連續(xù)的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因老鼠中毛玻璃樣肝細(xì)胞（ground glass hepatocytes）的產(chǎn)生(5，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)大量LHBs的存在。在轉(zhuǎn)基因老鼠模型上還能看到肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的產(chǎn)生。目前認(rèn)為HCC的發(fā)展是由體內(nèi)LHBs連續(xù)的過表達(dá)造成的持續(xù)煽動(dòng)過程所引發(fā)。因?yàn)長HBs的過表達(dá)導(dǎo)致一些控制細(xì)胞增殖的激酶的活化(PKC, c-Raf-1 kinase，這些酶的連續(xù)活化可能與肝癌的發(fā)生具一定的相關(guān)性。根據(jù)癌癥發(fā)生機(jī)制的多因子模型，LHBs 的連續(xù)表達(dá)可能具有腫瘤促發(fā)功能。L

16、HBs對于病毒粒子的組裝十分重要。根據(jù)現(xiàn)有結(jié)果，我們預(yù)測其第二個(gè)功能是通過病毒啟動(dòng)子元件的轉(zhuǎn)錄激活參與病毒復(fù)制。這似乎與HBx（乙型肝炎病毒X蛋白）相類似。盡管HBx的功能不是HBV復(fù)制的先決條件，但HBx通過對病毒和/或細(xì)胞啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活參與病毒復(fù)制(15。具體說來，在肝細(xì)胞剛被感染HBx還沒產(chǎn)生時(shí)，LHBs能代替HBx發(fā)揮作用；其后，LHBs與HBx共同發(fā)揮作用。這也許可以解釋為什么HBx，至少在體外，不是HBV復(fù)制所必需的。還需要注意的是，LHBs 的轉(zhuǎn)錄激活功能可能使乙型肝炎攜帶者患HCC的可能性增大，因?yàn)檫@些攜帶者也是LHBs陽性。 參考文獻(xiàn)： 1. Bruss, V., Lu,

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