低密度脂蛋白受體相關蛋白基因兩種多態(tài)性與阿爾茨海默病的關系

1、    低密度脂蛋白受體相關蛋白基因 兩種多態(tài)性與阿爾茨海默病的關系        摘要：目的探討低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)基因兩種多態(tài)性與阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的相關情況。方法應用分子生物學技術，在42例患者和40名正常人中觀察LRP基因、ApoE基因多態(tài)性的分布，進行關聯(lián)分析。結果AD與LRP基因上游區(qū)域5端插入序列多態(tài)性無關聯(lián)；AD與LRP基因外顯子3多態(tài)中的等位基因C正關聯(lián)(RR=2.362， P<0.05)，

2、與基因型C/C正關聯(lián)(RR=2.710，P<0.05)；AD與ApoE基因4等位基因正關聯(lián)(RR=3.194，P<0.01)，與4/3基因型正關聯(lián)(RR=3.148，P<0.05)，但與4/2基因型無關；無ApoE 4等位基因的AD與LRP C/C基因型正關聯(lián)(RR=6.842，P<0.05)，有ApoE 4等位基因的AD患者與LRP C/C基因型無關聯(lián)(RR=1.857，P>0.05)。結論ApoE 4是AD發(fā)病的風險因子；LRP基因多態(tài)性與AD正關聯(lián)是由于LRP基因C/C型在患者中過表達所致；LRP基因C/C型是無ApoE 4的AD患者發(fā)病的風險因子。關鍵詞：

3、阿爾茨海默病；受體，免疫；載脂蛋白E類；基因Two polymorphisms in the LRP gene and Alzheimers diseaseBI ShengWANG Desheng, ZHANG Yuet al.（Department of Neurology, the First Clinical College of Harbin Medical University, Harbin 150001, China）Abstract：ObjectiveTo examine the asssociation of two low-density lipoprotein recep

4、tor-related protein (LRP) gene polymorphisms with sporadic late-onset Alzheimers disease(AD). MethodsThe two polymorphisms in the LRP gene were genotyped in 42 AD cases and 40 controls with molecular biological methods. The apolipoprotein E (ApoE) gene polymorphism was also genotyped. Results， ，P<

5、;0.05) for the LRP exon 3 polymorphism; AD was associated with ApoE ，P<0.01) and genotype ，P<0.05); there was association between AD without ApoE ，P<0.05). ConclusionsThe ApoE 4 is a risk factor of AD; the AD is associated with LRP exon 3 polymorphism because of over-represented C/C genotyp

6、e of LRP gene; C/C genotype of LRP gene may be an independent risk factor of AD patients without ApoE 4.Key words：Alzheimers diseases; Receptors, immunogic; Apolipoproteins E; Genes 載脂蛋白E(ApoE)基因決定阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)發(fā)病的遺傳易患性，但其分子生物學機制目前還不清楚。ApoE的主要受體是低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)，且LRP與ApoE及淀粉樣前體蛋白(APP)

7、共存于AD的病理特征老年斑中，并調節(jié)著二者的代謝。因此，LRP作為AD的一個候選基因受到了普遍關注。目前尚未發(fā)現(xiàn)LRP基因存在著誘發(fā)AD的錯義突變，但位于LRP基因5端上游區(qū)域插入序列和外顯子3存在著遺傳多態(tài)。我國尚未見這方面的報道。為此，我們對AD患者LRP基因兩種多態(tài)性及ApoE基因多態(tài)性進行了初步研究，現(xiàn)將結果報道如下。資料和方法一、資料所有病例由哈爾濱醫(yī)科大學一院和白求恩醫(yī)科大學一院提供。診斷根據(jù)簡易精神狀態(tài)檢查表(MMSE)，長谷川癡呆量表初篩作出癡呆的診斷，再采用美國國立神經病語言機能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關疾病協(xié)會(NINCDS-ADRDA)標準作出AD診斷。以健康老

8、年人為正常對照。本研究含AD患者42例，其中男23例，女19例，年齡6079歲，平均(70.4±6.6)歲；對照組40名，男24名，女16名，年齡6081歲，平均(68.1±4.3)歲。兩組研究對象均為隨機選擇，無血緣關系。二、方法1. 基因組DNA的提取：按常規(guī)方法提取外周血白細胞基因組DNA。2. LRP基因5端上游區(qū)域插入序列多態(tài)性檢測1：引物為：5-TGTAAGGTGAGAGAATG-CATA-3和5-TGGGCA- ACAAGAGTGCAACTCCA-TC-3。PCR條件：943 min，35次循環(huán)(94 30 s，56 30 s，71 60 s)，70 5 mi

9、n。取PCR產物10 l，12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，固定，銀染，顯色，根據(jù)電泳帶型確定基因型（1）。1，3：純合基因型A1/A1(91 bp/91 bp)；2：純合基因型A2/A2(87 bp/87 bp)；4：雜合基因型A1/A2(91 bp/87 bp)；M：核苷酸分子量標準pBR322/Msp IDNA Marker1LRP基因5端上游區(qū)域插入序列多態(tài)性檢測結果3. LRP基因外顯子3多態(tài)性檢測2：引物為：5-GGGGTCCAGGACTG-CATGTA-3和5-AA-GTCCGTACCTCGGC- AGTG-3。PCR條件：94 3 min，32次循環(huán)(94 30 s，54 30

10、s，72 30 s)，72 3 min。取PCR產物5 l，加5 U RsaI內切酶，37酶切過夜，12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切產物，固定，銀染，顯色，根據(jù)電泳帶型確定LRP基因型（2）。1：純合基因型T/T(51 bp/51 bp)；2：純合基因型C/C(32 bp/32 bp)；3：雜合基因型C/T(32 bp/51 bp)；4：PCR產物(分子量大小為59 bp)；M：核苷酸分子量標準pBR322/Hae III DNAMarker2LRP基因外顯子3多態(tài)性檢測結果4. ApoE基因型檢測3:引物：5-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3和5-ACAGAATTCG

11、CCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3。PCR條件：95 5 min，35次循環(huán)(94 30 s，65 30 s，72 90 s)，72 5 min。取PCR產物10 l，加20 UHhaI內切酶，37酶切過夜，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，固定，銀染，顯色，根據(jù)電泳帶型確定ApoE基因型（3）。16基因型依次分別為4/4，2/2，3/3，3/4，2/4，2/3；M：核苷酸分子量標準pBR322/Msp I DNA Marker3ApoE基因型檢測結果5. 統(tǒng)計學處理： 計算各等位基因和基因型頻率的分布，吻合度檢驗確定是否符合Hardy-Weinberg平衡；用卡方檢驗進行顯著性分析

12、。采用Woolfs法計算相對危險率(RR)，對AD與LRP基因兩種多態(tài)性或ApoE基因進行關聯(lián)分析。結果1. LRP基因5端上游區(qū)域插入序列多態(tài)中各等位基因和基因型頻率分布：見表1。表1各組低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)基因上游區(qū)域5端插入序列基因型和等位基因頻率分布組別例數(shù)基因型 等位基因A1/A1A1/A2A2/A2A1A2AD組 420.310 0.071 對照組40 0.325 0.050 0.788 注：A1為91 bp， A2為87 bp 2. AD患者與正常人LRP基因外顯子3多態(tài)中各等位基因和基因型頻率分布：見表2。結果表明：AD與等位基因C正關聯(lián)(RR=2.362，P&l

13、t;0.05)；與基因型C/C正關聯(lián)(RR=2.710，P<0.05)。表2各組低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)基因外顯子 3基因型和等位基因頻率分布組別例數(shù)基因型 等位基因C/C C/TT/TCTAD組 42*0.047 * 對照組40 0.575 0.325 0.738 注：與對照組比較，*P<0.05 3. AD患者與正常人ApoE各等位基因和基因型頻率分布：見表3。結果表明：AD患者與ApoE基因4等位基因正關聯(lián)(RR=3.194，P<0.01)，與4/3基因型正關聯(lián)(RR=3.148， P<0.05)，但與4/2基因型無關。4. 有或無ApoE 4等位基因的

14、AD患者與LRP基因外顯子3多態(tài)性關聯(lián)分析： 我們按照是否具有ApoE 4等位基因將AD患者分為兩組，分別與相應對照組進行比較。AD組和對照組中不具有ApoE 4等位基因的例數(shù)分別為22和32例，其中具有LRP C/C 基因型者分別為20和19例。分析結果表明，在有ApoE 4等位基因的群體中，AD與LRP基因外顯子3多態(tài)性之間無關聯(lián)(RR=1.857，P>0.05)；而在無ApoE 4等位基因的群體中，AD與LRP基因的C/C 基因型正關聯(lián)(RR=6.842，P<0.05)，表明無ApoE 4的AD患者的發(fā)病可能是由LRP基因C/C型過度表達所致。表3各組載脂蛋白E(ApoE)基

15、因型和等位基因頻率分布組別例數(shù)基因型 等位基因2/23/34/43/24/34/2234AD組 420.000 0.048 0.048 *0.071 0.679 *對照組40 0.025 0.000 0.075 0.150 0.050 0.088 0.812 注： 與對照組比較，*P<0.05，*P<0.01 討論LRP基因位于第12號染色體上，全長92 kb，由89個外顯子組成。在LRP基因的上游區(qū)域具有多態(tài)性，由四核苷酸重復序列(TTTC)n形成，具有4種等位基因，它們的區(qū)別僅在于1個四核苷酸重復序列。其中91 bp和87 bp等位基因出現(xiàn)的頻率最高，95 bp和83 bp等位

16、基因的頻率較低，在某些人群中甚至極為罕見。本研究也未能檢測出95 bp和83 bp兩種等位基因，但所檢測到的三種基因型與AD之間均無關聯(lián)。這可能由于該多態(tài)受很多因素，如種族、地理環(huán)境等的影響，值得進一步探討。LRP基因外顯子3的多態(tài)性位點位于LRP cDNA的第766位核苷酸，由堿基C或T構成，相應地產生三種LRP基因型：純合子C/C、T/T和雜合子C/T。雖然關于該多態(tài)與AD的關系尚存在爭論4，但我們發(fā)現(xiàn)LRP等位基因C與基因型C/C與AD正關聯(lián)，與文獻報道一致5,6，表明本研究中LRP基因多態(tài)性與AD關聯(lián)是由LRP基因C/C型所致，C/C型在AD患者中過度表達，導致AD組與對照組比較產生顯

17、著性差異。本研究同時檢測了ApoE基因多態(tài)性與AD的關系，發(fā)現(xiàn)ApoE基因等位基因4與AD正關聯(lián)，這與馮穎等7的報道一致；表明ApoE基因多態(tài)性與AD的關聯(lián)可能僅由等位基因4頻率增高所致。本研究發(fā)現(xiàn)ApoE 4/3基因型與AD正關聯(lián)，而4/2基因型與AD卻無關聯(lián)，我們認為可能是由于在進行ApoE基因分型后樣本數(shù)量減少所致。有關LRP基因多態(tài)的功能目前尚不清楚，該多態(tài)性可能只是與另一種突變連鎖不平衡，而這種突變位于LRP基因與ApoE基因或含ApoE脂蛋白結合的區(qū)域內，可改變AD病理過程中ApoE的作用；或可能位于與APP結合的區(qū)域內，調節(jié)APP的吸收和降解8。因而，進一步利用分子生物學手段，在

18、中樞神經系統(tǒng)中探討LRP與ApoE或LRP與APP間的相互作用，將為AD的發(fā)生、發(fā)展提供新的線索。作者單位：畢勝（150001 哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科）王德生（150001 哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科）盛雨辰（150001 哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科）韓輝（150001 哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科）張昱（白求恩醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科）吳江（白求恩醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科）王守春（白求恩醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科）孔繁軍（白求恩醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科）參考文獻：1Zuliani G,Hobbs HH.Tetranucleoti

19、de length polymorphism 5 of the a2-macroglobulin receptor (A2MR)/LDL receptor -related protein (LRP) gene. Hum Mol Genet,1994,3:215.2Baum L,Dong ZY,Choy KW,et al.Low density lipoprotein receptor related protein gene amplification and 766T polymorphism in astrocytomas.Neurosci Lett,1998,256:5-8.3Wenh

20、um PR,Price WH,Blundell G,et al. Apolipoprotein E genotyping by one-stage PCR.Lancet,1991,337:1158-1162.4Clatworthy AE,Gomez-Isza T,Rebeck GW,et al.Lack of association of a polymorphism in the low-density lipoprotein receptor-related protein gene with Alzheimer disease. Arch Neurol,1997,54:1289-1292.5Hollenbach