Toll樣受體基因多態(tài)性和兒童特應性疾病的相關性研究

1、Toll樣受體基因多態(tài)性和兒童特應性疾病的相關性研究一、 項目研究意義特應征（atopy）又稱異位性，是上世紀初葉Coca和Cooke命名的。特應征的定義各種各樣，目前認為它是一種IgE介導的異常的特異性免疫反應。特應性疾?。╝topic diseases）是指由上述反應引起的各種慢性皮膚和呼吸道疾病，包括特應性皮炎、變應性鼻炎和變應性哮喘等，它們共同的特點是皮膚過敏原試驗陽性，血清總IgE和特異性IgE升高。近年的流行病學研究結果顯示特應性疾病的發(fā)生率在上升，尤其在兒童或青少年中更為明顯。以哮喘為例，我國大約有1000萬兒童哮喘患者。全國兒科哮喘防治協(xié)作組于2000年進行了第二次全國城市兒童

2、哮喘患病率抽樣調查顯示，全國兒童哮喘患病率為1.97，比1990年第一次哮喘流調時增加了近1倍。1990年我省的兒童哮喘現(xiàn)患率為6%，累計發(fā)病率為1.16%，而2000我省的兒童哮喘現(xiàn)患率為1.44%，累計患病率為2.14%，無論是現(xiàn)患率還是累計患病率均較10年前有大幅上升。特應性疾病發(fā)病率的上升給家庭和社會帶來沉重的負擔，仍以哮喘為例，哮喘患兒中，有5.64的學齡兒童不能上體育課，1年內因病假缺勤的占了42.47。有95.47的患兒家長因為孩子患哮喘使工作受到影響，其中每年耽誤10天以上的占到62.27。因此，特應性疾病不僅是21世紀亟待攻克的醫(yī)學問題，也已成為亟需解決的社會問題。特應性疾病

3、有強烈的家族傾向，一組對大學生的調查發(fā)現(xiàn)：當一級親屬中沒有一個患特應性疾病時，特應性疾病的患病率為15%；當其中一個一級親屬具特應征，特應性疾病的患病率為33%，如兩個或以上一級親屬具特應征，則其患病率為68%。另一組調查發(fā)現(xiàn)，父母均無特應性疾病，小兒特應性疾病的患病率為10%，父母之一具特應征，小兒特應性疾病的患病率為40%，如果父母雙方均具特應性，則小兒特應性疾病患病率為60%-80%，可見特應性疾病受遺傳的強烈影響。隨著人類基因組計劃的開展，已有越來越多的學者關注特應性疾病和基因的關系。近10年來的研究發(fā)現(xiàn)，特應性疾病是個多基因遺傳病，已經發(fā)現(xiàn)多個和特應征相關的基因位點，不同人種存在種族

4、差異性。根據(jù)研究結果篩選出特應征基因攜帶者，有助于特應征的早期診斷和干預，減少特應性疾病的發(fā)生。特應性疾病的發(fā)生是多種危險因子相互作用的結果，包括遺傳易感性、暴露于變應原的時間和數(shù)量以及非特異性的“佐劑”因子如空氣污染等。過去10年中，一些社會經濟狀況良好的國家哮喘和過敏性疾病的發(fā)病增加，難以完全用遺傳背景的改變解釋。令人感興趣的是在歐洲和北美有許多關于農村兒童和成人特應性疾病發(fā)病率低的報道。因為在農村的動物上檢測到大量的微生物，因此人們認為早期暴露于微生物的產物可使個體調節(jié)免疫反應，使Th2向Th1轉變，從而減少特應性疾病的發(fā)生，相反兒童在免疫成熟期處于“清潔”的環(huán)境會導致Th2表達增加，增

5、加特應性疾病的機會，這就是衛(wèi)生學說（hygiene hypothesis）的由來。盡管有這樣的發(fā)現(xiàn)，但是其機制尚不清楚。內毒素和LPS是G-桿菌細胞的外層成分。模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別內毒素，通過內毒素受體復合體（包括LBP、CD14、MD2、TLR）激活固有免疫系統(tǒng)。固有免疫反應是抵御感染的一道強有力的早期屏障，在感染的最初幾小時內，它可以識別不同種類的病原細菌、病毒和真菌，并且對于激發(fā)晚一步啟動的獲得性免疫反應也至關重要。而Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）家族是觸發(fā)固有免疫反應的關鍵所在，因此人們

6、對Toll樣受體的研究成為固有免疫研究的熱點之一。TLRs在抗原遞呈細胞、調節(jié)性T細胞和其他細胞表面表達在環(huán)境和免疫系統(tǒng)的相互作用中起關鍵作用，這些細胞分泌的信號調節(jié)CD4+、CD8+細胞的成熟，這種成熟決定了對環(huán)境變應原的獲得性免疫反應。因此認為TLR的基因變異會對免疫反應類型產生影響，也會影響特應性疾病的發(fā)生。Toll樣受體家族到目前為止共發(fā)現(xiàn)10類受體?，F(xiàn)被命名為TLR4的第一個哺乳動物TLR于1997年由耶魯大學的Janeway和Medzhitov發(fā)現(xiàn)，TLR4被G-細菌細胞壁的一種成分脂多糖（LPS）激活，還可識別其他細菌的PAMPs，同時又能介導呼吸道合胞病毒（RSV）的固有免疫。

7、目前研究標明TLR4基因在9q32-33,SNP分析發(fā)現(xiàn)896A/G導致Asp299/Gly，通過減少氣道上皮TLR4密度、減少炎癥細胞因子的分泌使機體對內毒素的反應性下降，從而增加特應性疾病的發(fā)生。英國報道TLR4基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)生無關，卻影響特應征的嚴重程度。也有研究發(fā)現(xiàn)在高度暴露于內毒素的兒童中TLR4/+4434和常見過敏原特異性IgE的關系，但盡管TLR4/+4434多態(tài)性和特異性IgE高度相關，但未發(fā)現(xiàn)其和哮喘和枯草熱之間明確的關系，因此可能有其他分子參與其中如MD2、CD14等。CD14是介導內毒素細胞反應的主要受體，是特應性疾病的另一個候選基因，位于5q，已經發(fā)現(xiàn)CD14基

8、因多態(tài)性與IgE高水平密切相關。嬰幼兒期感染釋放內毒素結合CD14受體，刺激Th1細胞因子表達，若存在CD14多態(tài)性，可使Th2表型持續(xù)表達。TLR2由阿拉伯甘露聚糖脂激活，這種糖脂是包括結核在內的分支桿菌的細胞壁成分，也可由鉤端螺旋體屬細菌的LPS激活，其信號傳導途徑和TLR4相似。Eder W等研究發(fā)現(xiàn)TLR2/-16934的變異決定了農村兒童哮喘和特應征的易感性，并認為TLR2是歐洲農村兒童哮喘發(fā)病的主要候選基因。含有T等位基因能夠增加抗原遞呈細胞表面的TLR2表達減少哮喘和過敏性疾病的發(fā)生，反過來也增加表達于微生物產物的TLR2配體的保護作用。Hertz等發(fā)現(xiàn)細菌脂肽可通過TLR2誘導

9、樹突狀細胞的成熟，使T細胞增值和IFN分泌能力大大提高，而TLR2的基因變異則會削弱這種功能，增加特應性疾病的發(fā)生。TLR3基因位于4q35，能識別雙鏈病毒RNAs，有報道其和日本人群過敏性哮喘的發(fā)生有關聯(lián)。TLR9則能識別主要存在與細菌DNA中的特殊序列CpG重復序列，而后者可刺激獲得免疫系統(tǒng)調節(jié)Th1/Th2平衡，減少特應性疾病的發(fā)生，Lazarus等報道TLR91237C/T多態(tài)性與歐洲美裔的哮喘發(fā)病有關。因此，研究Toll樣受體基因多態(tài)性和我省兒童特應性疾病的相關性，闡明Toll樣受體在我省兒童特應性疾病發(fā)病中的作用，對于我省兒童特應性疾病的防治，增進兒童健康具有十分重要的意義，也有利

10、于我省“和諧社會”的構建。二、 項目研究目標及與申請者研究工作長期目標的關系 本項目是利用基因測序的方法，系統(tǒng)研究Toll樣受體家族的基因多態(tài)性，探討TLR4、TLR2、TLR3、TLR9、CD14基因多態(tài)性和我省兒童特應性疾病之間的關系，尋找特應性疾病的候選基因，利于早期診斷和干預特應性疾病。 申請者所在的學科一直從事兒童哮喘和變態(tài)反應性疾病的基礎和臨床研究。申請者的主要研究方向在兒童喘息性疾病和特應征的關系及其早期診斷和干預，目前已完成“特應征和呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎的關系”課題，發(fā)表數(shù)篇論文在各級雜志上，承擔的省教育廳課題“呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎氣道炎癥和預后的關系研究”也已取得

11、初步成果。 本項目小組長期工作目標是建立兒童特應性疾病的基因診斷方法，尋找判斷兒童特應性疾病預后的指標，從而減少特應性疾病的發(fā)生、改善預后。特應性疾病的基因研究是全球變態(tài)反應學界的研究熱點，但目前有關中國兒童的資料很少。我國變態(tài)反應專業(yè)仍在發(fā)展中，很多醫(yī)院尚未設立變態(tài)反應科，過敏性鼻炎、過敏性哮喘和皮炎分別由耳鼻喉科、呼吸科和皮膚科醫(yī)生診治和管理。因此申請者在這方面的研究，有利于我省在變態(tài)反應學術方向的發(fā)展。三、 項目研究內容，研究方案和進度安排（一） 研究內容1、利用DNA測序法測定特應性疾病兒童和正常對照兒童TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14等相關位點及其附近的核苷酸序列。

12、2、利用相關研究法觀察兒童特應性疾病與TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14相關位點多態(tài)性的關系。3、比較不同特應性疾病相關位點核苷酸序列的差異。 4、發(fā)現(xiàn)中國特應性疾病兒童特有的疾病相關多態(tài)位點。（二）研究方案和方法1、病例入選符合下列標準： 1）年齡012歲；2）臨床診斷為哮喘、過敏性鼻炎或特應性皮炎；3）血清總IgE升高；4）皮膚過敏原試驗陽性或血清特異性IgE升高。分別記錄年齡、性別、診斷、發(fā)病時間、家族特應征史。其中哮喘組100例，過敏性鼻炎100例，特應性皮炎50例。選取012歲正常體檢兒童100例為對照組，均不符合上述24項入選標準。 2、血清總IgE和特異性IgE測定

13、采用瑞典法碼西亞公司UniCAP系統(tǒng)，皮膚過敏原皮試采用德國阿羅格公司標準變應原。 3、樣品采集和模板提取：采血2ml，酚氯仿抽取法提取血液白細胞總DNA ，700冰箱凍存。 4、PCR反應：從Genbank下載基因組序列，參考文獻并用Primer3軟件設計引物，按有關方法進行PCR反應。序列比對采用Blast軟件。引物由華大基因上海鼎安生物公司合成。 5、用WizardR PCR Preps DNA純化試劑盒純化PCR產物。6、測序和分析：利用ABI PRISM377平板凝膠測序儀，采用PCR雙脫氧法測序，用有關程序進行核酸序列多態(tài)性分析。測序在杭州華大基因研發(fā)中心進行 。7、統(tǒng)計方法：用2

14、檢驗分析兩組等位基因和基因型頻率以及Hardy-Weinberg吻合度，不同基因型總IgE濃度用方差分析，比較雙側進行。（三）技術路線012歲兒童，收集臨床資料，測定SPT、血TIgE、SIgE ,收集標本特應性疾病組正常對照組特應性皮炎過敏性哮喘組過敏性鼻炎提取白細胞DNAPCR擴增及純化DNA序列測定及分析TLR3TLR2TLR9CD14TLR4統(tǒng)計分析、撰寫論文（四）關鍵技術1、確保樣本的代表性，入選病例必須符合本研究的要求。2、設計多態(tài)位點PCR反應的特異性引物，使PCR反應產物盡可能長一些，以獲取更多的序列信息，提高測序效益。（五）進度安排2006年1月2006年12月 收集樣本、提

15、取DNA、設計引物2007年1月2007年6月 PCR擴增、測序、分析2007年7月2007年12月 資料總結、論文撰寫、成果鑒定四、 項目創(chuàng)新之處 由于地域、種族、國度的不同，不同的人群中基因多態(tài)性的研究會有不同的結果，而目前國內沒有有關Toll樣受體基因多態(tài)性和我國兒童特應性疾病關系的研究，因此本研究對于了解我國兒童ToLL樣受體基因多態(tài)性有十分重要的意義。其創(chuàng)新點在于：（1）首次研究中國兒童ToLL樣受體基因多態(tài)性和兒童特應性疾病的相關性。（2）利用基因測序的方法研究多態(tài)性，可能發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)位點。（3）比較不同特應性疾病基因多態(tài)位點的區(qū)別，可以分析不同疾病的發(fā)病機制。五、 工作基礎與工作

16、條件申請者所在學科是國家首批擁有碩士學位授予單位。1997年被列入浙江省醫(yī)學重點學科建設，2000年經省衛(wèi)生廳驗收合格授牌并被評為優(yōu)秀省醫(yī)學重點學科。學科20多年來致力于小兒呼吸疾病的基礎及臨床研究，成果豐碩，特別在小兒毛細支氣管炎的發(fā)病機理及其與哮喘的關系領域，達到國內領先水平，在國內享有較高聲譽。本學科主攻方向是兒童哮喘和變態(tài)反應性疾病的基礎和臨床研究。學科擁有?？撇》?0余張，病房年住院人次達1000人次以上，年門診病人1.5萬，有足夠的病例保證。項目小組是一個臨床實踐和基礎研究相結合的工作小組，目前正承擔國家和省自然科學基金研究。項目負責人目前正主持廳局級課題2項，項目主要成員曾經參加

17、國家重大課題“人類基因組計劃1項目”和“水稻基因組計劃”，并完成中科院重大課題“騰沖嗜熱厭氧菌全基因組序列分析”，把基因組學和生物信息學兩個學科結合起來，為國家首次獲得了一張原核生物全基因組序列圖譜，填補了我國在此研究領域的空白，該研究成果對我國生命科學研究的發(fā)展具有重要的意義，達到世界先進水平。目前已收集符合本研究標準的病例標本150例，完成TLR4和CD14的引物設計和PCR擴增，確定了DNA提取方法和PCR擴增條件。正在進行TLR2、TLR3、TLR9的序列比對和引物設計。學科有專用實驗室200m2，具備分子生物學實驗條件，擁有PCR擴增儀、紫外分光光度計、生物圖像分析儀、超低溫冰箱、超

18、低溫離心機、特異性變應原測定UniCAP系統(tǒng)等設備?；驕y序由杭州華大基因研發(fā)中心承擔。六、 預期研究結果及其利用研究結果的計劃和今后發(fā)展的思路預期研究結果包括（1）Toll樣受體基因多態(tài)性和兒童特應性疾病的發(fā)生有關。（2）不同特應性疾病可能有不同的多態(tài)位點。（3）研究結果將以論文發(fā)表，在國內核心期刊和國外雜志發(fā)表35篇，并以科研成果爭取省級以上科學技術獎。 將利用研究結果（1） 利用研究成果設計PCR試驗，檢測Toll樣受體多態(tài)位點。（2） 用于臨床兒童特應性疾病的診斷和鑒別診斷。今后發(fā)展思路過度的Th2免疫應答是特應性疾病的主要發(fā)病機理，調控Th1/Th2間的平衡是治療特應性疾病的有效途徑

19、。有學者提出，前生命期處理誘導Th1免疫應答可以減少哮喘的發(fā)生。研究顯示，TLR9在CpG刺激后可抑制Th2免疫應答并促使向Th1轉變。CpG及其誘導產生的IL-10調節(jié)Th1/Th2平衡被認為是特應性疾病的特效治療方案。由于免疫應答向Th1轉變也可增加氣道的炎癥反應，故在早期天然免疫中產生抗炎反應是預防特應性疾病的有效方法。 此外，早期接觸感染原也會通過TLR4、TLR2調節(jié)Th1/Th2平衡從而減少特應性疾病發(fā)生。本研究將提供各類特應性疾病的TLRs基因型，在本研究基礎上將繼續(xù)開展特應性疾病發(fā)病機理和早期干預措施的研究，在特應性疾病中將有廣闊的應用前景。七、 主要參考文獻1、Noguchi

20、 E,Nishimura F,Fukai H,et al.An association study of asthma and total serum immunoglobin E levels for Toll-like receptor polymorphisms in Japanese population.Clin Exp Allergy 2004;34:177-1832、Lazarus R,Klimecki WT,Raby BA,et al.Single-nucleotide polymorphisms in the Toll-like receptor 9gene:frequenc

21、ics,pairwise linkage disequilibrium,and haplotypes in three US ethnic groups and exploratory case-control disease association studies.Genomics 2003;81:85-913、Ahmad-Nejad P.The Toll-like receptor 2 R753Q polymorphism defines a subgroup of patients with atopic dermatitis having severe phenotype.(lette

22、r)J Allergy Clin Immunol 2004;113:565-5664、Eder W,Klimecki W,Yu L,et al.Toll-like receptor 2 as a major gene for asthma in children of European farmers.J Allergy Clin Immunol2004;113:482-4835、ODonnell A R. Toelle B G., Marks G B et al.Age-specific Relationship between CD14 and Atopy in a Cohort Asse

23、ssed from Age 8 to 25 Years. Am J Respir Crit Care Med 2004;169: 6156226、Yang IA,Barton SJ,Rorke S,et al.Toll-like receptor 4 polymorphism and severity of atopy in asthmatics.Gene and Immunity 2004;5:41-457、Raby BA,Klimecki W,Laprise C,et al.Polymorphisms in Toll-like receptor 4 are not associated with asthma or atopy-related phenotypes. Am J Respir Crit Care Med2002;166:1449-14568、Leung TF,Tang NL,Wong GW,et al.CD14 and Toll-like Rec