組蛋白乙?；趩岱冉鋽嗉捌湎嚓P環(huán)境線索記憶中的作用研究

1、組蛋白乙?；趩岱冉鋽嗉捌湎嚓P環(huán)境線索記憶中的作用研究上海醫(yī)學院04基礎醫(yī)學 王雪復旦大學藥理研究中心 馬蘭 教授摘 要：目的：研究組蛋白乙?；欠裼绊懰幬锝鋽嗪铜h(huán)境線索記憶。方法：采用嗎啡慢性給藥、納洛酮急性促戒斷和去乙?；敢种苿┒∷徕c的干預形成的大鼠CPA模型，分為嗎啡生理鹽水生理鹽水組、嗎啡納洛酮生理鹽水組、嗎啡納洛酮丁酸鈉組，觀察記錄戒斷癥狀，并用免疫組化方法觀測大鼠大腦海馬下托區(qū)乙?；℉3K14Ac）水平以及c-fos蛋白的激活情況。結果：與對照組嗎啡生理鹽水生理鹽水組相比，嗎啡納洛酮生理鹽水組表現(xiàn)出明顯的戒斷癥狀，嗎啡納洛酮丁酸鈉組的戒斷癥狀依然存在，但比嗎啡納洛酮生理鹽水組相

2、對較弱。免疫組化染色中，乙?；?H3k14Ac)對照組與嗎啡納洛酮生理鹽水組相近，而嗎啡納洛酮丁酸鈉組明顯上調；c-fos水平嗎啡納洛酮丁酸鈉組最高，嗎啡納洛酮生理鹽水組居中，嗎啡生理鹽水生理鹽水組最低。結論：丁酸鈉可以減弱納洛酮形成的戒斷癥狀；已完成的部分CPA測試結果也提示納洛酮可以減弱CPA和戒斷記憶的形成（結果未給出）。組蛋白乙?；母淖兛赡芤鹆撕ｑR下托區(qū)基因表達的改變，進而影響藥物戒斷和環(huán)境線索記憶的動物行為學。關鍵字：藥物成癮，戒斷，條件性位置厭惡（CPA），表觀遺傳學，組蛋白乙?；疉bstract: Conditioned reinforcement is hypothes

3、ized to be critically involved in drug addiction as a factor contributing to compulsive drug use and relapse. The present study focused on the neurobiology involved in the acquisition and expression of conditioned reinforcing effects of morphine withdrawal employing a conditioned place aversion (CPA

4、) paradigm in chronic-dependent rats. On the other hand, a group of sodium butyrate pretreated mice was aimed at accessing the effect of histone acetylation. The result showed the sodium butyrate group express lighter withdrawal symptoms than the control group, which indicated sodium butyrate could,

5、 weaken the effect of naloxone. The level of c-Fos in the hippocampus following naloxone-precipitated withdrawal (including a sodium butyrate pretreated group) showed that the sodium butyrate group revealed most c-fos positive expression, the saline group revealed the least while the naloxone-only g

6、roup revealed the middle, which indicated there are indeed relationships between histone acetylation and related aversion memory, and the possible mechanism of gene expression effected by histone acetylation. Key words: drug addiction, withdrawl, Conditioned Place Aversion, epigenetic, histone acety

7、lation藥物成癮是一種慢性復發(fā)性腦疾病1 ，濫用者為了追求藥物帶來的愉悅感和欣快感，會不顧后果的尋求和使用藥物2，這種異常行為表現(xiàn)的產生隨著反復用藥而漸進性發(fā)展的。研究發(fā)現(xiàn)，濫用者在停止用藥以后，即使遠離藥物數(shù)月甚至更長的時間，仍會因為某些因素而誘發(fā)其重新濫用藥物。這種行為在臨床上稱為復吸。濫用者長期、反復濫用藥物，會造成一種機體的適應狀態(tài)，只有繼續(xù)使用藥物才能維持正常的生理狀態(tài)，而一旦中斷用藥（或突然減少用量），便會出現(xiàn)一系列生理功能的紊亂，稱之為戒斷。 戒斷是引起復吸的一個重要原因。在藥物促戒斷過程中，給予實驗動物一個特定的環(huán)境，它會將生理不適與當前的環(huán)境線索聯(lián)系在一起，當再次放入相同

8、環(huán)境后，會喚起動物對此環(huán)境厭惡的記憶，稱為戒斷記憶。以上都說明成癮的異常行為涉及到大腦神經系統(tǒng)長期穩(wěn)定的變化，出現(xiàn)了由藥物誘導的行為和神經元突觸可塑性的穩(wěn)定變化。形成神經元可塑性變化的重要原因可能在于精神活性物質可以誘導相關腦區(qū)基因表達的改變。在動物模型上，研究者發(fā)現(xiàn)，在伏隔核，紋狀體，杏仁核等多個成癮相關腦區(qū)都有基因（如：c-fos, BDNF等）的表達發(fā)生了改變。到目前為止的研究發(fā)現(xiàn)，基因表達有兩個重要的調控機制：一是轉錄因子如cAMP 反應元件結合蛋白(CREB)和FosB38，二是表觀遺傳學修飾。表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變3。表觀遺傳學的研究內容包

9、括DNA的甲基化和染色質重塑等。DNA的甲基化是基因組DNA 的一種主要表觀遺傳修飾形式,是調節(jié)基因組功能的重要手段。染色質重塑是指組成核小體的組蛋白可以被多種化學加合物所修飾，如磷酸化、乙?；图谆?，組蛋白的這類結構修飾可使染色質的構型發(fā)生改變，從而影響轉錄因子和轉錄起始復合物和基因轉錄啟動區(qū)的結合，調節(jié)基因轉錄。組蛋白乙酰化是表觀遺傳學修飾的一種重要形式，已知組蛋白的乙酰化可以促進基因轉錄，而反之去乙?；瘎t抑制基因的轉錄。Nestler4等研究結果顯示急性可卡因處理可以誘導大鼠紋狀體c-fos基因啟動子區(qū)組蛋白H4乙?；黾?， 持續(xù)的可卡因刺激可以誘導FosB基因啟動子區(qū)的組蛋白H3乙

10、?；?。組蛋白脫乙酰化酶抑制劑丁酸鈉增強大鼠腦內的乙?；胶?，能增強可卡因的獎賞效應5。這些結果提示成癮性藥物可誘導組蛋白乙酰化，繼而導致某些基因表達的改變。已有研究表明環(huán)境線索記憶能誘導基因表達的改變。在嗎啡的戒斷記憶中，將大鼠放回之前發(fā)生戒斷的環(huán)境中，可誘發(fā)c-fos基因的表達改變。在背景相關的記憶中也發(fā)現(xiàn)，回到以前的環(huán)境后，海馬結構中zif268的表達上調。同時也有研究表明，背景相關的恐懼記憶模型中，抑制海馬組蛋白3的乙酰化能增強大鼠的恐懼記憶。因此，本課題基于鹽酸嗎啡慢性給藥和納洛酮急性促戒斷建成的CPA模型，以c-fos蛋白作為基因表達激活標記物，觀測大鼠海馬下托區(qū)神經元的活動情況，

11、以借此說明組蛋白乙?；趩岱冉鋽嗉跋嚓P環(huán)境線索記憶中的作用機制.1 材料和方法11 藥品與器材鹽酸嗎啡注射液（Morphine Hydrochloride Injection）為沈陽第一制藥廠 生產。 鹽酸納洛酮（Naloxone）為上海中科院提供。 丁酸鈉（Sodium butyrate）為上海國藥集團公司產品。 C-fos rabbit抗體為Santa Cruz公司產品。 Anti-rabbit E為Vector公司產品。羊血清為Sigma公司產品。DAB(C12H14N4·4HCl·2H2O)為生工生物工程（上海）有限公司產品。 PBS、TBS為本實驗室自配。 中性樹

12、膠（Neutral balsam）為國藥集團化學試劑有限公司生產。 電熱恒溫水槽（DK-600型）為上海精宏實驗設備有限公司制造。 CPA模型箱（30×60×30cm）為本實驗室自備。 切片機（Leica Microsystems Nussloch GmbH Olympus）為D-69229 Nussloch。 攝片機規(guī)格為18.2 Color Mosaic。 CPA模型箱（30×60×30cm）1.2 動物分組和慢性嗎啡處理 雄性SD大鼠20只（中國科學院上海動物中心），體重200g左右，隨機分為5組，每組4只。其中包括嗎啡生理鹽水組(Mor + Sa

13、l + Sal)，嗎啡納洛酮組(Mor + Nal + Sal)，嗎啡納洛酮丁酸鈉組(Mor + Nal + NaB)（按丁酸鈉不同劑量100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg分為三組）。實驗前先將大鼠放入箱內適應，每次一只，一次50min，并且在適應后的下一天測基礎值：將大鼠放入測試箱15min并能在兩側自由移動，記錄它在兩側分別停留的時間，看有無基礎偏好。嗎啡為連續(xù)7天遞增腹腔給藥，從10mg/kg到70mg/kg。每天給藥時間為8：00和20：00，遞增量為5mg，即第一天早晨給藥10mg/kg，晚上給藥15mg/kg；第二天早晨給藥20mg/kg，晚上給藥25mg/kg，依

14、此類推。至第七天早晨給藥70mg/kg后分別做如下處理。1.3 納洛酮促戒斷，CPA模型的建立和丁酸鈉對CPA形成的影響 第七天早晨給藥70mg/kg一小時之后，嗎啡納洛酮組腹腔注射1mg/kg納洛酮，嗎啡生理鹽水組注射與上等體積的生理鹽水，嗎啡納洛酮丁酸鈉組分別注射100、200或400mg/kg丁酸納，再分別注射納洛酮1mg/kg，以上各組分別放入箱的大鼠初始偏愛側50min（插好隔板使之不能在兩側自由移動而只能停留在一側）。觀察大鼠的戒斷癥狀，記錄下列行為的次數(shù)：濕狗樣抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳躍、上瞼下垂，并在放入前和放入后分別稱其體重和50min的糞便重，記錄體重丟失量。1.

15、4 大鼠灌流處死及取腦 先后用250ml生理鹽水和250ml4多聚甲醛灌流以處死大鼠，取腦，先用4多聚甲醛后固定6h，再分別用20和30的蔗糖溶液脫水（20蔗糖溶液脫水約需24h，30蔗糖溶液脫水約需48h72h），速凍于-70備用。1.5 切腦片及腦片處理 將腦片從-70冰箱取出，放入切片機左邊的槽中。一般將刀片（切頭）溫度調為-20，切片機箱體溫度調為25。腦片厚度定為30m。切至側腦室等較易觀察的地方時調節(jié)底座方向使兩側對稱。當發(fā)現(xiàn)明顯突起的上丘時可開始保留所切腦片，將玻璃蓋板放下，勻速連續(xù)切腦片710片，用毛筆輕輕挑起放入盛有保護液的小燒杯中，再移至盛有保護液的12孔板中，標記，置于2

16、0冰箱備用。1.6 免疫組化 用ABC染色法觀察c-fos在海馬下托區(qū)被激活的情況從冰箱中取出樣品（每組3張腦片），用PBS洗三次，每次十分鐘（置于搖床上），洗后用濾紙吸水。取anti c-fos Rabbit 0.3l，按1:2000滴度稀釋，放入一抗稀釋液600l（其中含92PBS，5山羊血清，2TritonX-100(濃度10)）中。 將一抗稀釋液分裝在EP管中，每管120l，分別做標記，放入相應腦片，在搖床上shake一小時，放入4冰箱過夜。次日，取出腦片，用PBS洗三次，每次十分鐘（置于搖床上），洗后用濾紙吸水。取l，按1:500滴度稀釋，放入600l稀釋液中，將此稀釋液分裝在EP管

17、中，每管120l，分別做標記，放入相應腦片，在搖床上shake一小時。取出腦片，用PBS洗三次，每次十分鐘（置于搖床上），洗后用濾紙吸水。配置AB液，內含1.2lA、1.2lB和600l稀釋液，EP管分裝，室溫下孵育40min。取出腦片，用PBS洗三次，再用TBS洗一次，每次十分鐘（置于搖床上）。配DAB液，內含12mlTBS、6mgDAB、6l30H2O2，分裝在12孔板中，每孔2ml，將腦片放入。染色約5min用自來水中止顯色，裱片，過夜晾干。第三日，依次將裱好腦片的載玻片浸入75、85、95、100的酒精中脫水，每次10min。再浸入二甲苯中10min，使之透明。待干燥，用中性樹脂加蓋玻

18、片封片。 用ABC染色法觀察海馬下托區(qū)乙酰化（H3Ac(14K)）的情況從冰箱中取出樣品（每組3張腦片），用PBS洗三次，每次十分鐘（置于搖床上），洗后用濾紙吸水。取H3Ac(K14) rabbit 1.2l，按1:500滴度稀釋，放入一抗稀釋液600l（其中含92PBS，5山羊血清，2TritonX-100(濃度10)）中。 將一抗稀釋液分裝在EP管中，每管120l，分別做標記，放入相應腦片，在搖床上shake一小時，放入4冰箱過夜。次日，取出腦片，用PBS洗三次，每次十分鐘（置于搖床上），洗后用濾紙吸水。取l，按1:500滴度稀釋，放入600l稀釋液中，將此稀釋液分裝在EP管中，每管120

19、l，分別做標記，放入相應腦片，在搖床上shake一小時。取出腦片，用PBS洗三次，每次十分鐘（置于搖床上），洗后用濾紙吸水。配置AB液，內含1.2lA、1.2lB和600l稀釋液，EP管分裝，室溫下孵育40min。取出腦片，用PBS洗三次，再用TBS洗一次，每次十分鐘（置于搖床上）。配DAB液，內含12mlTBS、6mgDAB、6l30H2O2，分裝在12孔板中，每孔2ml，將腦片放入。染色約5min用自來水中止顯色，裱片，過夜晾干。第三日，依次將裱好腦片的載玻片浸入75、85、95、100的酒精中脫水，每次10min。再浸入二甲苯中10min，使之透明。待干燥，用中性樹脂加蓋玻片封片。1.7

20、 顯微鏡攝片，統(tǒng)計 用Olympus顯微鏡攝片，用Image-Pro Plus 5.1軟件分析，并用Simga Plot v9.0軟件統(tǒng)計數(shù)目。2 結果2.1 戒斷癥狀納洛酮促戒斷癥狀明顯，大鼠表現(xiàn)出激惹、腹瀉、跳躍、體重減輕等癥狀。與對照組相比，嗎啡納洛酮生理鹽水組和嗎啡納洛酮丁酸納組均比嗎啡生理鹽水生理鹽水組具有更明顯的戒斷癥狀。如表1所示。戒斷癥狀大鼠編號戒斷前體重（g）戒斷后體重（g）體重減輕（g）濕狗樣抖清理皮毛伸展跳躍上瞼下垂MorNS1015000201000330200004023000Mor+NAL511015613431705436813225905221Mor+Nal+1

21、00mg/kg丁酸鈉1009200113570312040041315201Mor+Nal+200mg/kg丁酸鈉140131101523917161751111708104Mor+Nal+400mg/kg丁酸鈉18212171319012515720137682102513表1由圖1所示，其中體重減輕作為最明顯和易于評估的一項指標，經卡方檢驗可發(fā)現(xiàn)，納洛酮處理的大鼠與對照組對比的p<0.05，具有統(tǒng)計學意義，表明納洛酮可以使大鼠產生戒斷癥狀。經丁酸鈉預處理的三組從圖中發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以減弱納洛酮產生的戒斷癥狀，其中丁酸鈉200mg/kg的劑量可使戒斷癥狀減弱程度最?。ū敬螌嶒瀙>0

22、.05，可以增大樣本空間進行下一步實驗繼續(xù)測量）。 Mor+NS NSMor+NALMor+NAL+naBu100Mor+NAL+naBu200Mor+NAL+naBu400圖12.2 免疫組化2.2.1 乙?；旧℉3K14Ac）由圖2所示，嗎啡生理鹽水生理鹽水組和嗎啡納洛酮生理鹽水組的H3K14Ac水平接近，嗎啡納洛酮丁酸鈉組的H3K14Ac水平最高。（其中嗎啡納洛酮丁酸鈉組的丁酸鈉劑量為200mg/kg。）由圖3所示，將上述三組的大鼠腦片經統(tǒng)計學方法檢驗，可從圖中看出，嗎啡生理鹽水生理鹽水組和嗎啡納洛酮生理鹽水組的H3K14Ac水平接近(p>0.05)，不具有統(tǒng)計學差異。而嗎啡納

23、洛酮丁酸鈉比嗎啡生理鹽水組生理鹽水組表達更高(p<0.05)；也比嗎啡納洛酮生理鹽水組表達明顯更高（p<0.05），具有統(tǒng)計學差異。表明去乙?；敢种苿┒∷徕c明顯增強了大鼠大腦海馬下托區(qū)的乙?；℉3K14Ac）水平，即表觀遺傳學修飾發(fā)生了改變。2.2.2 c-fos蛋白染色由圖4所示，嗎啡生理鹽水生理鹽水組的c-fos水平最低，嗎啡納洛酮生理鹽水組的c-fos水平居中，嗎啡納洛酮丁酸鈉組的c-fos水平最高。若要確定丁酸鈉本身對CPA的影響，需在以后的研究中證實。（其中嗎啡納洛酮丁酸鈉組的丁酸鈉劑量為200mg/kg。）由圖5所示，將上述三組的大鼠腦片經統(tǒng)計學方法檢驗，可從圖中看

24、出，嗎啡生理鹽水生理鹽水組的c-fos蛋白表達水平最低，嗎啡納洛酮生理鹽水組的c-fos水平居中，嗎啡納洛酮丁酸鈉組的c-fos水平最高。提示經納洛酮處理的大鼠腦內海馬下托區(qū)的基因表達可能發(fā)生了改變，而經過丁酸鈉預處理的大鼠基因表達可能發(fā)生了更明顯的改變。 圖2 圖3圖4 圖53 討論藥物誘發(fā)的條件性位置厭惡是與測量藥物獎賞和厭惡性質的相關實驗設計。在經慢性嗎啡處理的大鼠形成嗎啡依賴后，用納洛酮急性促戒斷時放入CPA測試箱的一側，可引起大鼠的戒斷癥狀和對該側環(huán)境的厭惡，當厭惡記憶形成后，把它再放入相同的環(huán)境可再次誘發(fā)它的厭惡記憶，使之在該側停留的時間減少，稱之為條件性位置厭惡。本研究中所考察的

25、戒斷反應包括利用條件性位置模型考察戒斷誘發(fā)的CPA 和軀體戒斷癥狀。軀體戒斷癥狀主要記錄了體重減輕、伸展、跳躍、站立、濕狗樣抖等客觀性強、易于觀察的指標。可從結果表格中觀察出對照組和納洛酮組具有不同的戒斷癥狀，其中p值均小于0.05，具有統(tǒng)計學意義，可證明大鼠形成了戒斷癥狀。對于嗎啡+納洛酮+丁酸鈉組，從體重減輕一項結果中可以發(fā)現(xiàn)，去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉可以減弱大鼠的條件性位置厭惡， 200mg/kg的劑量可以使戒斷癥狀減弱程度最小。已經完成的CPA（結果未給出）提示與戒斷癥狀相一致，在此基礎上進一步推測其表觀遺傳學的改變是否有變化。組蛋白乙酰化屬于表觀遺傳學的一種，組蛋白可通過磷酸化、乙酰化

26、和甲基化等結構修飾使染色質的構型發(fā)生改變，從而影響轉錄因子和轉錄起始復合物和基因轉錄啟動區(qū)的結合，調節(jié)基因轉錄。已經知道，組蛋白的乙酰化可以促進基因轉錄，而反之，去乙?；瘎t抑制基因的轉錄7。已有研究表明，可卡因可誘導紋狀體c-fos mRNA表達和組蛋白H3磷酸化乙?；?， 該效應可被HDAC抑制劑所協(xié)同， 說明在紋狀體組蛋白乙?；c基因表達之間具有明顯的正相關。 相似的協(xié)同作用同樣體現(xiàn)在可卡因行為學結果：組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c本身對運動能力沒有影響，但可以顯著增強可卡因對動物運動行為的影響。 以上結果提示，組蛋白乙?；乃胶统砂a過程中誘導的某些基因的表達具有相關性，上調基因的啟動子

27、區(qū)的乙酰化水平確實發(fā)生了改變。用藥物干預組蛋白乙酰化的水平就可以避免藥物誘發(fā)的行為學變化，說明了乙?；脚c基因表達之間確實有內在的聯(lián)系。海馬是大腦重要結構，研究表明海馬下托區(qū)作為海馬的主要輸出通路，在藥物相關的環(huán)境線索誘發(fā)的藥物尋求行為中起著關鍵作用。早期研究表明，在背景相關記憶中，回到以前的環(huán)境后，海馬結構中zif268的表達上調；同時也有研究表明，背景相關的恐懼記憶模型中，抑制海馬組蛋白3的乙?；茉鰪姶笫蟮目謶钟洃?。這表明藥物誘發(fā)的環(huán)境記憶線索與海馬區(qū)基因改變和組蛋白修飾有關。腦內的c-fos基因的表達與學習記憶過程與密切相關。由學習記憶所誘導的c-fos基因表達在腦內廣泛分布，以皮層

28、、海馬和邊緣系統(tǒng)為多，已經知道，依學習記憶訓練模型的不同，其表達時程有所差異；但一般于訓練后立即或30分鐘左右出現(xiàn)，12小時左右達峰值。被動和主動回避訓練、光辨別訓練及味覺厭惡性條件反射訓練等多種學習記憶模型均可誘導腦內c-fos基因的表達。本實驗即是旨在通過監(jiān)測c-fos的表達，來反映干預組蛋白乙酰化對條件性位置厭惡訓練的影響。從免疫組化染色的結果來看，大鼠海馬下托區(qū)c-fos水平：經納洛酮處理的比未經處理的更高，而經丁酸鈉預處理的比另兩者都高，海馬下托區(qū)的c-fos蛋白的表達逐次上升，提示了該區(qū)的基因可能被激活。在乙酰化染色中可見，經過去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉預處理的大鼠海馬下托區(qū)的乙?；?/p>

29、平最高（與另兩組相比p值均小于0.05），而嗎啡+納洛酮與嗎啡+生理鹽水組的差異并不十分明顯。與c-fos染色相對照，丁酸鈉組的陽性率都為最高，提示海馬下托組蛋白乙酰化與該區(qū)基因表達緊密相關，從而影響大鼠對環(huán)境線索的厭惡記憶，這些即提示了組蛋白乙?；诎⑵愃幬锝鋽嗪拖嚓P環(huán)境線索記憶中的可能作用機制。至于丁酸鈉本身對CPA的形成有無作用本實驗并未涉及，將在以后的實驗中進一步研究。另外，已知丁酸鈉可以減弱納洛酮的戒斷癥狀并引起相關腦區(qū)的激活和乙?；淖儯催^來它是否影響CPA測試結果也將在以后的研究中進行。參考文獻1 Koob GF ,Sanna PP ,Bloom FE. Neuroscience of addictionJ . Neuron ,1998 ,21 :4672476.2 Cami J ,Fare M. N Engl J Med ,2003 ,349 :975-86.3 Wolffe AP, et al. Science, 1999, 286 (5439) : 481486.4 Kumar A, et al. Neuron, 2005, 48: 303-314.5 Kmar A, Choi KH, Rent