R1705 Clenbuterol 08-07-0克倫特羅

1、RIDASCREEN ® Clenbuterol Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Clenbuterol und anderen ß-AgonistenEnzyme immunoassay for the quantitative analysis of clenbuterol and other ß-agonistsArt. No.: R1705In vitro TestLagerung bei 2 - 8 °CStorage at 2 - 8 °CR-Biopharm AG

2、, Darmstadt, GermanyTel.: +49 (0 61 51 81 02-0 / Telefax: +49 (0 61 51 81 02-20Anschrift:R-Biopharm AGLandwehrstr. 54D-64293 DarmstadtFür weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung:Telefon:Zentrale / Auftragsannahme: (0 61 51 81 02-0Telefax / E-Mail:Auftragsannahme: (0 61 51 81 02-20M

3、arketing / Vertrieb: (0 61 51 81 02-40RIDA ® und RIDASCREEN®sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert.RIDA ® and RIDASCREEN®are registered trademarks of R-Biopharm AGManufacturer: R-B

4、iopharm AG, Darmstadt, Germany R-Biopharm AG is ISO 9001 certified.KurzinformationRIDASCREEN ® Clenbuterol (Art. Nr.: R1705 ist ein kompetitiver Enzymimmuno-assay zur quantitativen Bestimmung von Clenbuterol und anderen ß-Agonisten inUrin, Leber, Fleisch und Gewebe.Alle Reagenzien für

5、 die Durchführung des Enzymimmunoassays - inkl. Stan-dards - sind im Testkit enthalten.Ein Testkit ist ausreichend für 96 Bestimmungen (einschl. Standardbestim-mungen.Zur Auswertung benötigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer.Probenvorbereitung: Urin:ohne ProbenvorbereitungLeber, Fl

6、eisch, Gewebe: Chromatographische Vorreini-gung mittels RIDA® C18 column (Art. Nr.: R2002Zeitbedarf: Probenvorbereitung (für 10 ProbenUrin (für evtl. Zentrifugation od. Filtration.ca. 10 minLeber, Fleisch, Gewebe.mind. 6 hTestdurchführung (Inkubationszeit,15 Stunden über Nac

7、ht inbegriffen.16,5 hNachweisgrenze: Urin:Clenbuterol.200 ppt Salbutamol.ca. 2 ppbWiederfindungsrate: in künstlich kontaminierten Urinproben. 90 % ± 12 %Spezifität: Die Spezifität des RIDASCREEN® Clenbuterol-Testswurde durch die Bestimmung der Kreuzreaktivität zu denent

8、sprechenden Substanzen ermittelt.Clenbuterol.100 % Brombuterol.ca. 130 %Bromchlorbuterol.ca. 95 %Mabuterol .ca. 86 %Clenproperol.ca. 25 %Terbutalin .ca. 10 %Salbutamol .ca. 10 %Cimaterol .ca. 6 %Carbuterol .ca. 4 %Isoproterenol. < 0,1 %Adrenalin . < 0,01 %Noradrenalin. < 0,01 %1. Verwendung

9、szweckRIDASCREEN ® Clenbuterol ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quanti-tativen Bestimmung von Clenbuterol und anderen ß-Agonisten in Urin, Leber, Fleisch und Gewebe.2. AllgemeinesClenbuterol gehört zur Gruppe der ß-Agonisten. Es ist bekannt, dass ß-Agonisten sich al

10、s Leistungssteigerer im Rahmen der Tierproduktion eignen. Insbesondere kann das Fleisch-/Fettverhältnis von Masttieren verbessert bzw. das Wachstum beschleunigt werden. Derartige Verbindungen sind jedoch nicht als Masthilfsmittel zugelassen.Clenbuterol besitzt neben seiner lipolytischen und ana

11、bolen Wirkung eine relaxierende Wirkung auf die glatte Muskulatur, worauf die therapeutische Anwen-dung als Antiasthmatikum und Tokolytikum beruht. Als Masthilfsmittel wird Clenbuterol, verglichen zur therapeutischen Anwendung, in 5- bis 10-fach höherer Dosierung eingesetzt. Es ist somit nicht

12、auszuschließen, dass Clenbuterol-Rück-stände nach illegaler Praxis zu einer Verbrauchergefährdung führen können. 3. TestprinzipGrundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiter-streifen sind mit Fänger-Antikörpern gegen Anti-C

13、lenbuterol-Antikörper beschich-tet. Zugegeben werden anti-Clenbuterol-Antikörper, die von den immobilisierten Fänger-Antikörpern gebunden werden. Nach einem Inkubations- und Wasch-schritt werden Standards bzw. Probelösung und enzymmarkiertes Clenbuterol (Enzymkonjugat hinzu

14、gegeben. Freies und enzymmarkiertes Clenbuterol kon-kurrieren um die Clenbuterol-Antikörperbindungsstellen (kompetitiver Enzym-immunoassay. Nicht gebundenes, enzymmarkiertes Clenbuterol wird anschlie-ßend in einem Waschschritt wieder entfernt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe von Substrat

15、-/Chromogenlösung. Gebundenes Enzymkonjugat wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um.Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm; die Extinktion der Lösung ist umgekehrt proportional zu der Clenbu

16、terol-Konzentration in der Probe.4. PackungsinhaltMit den Reagenzien einer Packung können 96 Bestimmungen durchgeführt werden (einschließlich Standardbestimmungen. Jeder Testkit enthält:1 x Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten (12 Streifen à 8 Einzelkavitätenbeschicht

17、et mit Antikörpern gegen Anti-Clenbuterol-Antikörper6 x Clenbuterol-Standardlösungen (je 1,3 ml0 ppt (Nullstandard, 100 ppt, 300 ppt, 900 ppt, 2700 ppt, 8100 pptClenbuterol in wässriger Lösunggebrauchsfertig1 x Konjugat (1,2 ml.roter Verschluss Peroxidase-konjugiertes Clenbu

18、terolKonzentrat1 x Anti-Clenbuterol-Antikörper (1,2 ml.schwarzer Verschluss Konzentrat1 x Substrat-/Chromogenlösung (10 ml.brauner Verschluss rötlichgefärbt1 x Stopp-Reagenz (14 ml.gelber Verschluss enthält 1 N Schwefelsäure1 x Puffer (25 ml .weißer Verschluss Konj

19、ugat- und Antikörper-Verdünnungspuffer1 x Waschpuffer (Salzzur Herstellung eines 10 mM Phoshatpuffers, pH 7,4enthält 0,05 % Tween 205. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör5.1. Geräte:M ikrotiterplatten-Photometer (450 nmM ixerS chüttlerZ entr

20、ifuge und Zentrifugenröhrchen (50 mlM esspipettenv ariable 20 µl - 200 µl und 200 - 1000 µl MikropipettenR IDA ® C18 column (Art. Nr.: R20025.2. Reagenzien:M ethanol (MeOHN atronlauge (NaOHn -Heptan50 mM HCl50 mM Kaliumdihydrogenphosphat-(KH2PO 4-Puffer, pH 3,0500 mM Kaliumd

21、ihydrogenphoshat-(KH2PO 4-Puffer, pH 3,050 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,56. VorsichtsmaßnahmenDas Stopp-Reagenz enthält 1 N Schwefelsäure (R36/38, S2-26.7. Reagenzien und ihre LagerungDie Reagenzien bei 2 - 8 °C lagern. Komponenten des Testkits auf keinen Fall einfrieren.Nicht ben

22、46;tigte Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2 - 8 °C lagern.Die Substrat-/Chromogenlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwir-kung vermeiden.Nach Ablauf des Verfallsdatums (siehe Testkit-Außenetike

23、tt unter Expiration kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden.Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennum-mern ist nicht zulässig.8. Anzeichen für Reagenzienverfallb läuliche Färbung der rötlich gefärbten Substrat-/Chrom

24、ogenlösung vor Zugabe in die KavitätenE xtinktion kleiner 0,6 (E450 nm< 0,6 für den Nullstandard9. ProbenvorbereitungDie Proben kühl lagern.Alle hier aufgeführten Aufarbeitungsverfahren sind für einen “Multi-Residue”-Nachweis konzipiert - also nicht spezifisch fü

25、;r Clenbuterol, sondern allgemein für ß-Agonisten.9.1. Urin Screening ohne Probenaufarbeitung20 µl Urin direkt im Test einsetzen (wir empfehlen eine Zentrifugation oder Fil-tration des Urins, falls dieser trüb sein sollte9.2. Fleischproben9.2.1. Leber, Fleisch und Gewebe mit nied

26、rigem Fettgehalt100 - 200 g Probe mit einem Mixer homogenisieren und in eine breiige Masse überführen5 g dieser Probe in ein Zentrifugenröhrchen einwiegen und mit 25 ml 50 mM HCl 20 min durch Schütteln homogenisierenz entrifugieren: 15 min / 4000 g oder höher / 10 - 15 °

27、;C18 ml Überstand (3 g Probe in ein neues Zentrifugenröhrchen überführen, 2 ml 0,5 M NaOH hinzufügen und ca. 10 min mischen10 ml 500 mM KH2PO 4-Puffer, pH 3, hinzufügen, gut mischen und mind. 1,5 h bei 4 °C lagern bzw. über Nacht in den Kühlschrank stelle

28、nz entrifugieren: 15 min / 4000 g oder höher / 10 - 15 °C10 ml Überstand (1 g Probe auf Raumtemperatur (20 - 25 °C bringen und über RIDA® C18 column reinigen (siehe RIDA® C18 column Reinigung9.2.2. Fleisch und Gewebe mit hohem Fettgehalt100 - 200 g Probe mit einem

29、Mixer homogenisieren und in eine breiige Masse überführen5 g dieser Probe mit 25 ml 50 mM Tris-Puffer, pH 8,5 30 min durch Schütteln homogenisieren15 ml n-Heptan hinzufügen und 5 min zur Entfettung schüttelnz entrifugieren: 5 min / 4000 g oder höher / 10 - 15 °Co b

30、ere Heptan-Phase und mittlere Fettschicht mit einer PasteurpipetteabsaugenS chritte 3 - 5 mit nochmals 15 ml n-Heptan wiederholen0,5 ml halbkonzentrierte HCl (5 - 6 M zu dem wässrigen Fleischhomogenat geben und 1 h schütteln (alternativ: über Nacht schütteln6 g Fleischhomogenat (

31、entspricht 1 g Probe in ein Zentrifugenglas einwiegenz entrifugieren: 15 min / 4000 g oder höher / 10 - 15 °CÜberstand in ein anderes Zentrifugenröhrchen überführen, 300 µl 1 M NaOH hinzufügen und 15 min mischen4 ml 500 mM KH2PO 4-Puffer, pH 3 hinzufügen,

32、 gut mischen und mind. 1,5 h bei 4 °C lagern bzw. über Nacht in den Kühlschrank stellenz entrifugieren: 15 min / 4000 g oder höher / 10 - 15 °Cd en gesamten klaren Überstand auf Raumtemperatur (20 - 25 °C bringen und über RIDA® C18 column reinigen (siehe

33、RIDA® C18 column Reinigung®alle Reagenzien und Probenextrakte auf Raumtemperatur (20 - 25 °C bringen Tropfgeschwindigkeit: 1 Tropfen pro sec.S äule mit 3 ml Methanol (100 % waschenS äule mit 2 ml 50 mM KH2PO 4-Puffer, pH 3 waschenP robe auftragen (siehe 9.2.1. bzw. 9.2.2.S &

34、#228;ule mit 2 ml 50 mM KH2PO 4-Puffer, pH 3 waschenR estflüssigkeit aus der Säule durch Druck oder Vakuum entfernen und für 2 min Luft oder Stickstoff durchpressen bzw. durchsaugenP robe langsam mit 1 ml Methanol (100 % eluieren und in einem neuen Gefäß auffangen, (Tropfges

35、chwindigkeit: 15 Tropfen pro min - Flüssigkeitsreste durch Druck oder Vakuum gewinnenE luat im Vakuum oder unter N2-Strom bei 50 - 60 °C vollständig evaporieren d en trockenen Rückstand in 0,4 ml dest. Wasser lösen und 20 µl pro Kavität im Test einsetzenAnmerkung:B

36、ei höher kontaminierten Proben (mehr als 3 ng/g für die weiteren Verdünnungen immer destilliertes Wasser benutzen.Lagerung der Proben und Unterbrechung der Probenaufarbeitung:r ohe Proben tiefgefroren aufbewahrenH Cl gesäuerte Homogenate sind bei 2 - 8 °C bis zu 3 Tagen stab

37、ilE xtrakte in KH2PO 4-Puffer (vor RIDA®C18 column Reinigung sind bei 2 - 8 °C bis zu 2 Tagen stabil (vor weiterem Einsatz zentrifugierenE luate in Methanol (wie nach RIDA®C18 column Reinigung können tiefgefroren einige Wochen oder bei 2 - 8 °C ca. 2 Wochen gelagert werden d

38、 er in Wasser gelöste Rückstand kann bei 2 - 8 °C bis zu 1 Woche aufbewahrt werdenAuf Anfrage sind weitere Applikationen für Milch, Futtermittel, Haare und Rinderauge bei R-Biopharm erhältlich.10. Testdurchführung10.1. TestvorbereitungenAlle Reagenzien vor Gebrauch auf

39、Raumtemperatur (20 - 25 °C bringen.Das Clenbuterol-Enzymkonjugat (Flasche mit rotem Verschluss liegt als Konzentrat vor. Da die rekonstituierte Konjugatlösung nur begrenzte Haltbarkeit aufweist, immer nur soviel Konjugat-Konzentrat mit Puffer verdünnen, wie unmittelbar benötigt w

40、ird. Das Konjugat-Konzentrat vor Entnahme vorsichtig mischen. Um die gebrauchsfertige Konjugatlösung herzustellen, muss das Konzentrat 1:11 (1+10 mit Konjugat-Verdünnungspuffer (siehe 4. verdünnt werden (z.B. 400 µl Konzentrat + 4 ml Puffer, ausreichend für 4 Mikrotiterstrei

41、fen. Die anti-Clenbuterol-Antikörper (Flasche mit schwarzem Verschluss liegen als Konzentrat vor. Da die rekonstituierte Antikörperlösung nur begrenzte Haltbarkeit aufweist, immer nur soviel Antikörper-Konzentrat mit Puffer verdünnen, wie unmittelbar benötigt wird. Das

42、Antikörper-Konzentrat vor Entnahme gut mischen. Um die gebrauchsfertige Antikörperlösung herzustellen, muss das Konzentrat 1:11 (1+10 mit Antikörper-Verdünnungspuffer (siehe 4. verdünnt werden (z.B. 400 µl Konzentrat + 4 ml Puffer, ausreichend für 4 Mikrotiter

43、streifenAls Waschpuffer wird ein PBS-Tween-Puffer benötigt, benutzen Sie dazu bitte das beiliegende Pufferbriefchen (siehe 4. Zur Herstellung des Puffers den gesamten Inhalt des Beutels in 1 l destilliertem Wasser lösen. Der gelöste Wasch-puffer ist bei 4 °C ca. 4 - 6 Wochen halt

44、bar.Alternativ: Inhalt des Beutels in 100 ml dest. Wasser lösen (10fach Konzentrat. Die Lösung ist ca. 8 - 12 Wochen bei Raumtemperatur (20 - 25 °C haltbar. Um die gebrauchsfertige Lösung herzustellen, 1 Teil des 10fach Konzentrats mit 9 Teilen dest. Wasser mischen.10.2. Testdurc

45、hführungSorgfältiges Waschen ist sehr wichtig. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen den Arbeitsschritten vermeiden.1. So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für alle Standards und Proben in Doppelbestimmung benötigt werden. Die Positionen der Standards u

46、nd der Proben protokollieren.2. Je 100 µl verdünnte Antikörperlösung in die entsprechenden Kavitäten pipettieren und 15 h (über Nacht bei 2 - 8 °C inkubieren.3. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssig-keit durch kr&

47、#228;ftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 µl Waschpuffer (siehe 10.1. waschen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen.4. Je 20 µl der Standardlösung bzw. der vorbereiteten Proben als Doppelbe-stimmun

48、g und je 100 µl verdünnte Enzymkonjugat-Lösung in die entsprech-enden Kavitäten pipettieren. Vorsichtig manuell mischen und 1 h bei Raum-temperatur (20 - 25 °C inkubieren.5. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssig-keit durch

49、kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 µl Waschpuffer (siehe 10.1. waschen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen.6. 100 µl Substrat-/Chromogenlösung in die Kavitäten pipettieren. Vorsich

50、tig manuell mischen und 30 min bei Raumtemperatur (20 - 25 °C im Dunkeln inkubieren.7. Je 100 µl Stopp-Reagenz in jede Kavität pipettieren und vorsichtig manuell mischen. Die Extinktion bei 450 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe des Stopp-Reagenzes messen.11. AuswertungFür die A

51、uswertung ist bei R-Biopharm eine speziell für die RIDASCREEN®Enzymimmunoassays entwickelte Software, die RIDA®SOFT Win (Art. Nr. Z9999, erhältlich.Der Verlauf der Standardkurve kann dem beigefügten Analysenzertifikat entnom-men werden.Extinktion Standard (bzw. ProbeExtinkti

52、on NullstandardDen Nullstandard somit gleich 100 % setzen und die Extinktionswerte in Prozent angeben. Die errechneten Werte für die Standards in einem Koordinatensystem auf halblogarithmischem Millimeterpapier gegen die Clenbuterol-Konzentration ng/kg auftragen.Die der Extinktion der jeweilige

53、n Proben entsprechenden Clenbuterol-Äquivalente in ng/kg (ppt aus der Eichkurve ablesen.1 ng/kg Clenbuterol-Äquivalent entspricht 1 ng/kg Clenbuterol, 10 ng/kg Salbuta-mol, 10 ng/kg Terbutalin, 0,7 ng/kg Brombuterol und 1,2 ng/kg Mabuterol.Um die in den Proben enthaltene tatsächliche

54、Clenbuterol-Konzentration in ng/kg (ppt zu erhalten, muss die aus der Eichkurve abgelesene Konzentration noch mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Beim Arbeiten nach der angegebenen Vorschrift gelten folgende Verdünnungsfaktoren:Urin.1 Leber, Fleisch, Gewebe. 0,4i

55、nformieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften Darüber hinaus gehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder Kosten aus der Nutzung der Produkte entstehen nicht.RIDASCREEN ® ClenbuterolBrief informationRIDASCREEN ® Clenbuterol (Art.

56、No.: R1705 is a competitive enzyme immuno-assay for the quantitative analysis of clenbuterol and other ß-agonists in urine,liver, meat and tissue. All reagents required for the enzyme immunoassay -including standards - are contained in the test kit.The test kit is sufficient for 96 determinatio

57、ns (including standards.A microtiter plate spectrophotometer is required for quantification.Sample preparation: urine: without sample preparationLiver, meat, tissue: chromatographic purification withRIDA ® C18 column (Art. No.: R2002Time requirement: sample preparation (for 10 samplesUrine (for centrifugation or filtration.approx. 10 minliver, meat, tissue.at least