pdf下載雞白細(xì)胞介素22基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

1、387論著文章編號:1007-8738(2005 03-0387-03雞白細(xì)胞介素22基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定提金鳳, 郝貴杰, 張艷梅, 邵衛(wèi)星, 彭大新, 劉秀梵3(揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 江蘇揚(yáng)州225009摘要目的:構(gòu)建雞白細(xì)胞介素22(I L 22 真核重組表達(dá)質(zhì)粒, 體外鑒定其能否表達(dá)。方法:將雞I L 22c DNA (RT 2PCR 法獲得 , 克隆入真核高效表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1(+ 中, 構(gòu)建pc DNA 2I L 22重組表達(dá)質(zhì)粒。PCR 和雙酶切的方法鑒定克隆的正確性。然后構(gòu)建pc DNA 2I L 2GFP 重組表達(dá)質(zhì)粒(即GFP 基因與I

2、L 22的一段上游基因融合表達(dá) , PCR 方法鑒定克隆的正確性。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS 21細(xì)胞, 熒光顯微鏡下觀察熒光。結(jié)果:正確構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pc DNA 2I L 22和pc DNA 2I L 2GFP 。熒光顯微鏡下可觀察到很強(qiáng)的綠色熒光。結(jié)論:雞I L 22克隆和表達(dá)成功。為下一步用重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22免疫BALB /c小鼠, 研制雞I L 22單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞白細(xì)胞介素22; 綠色熒光蛋白; 表達(dá); 雞中圖分類號R392. 12文獻(xiàn)標(biāo)識碼B白細(xì)胞介素22(I L 22 是一種多效性的細(xì)胞因子, 具有多種免疫學(xué)功能, 如介導(dǎo)T 細(xì)胞增殖; 誘導(dǎo)CT

3、L 、NK 、LAK 等多種殺傷性細(xì)胞的分化和效應(yīng)功能, 并誘導(dǎo)其產(chǎn)生I F N 2、T NF 2等細(xì)胞因子; 促進(jìn)B 細(xì)胞增殖, 分化和I g 分泌; 活化巨噬細(xì)胞等1。其免疫效應(yīng)為在與靶細(xì)胞上的I L 22受體(I L 22R 結(jié)合后, 可介導(dǎo)某些非增殖依賴性功能, 如促進(jìn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá), 增強(qiáng)CT L 、NK 細(xì)胞、LAK 細(xì)胞的殺傷活性及誘導(dǎo)I F N 2分泌等2。為了有效的鑒定雞重組I L 22的表達(dá)、表達(dá)量及雞體內(nèi)I L 22的一些動態(tài)變化等, 需要制備其單克隆抗體(mAb 。但商品雞I L 22很昂貴, 而且其免疫原性很弱, 用常規(guī)免疫的方法很難制備抗雞I L 22的mAb

4、3。為此我們構(gòu)建并鑒定了雞I L 22真核重組表達(dá)質(zhì)粒, 為下一步用重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫BALB /c小鼠研制針對雞I L 22的基因工程mAb 奠定基礎(chǔ)4。1材料和方法1. 1材料雞I L 22c DNA 為本實(shí)驗(yàn)室邵衛(wèi)星博士惠贈, 其序列與Gen Bank 中的AF017645及陳鴻巖等發(fā)表的序列完全相同5。真核表達(dá)載體pc DNA3. 1(+ 及增強(qiáng)型, 綠色熒光蛋白(EGFP 及C OS 細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。B am H I 、T4連接酶、d NTP 及Taq DNA 聚合酶, 均購自Pomega 公司。Xba I 、收稿日期:2004-07-19; 修回日期:2004-10-29基

5、金項(xiàng)目:江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃自然科學(xué)基金資助(No . BK20012415 作者簡介:提金鳳(1977- , 女, 山東萊州人, 碩士生.Tel:(30514 7979376; Email:xiufanyahoo . comCorres ponding authorX ho I 及Sal I 購自華美公司。瓊脂糖凝膠DNA 純化試劑盒購自寶生物工程(大連 有限公司。所有引物均由寶生物工程(大連 有限公司合成。擴(kuò)增I L 22基因的上游引物:52CCC GCC ATG ATG TGC AAA GT A CTG ATC 23, (劃線處為B am H I 酶切位點(diǎn) , 下游引物:52CCC AAA

6、AAA ATT ATT TTT GC A G AT AT C T CA C 23, (劃線處為Xba I酶切位點(diǎn) ; 擴(kuò)增EGFP 基因的上游引物:52CCC ATG GTG AGC AAG GGC G AG G A 23, (劃線處為Sal I 酶切位點(diǎn) , 下游引物:52CCC T CT AG A GCT TT A CTT GT A CAGCT C GT 23, (劃線處為Xba I 酶切位點(diǎn) 。其中B a m H I 和Xba I與pc DNA3. 1上相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)相吻合Sal I 與雞I L 22基因片段中游的酶切位點(diǎn)相吻合, 上述引物均由寶生物工程(大連 有限公司合成。1. 2方

7、法1. 2. 1雞I L 22基因的PCR 擴(kuò)增以雞I L 22cDNA (RT 2PCR獲得, 為線性DNA 為模板, 利用其特異性上、下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為:94預(yù)變性5m in, 9440s, 5240s, 721m in, 5個循環(huán)后, 再于9440s, 5540s, 721m in, 25個循環(huán); 72延伸10m in, 410m in 。部分PCR 產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳, 進(jìn)行鑒定。1. 2. 2重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22的構(gòu)建6, 7將PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA 純化試劑盒回收純化, 以B am H I 和Xba I 對純化的PCR 產(chǎn)物及質(zhì)

8、粒載體pc DNA3. 1(+ 分別進(jìn)行雙酶切, 再對兩者的酶切產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠DNA 純化試劑盒回收純化。然后按照31的比例(PCR 產(chǎn)物pc DNA 將兩者混合, 加T4連接酶, 于16反應(yīng)8h 。以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5, 在含氨芐青霉素的瓊脂平板上篩選, 挑取陽性克隆擴(kuò)增, 并小量提取質(zhì)粒pcDNA 2I L 22。1. 2. 3重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22的鑒定用擴(kuò)增雞I L 22基因的特異性上下游引物對重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物再進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。B am H I 和X ba I 對重組質(zhì)粒pc DNA 2I

9、L 22雙酶切后, 進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。由TaKaRa 公司對重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22進(jìn)行測序。1. 2. 4重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 2GFP 的構(gòu)建以本實(shí)驗(yàn)室保存的pEGFP 載體(此載體上含有EGFP 基因 為模板, 利用EG 2FP 基因特異性上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 反應(yīng)參數(shù)同方法1. 2. 1(因?yàn)镋GFP 基因與雞I L 22基因大小相差不是很大, 故我們采用了相同的PCR 參數(shù), 結(jié)果顯示可以這樣操作 。取4L PCR 產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定, 其余的388PCR 產(chǎn)物用DNA 回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將回收純化的產(chǎn)物用Sal

10、I 和Xba I 雙酶切后, 再用DNA 回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物。對PCR 和雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22用Xho I , X ba I 進(jìn)行雙酶切(其中Xho I 是I L 22基因片段中部的一個酶切位點(diǎn) , 酶切產(chǎn)物經(jīng)8g/L瓊脂糖凝膠上電泳后, 用DNA 回收試劑盒回收DNA 大片段。將回收到的DNA 大片段與EGFP 基因的PCR 回收產(chǎn)物按13的比例于16進(jìn)行連接反應(yīng)8h 。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5, 在氨芐青霉素的瓊脂板上篩選, 挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒。1. 2. 5重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 2GFP 的鑒定用擴(kuò)增EGFP 基因的特異性上下游

11、引物對重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 2GFP 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng), 反應(yīng)參數(shù)同方法1. 2. 1, PCR 產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。1. 2. 6雞I L 22基因的表達(dá)及鑒定將5104個生長狀態(tài)好的COS 21細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板的1個孔中, 培養(yǎng)1824h, 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。99L 無血清、無抗生素的DME M 與1L 轉(zhuǎn)染試劑在指形管中混勻, 于室溫放置30m in 。將97L 無血清、無抗生素DM E M 與3L 的重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 2GFP (大約0. 5g , 在另1個指形管中混勻。然后將兩個指形管中的內(nèi)容物在試管中混勻, 室溫放置1015m in 。在此

12、期間, 將準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染的COS 21細(xì)胞用無血清、無抗生素的DME M 清洗2遍后, 將試管中的混合物輕輕加入已清洗過的COS 21細(xì)胞中(要逐滴加入 , 邊加邊混勻, 于37培養(yǎng)68h 。棄上清, 換入20g/LDM E M 約300L , 于37培養(yǎng)繼續(xù)48h, 在熒光顯微鏡下觀察。同時用空載體pc DNA3. 1轉(zhuǎn)染COS 21細(xì)胞(方法同上 作為陰性對照。2結(jié)果2. 1雞I L 22基因PCR 產(chǎn)物的鑒定取4L 雞I L 22cDNA的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行12g/L瓊脂糖電泳后, 可觀察到420bp 左右的目的DNA 條帶, 大小與理論值完全吻合(圖1 。2. 2重組質(zhì)粒pcD NA 2I L

13、 22的鑒定挑取氨芐青霉素平板上生長的單個菌落, 擴(kuò)大培養(yǎng), 小量提取重組質(zhì)粒。以重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22為目的DNA, 用雞I L 22特異性上下游引物進(jìn)行PCR 。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示1條423bp 左右的條帶(圖2 。用B am H I 和Xba I 對重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22進(jìn)行雙酶切, 酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示, 重組質(zhì)粒被切開, 呈現(xiàn)兩條帶:1條為插入的目的片段, 大小為423bp, 另1條為切開的載體片段, 大小為5. 4kb 。以上酶切和PCR 的結(jié)果表明:雞I L 22基因片段已成功地克隆入pc DNA3. 1中(圖3

14、 。測序結(jié)果與理論值完全吻合。2. 3重組質(zhì)粒pc D NA 2I L 2GFP 的鑒定挑取氨芐青霉素平板上生長的單個菌落, 擴(kuò)大培養(yǎng)后, 提取質(zhì)粒。然后以提取的質(zhì)粒為目的DNA, 利用GFP 基因的特異性上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示, 只出現(xiàn)1條817bp 左右的條帶(圖4 。圖1雞I L 22基因PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖2pcDNA 2I L 22PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定A:PCR 產(chǎn)物; M1:200bp DNA marker . M2:100bp DNA marker; B:PCR 產(chǎn)物 .圖3重組質(zhì)粒pcDNA 2I L

15、 22的酶切鑒定圖4pcDNA 2I L 2GFP 的PCR 鑒定M1:DNA marker (DL 2000+15000 ; A:PC DNA 2I L 22/B am H I +Xba I . B:PCR 產(chǎn)物; M2:100bp DNA marker .2. 4雞I L 22與GFP 基因在CO S 細(xì)胞中的融合表達(dá)以重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 2GFP 轉(zhuǎn)染C OS 21細(xì)胞, 于37培養(yǎng)68h, 棄上清, 加入20g/LDME M 約300L, 于37繼續(xù)培養(yǎng)48h, 在熒光顯微鏡下可觀察到很亮的綠色熒光, 說明EGFP基因與I L 22基因在COS 21細(xì)胞中表達(dá)成功(圖5 ;

16、 而空載體pc DNA3. 1轉(zhuǎn)染C OS 21細(xì)胞則不產(chǎn)生熒光 。圖5雞I L 22與GFP 基因在COS 21細(xì)胞中的表達(dá)(2003討論自從1983年首次克隆人I L 22基因以來, 至少有7種動物的I L 22被克隆。人I L 22幾乎可以促進(jìn)所有動物淋巴細(xì)胞的增殖, 但研究表明, 人和牛的I L 22均不作用于雞淋巴細(xì)胞, 說明雞I L 22具有嚴(yán)格的宿主特異性。1995年, 李祥瑞用真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了雞I L 22, 并獲得高活性的重組雞I L 22, 這對深入開展雞I L 22的研究, 闡明家禽免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及禽病防治具有重要意義8, 為雞I L 22的應(yīng)用展現(xiàn)了更為廣闊的前景。

17、389目前, I L 22已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于實(shí)踐方面。如:I L 22作為免疫治療劑可以明顯降低一些病毒、細(xì)菌的侵入、感染等,Tellz 等報道, 使用雞Con A 活化T 細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子,2001:137-139.3裴冬生, 孫亞鋒, 傅奕, 等. 人白細(xì)胞介素18的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備J .免疫學(xué)雜志, 2002, 18(1 :48-49.4TadashiM, Hyun S, L illehoj, et al . Pr oducti on and characterizati onof monocl onal antibodies detecting chicken inter

18、leukin 22and the devel 2opment of an antigen cap ture enzy me 2linked i m munos orbent assayJ .Vet I mm unol I mm unopathol , 2001, 80:245-257.可以使雞腸炎沙門氏菌器官入侵率降低51%60%, 此種細(xì)胞因子注入雞胚, 同樣可以明顯降低孵化期雞胚的沙門氏菌器官侵入率。同時, I L 22在構(gòu)建新型基因工程苗和作為免疫佐劑方面也展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。曾經(jīng)有學(xué)者先后報道將小鼠或人I L 22c DNA 與含禽流感血凝素(HA 基因的痘病毒重組, 獲得表達(dá)雞I

19、 L 22的重組病毒, 插入的細(xì)胞因子可以大大提高活病毒載體的安全性95邵衛(wèi)星, 彭大新, 盧建紅, 等. 表達(dá)雞白細(xì)胞介素2重組雞痘病毒的構(gòu)建及其體外表達(dá)產(chǎn)物生物活性的檢測J .生物工程學(xué)報, 2004, 20(1 :136-139.6陳國兵, 竇駿, 陳峻菘, 等. 小鼠白細(xì)胞介素21c DNA 的克隆。本研究中, 我們成功地構(gòu)建了雞I L 22基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pc DNA 2I L 22, 并在COS 21細(xì)胞中獲得表達(dá), 為進(jìn)一步用重組質(zhì)粒pc DNA 2I L 22免疫BALB /C小鼠, 制備抗雞I L 22的mAb 奠定了基礎(chǔ)。及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建J .細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志

20、, 2004, 20(1 :49-51.7孔令洪, 李瑤琛, 王一理, 等. pc DNA3. 1/hI L 218真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)J .細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2003, 19(3 :225-227.參考文獻(xiàn):1余傳霖, 葉天星, 陸德源, 等. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫學(xué)M.上海:上海8李瑞祥, 金紅, 盧景良, 等. 雞白細(xì)胞介素22cDNA 的克隆J .南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 22(2 :81-84.9李瑞祥, 閆慎飛. 動物細(xì)胞因子的應(yīng)用研究進(jìn)展J .畜牧與獸醫(yī)科大學(xué)出版社, 1998:132-133.2金伯泉. 細(xì)胞和分子免疫學(xué)M.第2版. 北京:科學(xué)出版社,醫(yī), 1999,

21、31(5 :36-38.(上接381頁性強(qiáng)的塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)小鼠脾MNC 。第1步黏附棄去貼壁生長的成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞, 并用尼龍毛柱除去大部分B 細(xì)胞。然后在培養(yǎng)體系中, 加入經(jīng)放射處理的異基因的小鼠淋巴細(xì)胞和高濃度的rh I L 22, 共同刺激NK 細(xì)胞活化并增殖。在NK 細(xì)胞增殖純化以獲得高純度的NK 細(xì)胞。另外, 可以從缺乏T 、B 細(xì)胞的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SC I D 小鼠的外周血中直接分離NK 細(xì)胞。盡管本研究建立的方法尚有不足之處, 但基本上仍可滿足對NK 細(xì)胞功能的研究。并貼壁生長的同時, 不斷棄去懸浮的T 、B 細(xì)胞, 即可獲得含NK 細(xì)胞數(shù)較多的第2步黏附細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中的

22、結(jié)果顯示, 用總數(shù)為210的脾MNC 起始培養(yǎng), 在第15天可獲得2. 610個第2步黏附細(xì)胞, 其中CD3NK1. 1細(xì)胞為55. 68%, 活細(xì)胞比例在90%以上, 細(xì)胞的增殖在50倍以上, 對Y AC 21細(xì)胞-+77參考文獻(xiàn):1B rennan J, Mager D, JefferiesW , et al . Exp ressi on of different me m 2bers of the Ly 249gene fam ily defines distinct natural killer cell subsets and cell adhesi on p r opertiesJ .J Exp M ed , 1994, 180(12 :2287-2295.2Gunji Y, Vujanovic NL, H iser odt JC, et al . Generati on and charac 2terizati on of purified adherent ly mphokine 2activated killer cells in m ice J .J I mm unol , 1989, 142(4 :1748-179