STAT3短發(fā)夾RNA表達載體的構(gòu)建及對SiHa細胞增殖和凋亡的作用

1、STAT3短發(fā)夾RNA表達載體的構(gòu)建及對SiHa細胞增殖和凋亡的作用                       作者：吳維光, 于月成, 陳亞瓊, 曹秀琴 【摘要】  目的: 探討信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子3短發(fā)夾RNA（shRNA）真核表達載體對宮頸癌SiHa細胞增殖和凋亡的作用。方法: 根據(jù)siRNA設(shè)計原則, 結(jié)合pSilencer2.1U6neo質(zhì)粒特

2、點, 針對STAT3基因設(shè)計并合成兩條寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1U6neo質(zhì)粒, 脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌SiHa細胞。RTPCR和Western blot檢測SiHa細胞STAT3基因mRNA和蛋白表達水平; MTT法和流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞的增殖和凋亡。結(jié)果: 成功構(gòu)建了STAT3基因shRNA真核表達載體, 轉(zhuǎn)染人宮頸癌SiHa細胞。細胞STAT3蛋白及mRNA表達下降; 同時SiHa細胞增殖能力下降, 細胞凋亡增加。結(jié)論: 構(gòu)建的STAT3基因shRNA真核表達載體能夠通過下調(diào)STAT3基因表達, 抑制宮頸癌SiHa細胞的增殖能力, 誘導細胞凋亡

3、。 【關(guān)鍵詞】  SiHa細胞; STAT3; RNA干擾; 增殖; 凋亡    信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄活化子（signal transducers and activators of transcription,  STATs）是細胞因子和生長因子受體信號的下游效應物, 在細胞核內(nèi)與特異性的DNA啟動子結(jié)合, 調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達1。在哺乳動物7個STAT家族成員中, STAT3是近年來研究異?；钴S的轉(zhuǎn)錄因子。STAT3已被確認為是癌基因2, 在包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中高表達3, 與腫瘤增殖分化、 細胞凋亡、 新血管生成和免疫逃逸密切相關(guān)4

4、。阻斷STAT3信號轉(zhuǎn)導通路可抑制胰腺癌細胞增殖功能5。本研究中利用RNA干擾（RNA interference,  RNAi）技術(shù), 以pSlinlencer2.1U6neo載體中的U6為啟動子, STAT3為靶基因, 構(gòu)建STAT3siRNA表達載體, 轉(zhuǎn)染人宮頸鱗癌SiHa細胞, 抑制STAT3基因表達, 觀察SiHa細胞增殖和凋亡的變化。    1  材料和方法    1.1  材料  人宮頸癌細胞株SiHa細胞購自武漢典型生物保藏中心, 胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司, RPMI

5、1640培養(yǎng)液（Gibco）、 質(zhì)粒pSilencer2.1U6neo（Ambion）、 DH5為清華天為時代公司產(chǎn)品, 質(zhì)粒小提取試劑盒購自北京博克泰克公司, 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒大提取試劑盒購自Qiagen公司, Lipofectimane 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、 FITCannexin V凋亡試劑盒和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司, 各種工具酶購自TaKaRa公司, STAT3單克隆抗體（mAb）購自Santa cruz公司, MTT試劑購自Sigma公司, PCR引物和短發(fā)夾RNA（Short hairpin RNA, shRNA）表達載體插入片段的寡核苷酸鏈由北

6、京奧科生物公司合成, STAT3 shRNA表達載體測序由大連亞法生物技術(shù)公司完成。    1.2  方法    1.2.1  STAT3特異性shRNA轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計及合成  根據(jù)GenBank中STAT3人全長cDNA序列（No.003150）, 相關(guān)選取特異性的序列為干擾作用的靶點6, 加入9 bp的環(huán)結(jié)構(gòu), U6啟動子終止序列, 并引入兩個酶切位點, 以確保退火后可以插入質(zhì)粒pSilencer2.1U6neo中且讀框正確。采用國際通用的與所有基因均無同源性序列的nontarget siRNA作為陰

7、性對照。人工合成一對互補并編碼短發(fā)狀siRNA的寡核苷酸鏈序列如下: STAT3 正義 5GATCCATCCAGAGTCACTGGAAGTTTCAAGAGAAGTTCCAGTGACTCTGGATTTTTT    TGTCGACA3,  反義5AGCTTGTCGACAAAAAAATCCAGAG    TCACTGGAACTTCTCTTGAAAGTTCCAGTGACTCTGGATG3。 陰性對照正義 5GATCCTTCTCCGAACGTCTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGTCGAC

8、A3, 反義5AGCTTGTCGACAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCT    TGAAACGTGACACGTTCGGAGAAG3。    1.2.2  重組質(zhì)粒的構(gòu)建和瞬時轉(zhuǎn)染  將上述的DNA片段退火, 用T4連接酶連接于經(jīng)雙酶切（Hind III,  BamH I）的質(zhì)粒pSilencer2.1U6neo中, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5, 涂于氨芐抗性（終濃度為50 mg/L）的LB培養(yǎng)基上, 次日隨機挑取菌落, 接種于LB培養(yǎng)液中, 振蕩過夜, 堿裂解法快速抽提質(zhì)粒,

9、 紫外分光光度法定量。SiHa細胞在含100 mg/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)液中, 37、 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板, 密度達80%時, 用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)染6 h后更換含200 mg/L FBS培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用500 mg/L的G418篩選3周, 存活的細胞為已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞。細胞分4組: 正常對照組（無干預措施, 簡稱SiHa）; 空載體對照組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒, 簡稱SiHaVEC）; 非特異siRNA對照組（轉(zhuǎn)染pSilencer2.1U6neononspecific 質(zhì)粒, 簡稱SiHa

10、NS）; 目的siRNA實驗組（轉(zhuǎn)染pSilencer2.1U6neoSTAT3質(zhì)粒, 簡稱SiHasiRNA）。    1.2.3  RTPCR檢測STAT3 mRNA表達  TRIzol一步法提取細胞總RNA, 以(oligo) dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以2 L的cDNA為模板進行PCR擴增, GAPDH為內(nèi)參照。STAT3引物序列為: 上游 5CCCATACCTGAAGACAAGTTTATC3, 下游5TGGAAATAATGGTGAAGGTGCTG3, 擴增片段為125 bp。GAPDH引物序列為: 上游5CATCTTCTTT

11、TGCGTCGCCA3, 下游5TCGCCC CACTTGATTTTGG3,  擴增片段為315 bp。PCR反應條件為: 95預變性3 min, 然后95 30 s、 52 45 s、 72 45 s, 35個循環(huán)后再72延伸7 min。擴增產(chǎn)物20 g/L瓊脂糖凝膠電泳, LabWork 3.0 UVP軟件（UVP USA）掃描電泳條帶, 以特異擴增條帶與內(nèi)參條帶光密度之比作半定量分析。    1.2.4  Western blot檢測STAT3蛋白表達  收集細胞, 裂解緩沖液提取細胞總蛋白, 經(jīng)Bradford法定量后進行SD

12、SPAGE電泳, 蛋白量為20 g, 將電泳后分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上, 50 g/L脫脂奶粉封閉, 加1400鼠抗人STAT3 mAb, 4過夜, TBST洗3次, 每次15 min。加11 000辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG, 室溫反應, TBST洗3次, 每次15 min, ECL發(fā)光壓片顯色, 以actin為內(nèi)參照, 用LabWork 3.0 UVP軟件分析條帶的積分光密度值, STAT3蛋白相對量= STAT3蛋白條帶光密度/actin條帶光密度。1           &#

13、160; 1.2.5  MTT法檢測細胞增殖能力  取各組細胞, 調(diào)整細胞密度為5×108/L, 接種于96孔培養(yǎng)板中, 每組細胞設(shè)3個平行孔。細胞貼壁后, 加入無血清培養(yǎng)液12 h, 使細胞同步化。更換含100 mg/L胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液, 37、 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)72 h。每孔加入濃度為5 g/L的四甲基偶氮唑藍（MTT）液20 L, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 棄培養(yǎng)液, 加入150 L的二甲基亞砜（DMSO）, 酶標儀測定各孔490 nm處的吸光度（A值）。細胞增殖率=（實驗組平均A值）/（對照組平均A值）×100%。實驗重復3次。

14、    1.2.6  FCM檢測細胞凋亡率  FCM檢測細胞凋亡操作按凋亡試劑盒說明書進行。收集各組細胞, PBS洗滌1次, 在0.5 mL結(jié)合緩沖液中加入6 L FITCannexin V和20 L的PI, 室溫下避光孵育15 min, 離心棄上清, 加入300 L 結(jié)合緩沖液, FCM檢測凋亡率, 計數(shù)1×104個細胞。實驗重復3次。    1.2.7  統(tǒng)計學分析  數(shù)據(jù)以x±s表示, 數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析, 多組間差異比較采用單因素方差分析, 兩組間比

15、較采用LSD法, P0.05有統(tǒng)計學意義。    2  結(jié)果    2.1  人STAT3基因siRNA重組質(zhì)粒酶切鑒定及測序  將重組質(zhì)粒經(jīng)Hind III和BamH  I雙酶切后, 行瓊脂糖凝膠電泳, 有與插入片段大小相符的條帶, 未酶切的相應重組質(zhì)粒未見插入片段條帶。STAT3基因siRNA雙鏈成功地插入到pSilencer2.1U6neo質(zhì)粒中, 重組質(zhì)粒命名為pSilencer2.1U6neoSTAT3。以pSilencer2.1U6neo特有的測序引物對pSilencer2.1U6n

16、eoSTAT3進行測序, 測序結(jié)果與合成的STAT3 siRNA寡核苷酸序列完全一致。    2.2  RTPCR檢測細胞STAT3 mRNA結(jié)果  細胞STAT3 mRNA檢測表達結(jié)果見表1和圖1。SiHa、 SiHaVEC、 SiHaNS組的STAT3 mRNA水平三組間比較, 差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）, 而SiHasiRNA組STAT3 mRNA水平與三對照組比較明顯降低, 差異均有統(tǒng)計學意義（P0.01）。表1  細胞STAT3表達、 增殖率及凋亡率檢測結(jié)果    2.3 

17、 Weatern blot檢測STAT3蛋白結(jié)果  細胞STAT3蛋白檢測結(jié)果見表1和圖2。SiHa、 SiHaVEC、 SiHaNS組的STAT3蛋白表達三組間比較, 差異無統(tǒng)計學意義, 而SiHasiRNA組STAT3表達水平與三對照組比較明顯降低, 差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）。圖1  細胞STAT3 mRNA PCR檢測圖    2.4  MTT檢測細胞增殖率結(jié)果  各組細胞增殖率檢測結(jié)果見表1。SiHa、 SiHaVEC、 SiHaNS組的增殖率三組間比較, 差異無統(tǒng)計學意義, 而SiHasiRNA組增殖率與三

18、對照組比較明顯降低, 差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）。    2.5  FCM檢測細胞凋亡結(jié)果  各組細胞凋亡率檢測結(jié)果見表1。SiHa組、 SiHaVEC、 SiHaNS組凋亡率三組間比較, 差異無統(tǒng)計學意義, 而SiHasiRNA組凋亡率與三對照組比較明顯增加, 差異均有統(tǒng)計學意義（P0.01）。    3  討論    RNAi現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（doublestranded RNA,  dsRNA）引發(fā)的體內(nèi)序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默

19、過程7。其作用機制是dsRNA被核酸內(nèi)切酶III樣蛋白加工成2125個核苷酸組成的siRNA, siRNA與解旋酶、 核酸酶及一些相關(guān)因子結(jié)合成RNA誘導沉默復合體（RNAinduced silencing complex,  RISC）。RISC在siRNA引導下, 特異地切割與siRNA同源的靶mRNA, 使其降解, 細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型8。由于RNAi對染色體DNA序列的復制和轉(zhuǎn)錄過程不產(chǎn)生影響, 具有高度的序列特異性和抑制基因表達的高效性。所以, 迅速成為一種功能強大的、 選擇性抑制特異基因表達的工具, 也為腫瘤的基因提供了新方法9。目前有體外化學合成、 體外轉(zhuǎn)錄（應

20、用T7啟動子）和應用DNA載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄3種方式生成siRNA, 其中DNA載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄方法是利用U6啟動子, 構(gòu)建siRNA表達載體, 在真核細胞內(nèi)穩(wěn)定表達siRNA, 能長期沉默真核細胞內(nèi)特定基因。本研究構(gòu)建針對STAT3基因的shRNA表達載體, 脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染SiHa細胞。Western blot和RTPCR檢測結(jié)果顯示, STAT3蛋白及mRNA表達均明顯下降。說明STAT3基因的shRNA表達載體成功地抑制了SiHa細胞STAT3基因的表達。    STAT3通過調(diào)控與細胞增殖、 分化、 生存、 凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達, 促進細胞增殖、 惡性轉(zhuǎn)化、

21、 血管生成、 阻礙細胞凋亡, 表現(xiàn)出較強的致癌作用。研究發(fā)現(xiàn), STAT3在宮頸癌等多種腫瘤組織中表達增加或活性增強10。因此, STAT3可能成為宮頸癌基因治療的靶基因。本研究顯示, STAT3基因的shRNA表達載體在抑制SiHa細胞STAT3基因表達的同時, 細胞的增殖能力下降, 凋亡率增加。結(jié)果說明STAT3基因的shRNA表達載體能通過抑制STAT3基因表達而抑制宮頸癌細胞的生長, 誘導細胞凋亡。本研究結(jié)果為以STAT3為靶基因、 以RNAi為方法的宮頸癌基因治療奠定實驗基礎(chǔ)。【】  1 Haura EB, Turkson J, Jove R. Mechanisms of disease: insights into the emerging role of signal transducers and activators of transcrip